羅布麻浸膏中黃酮類成分分析及其在混合型卷煙中的應用

摘要 ［目的］研究羅布麻浸膏中6種黃酮類成分的定量分析方法，考察羅布麻浸膏主要功能成分轉移行為以及對卷煙感官品質的影響和降低自由基的作用。［方法］以 20 mL 70%甲醇-水為溶劑，ACQUITY UPLC HSS C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）為分離柱，槲皮素-D5為內標，采用超聲提取-UPLC-MS/MS方法，測定羅布麻浸膏中6種黃酮類成分含量。通過不同加料比例研究羅布麻浸膏對卷煙感官質量、減害作用的影響以及主要功能成分的轉移行為。［結果］UPLC-MS/MS方法可在10 min內實現6種黃酮類成分的快速分離，標準工作曲線線性關系較好（R2＞0.999 0），方法的LOD和LOQ分別為0.39～0.76和1.29～2.55 ng/mL，加標回收率為93.11％～105.77%，RSD為0.73%～2.89%。添加羅布麻浸膏可以提升卷煙香氣質量，降低煙氣刺激性；主流煙氣中槲皮素轉移率為0.89%～2.93%，氣相自由基清除率最大可達30%。［結論］該方法操作簡便、響應快速、準確度高、重復性好，可適用于羅布麻浸膏中活性成分的快速測定。卷煙加料應用結果表明，羅布麻浸膏可以有效抑制卷煙主流煙氣中自由基的釋放量，合適的施加比例（≤1.0%）可以有效提升混合型卷煙感官品質并保持卷煙風格特征。

關鍵詞 羅布麻浸膏；黃酮類成分；UPLC-MS/MS；混合型卷煙

中圖分類號 TS452+.1 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2025）06-0179-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.06.042

Analysis of Flavonoids in Apocynum venetum Extractum and Its Application in Blended Cigarettes

WANG Li-da，YANG Zhen-min，HUANG Dian et al

（Beijing Research Station of Technical Center，Shanghai Tobacco Group Co.，Ltd.，Beijing 101121）

Abstract ［Objective］To study the quantitative analysis method of six flavonoids in Apocynum venetum extractum，investigate the transfer behavior of the main functional components of A.venetum extractum，and its effects on the sensory quality of cigarettes and the reduction of free radicals.［Method］ Using 20 mL 70% methanol-water as the solvent，ACQUITY UPLC HSS C18 （2.1 mm× 100 mm，1.8 μm） as the separation column，quercetin-D5 as the internal standard，and ultrasonic extraction-UPLC-MS/MS method was used to determine the content of six flavonoids in A.venetum extractum.The effects of different ingredient ratios on the sensory quality and harm reduction of cigarettes，as well as the transfer behavior of the main functional components of A.venetum extractum were studied.［Result］ The UPLC-MS/MS method could achieve rapid separation of six flavonoids within 10 minutes，with a good linear relationship （R2gt;0.999 0） in the standard working curve.The LOD and LOQ of the method were 0.39-0.76 and 1.29-2.55 ng/mL，respectively.The recovery rate was 93.11%-105.77%，and the RSD was 0.73% -2.89%.Adding A.venetum extractum could improve the aroma quality of cigarettes and reduce smoke irritation; the transfer rate of quercetin in mainstream smoke was 0.89% -2.93%，and the maximum gas-phase free radical scavenging rate could reach 30%.［Conclusion］This method is easy to operate，has fast response，high accuracy and good repeatability，and can be applied to the rapid determination of active ingredients in A.venetum extractum.The application results of cigarette additives show that A.venetum extractum can effectively inhibit the release of free radicals in mainstream cigarette smoke.The appropriate application ratio （≤1.0%） can effectively improve the sensory quality of blended cigarettes and maintain the style characteristics of cigarettes.

Key words Apocynum venetum extractum;Flavonoid component;UPLC-MS/MS;Blended cigarettes

羅布麻作為一種重要的藥食兩用多年根宿生草本植物，具有降血壓、抗氧化、消痰止咳、強心利尿的功能［1-3］。羅布麻葉中含有許多酚羥基化合物，對各種羥自由基、氧自由基有很強的還原性，具有良好的體外抗氧化活性［4-7］。羅布麻浸膏作為藥用型特色添加劑已被應用于中式卷煙中［8-9］，其所含黃酮類化合物如金絲桃苷、槲皮素、異槲皮素等不僅具有抗氧化和抗炎活性［10-12］，而且在緩解咳喘等癥狀方面也具有一定療效。具體而言，羅布麻煙對患有咳喘的吸煙者有一定的平喘止咳效果［13］ 。

目前，羅布麻主要成分的檢測方法主要包括薄層色譜法［14］、紅外光譜法［15］、氣相色譜法［16］、液相色譜法［17-18］、液相色譜-質譜法［19］等，而關于煙用羅布麻浸膏的質量檢測方法和卷煙中的應用研究鮮有報道，其品質的好壞直接影響卷煙產品的內在質量。因此，建立科學、全面、快速的煙用羅布麻浸膏主要功能成分定性、定量分析方法，科學評價羅布麻浸膏在卷煙中的應用效果，對于羅布麻浸膏的內在質量判定和卷煙加料工藝、減害研究具有十分重要的意義。該研究擬采用UPLC-MS/MS方法對煙用羅布麻浸膏中6種黃酮類成分進行快速定量分析，并通過加料比例研究羅布麻浸膏對卷煙感官質量、減害作用的影響以及主要功能成分的轉移行為，以期為煙用羅布麻浸膏的質量控制及卷煙產品質量安全提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、甲酸（色譜純，美國Fisher公司）。標準品：白麻苷（99%）、蘆丁（95%）、金絲桃苷（99%）、異槲皮苷（97%）、紫云英苷（99%）均購于上海安譜實驗科技股份有限公司，槲皮素（97%）購于上海麥克林生化科技有限公司，槲皮素-D5（98%）購于上海IsoReag試劑公司。羅布麻浸膏樣品19個（自購）。

超高效液相色譜-質譜聯用儀（WATERS ACQUITY UPLC H-CLass/Xevo TQ-S micro，美國Waters公司）；恒溫振蕩器（HNY-100D，天津市歐諾儀器儀表有限公司）；電子順磁共振波譜儀（EMX6，德國Bruker公司）；D-78224型超聲波清洗儀（德國Elma公司）；電子天平（感量0.01 mg，美國OHAUS公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 混合標準儲備液。首先用70%甲醇-水溶液配制濃度為50 ng/mL的槲皮素-D5內標溶液。然后準確稱取6種標準品（精確至0.1 mg），加入上述內標溶液配制成濃度分別為白麻苷2.06 μg/mL、蘆丁2.03 μg/mL、金絲桃苷1.83 μg/mL、異槲皮苷1.91 μg/mL、紫云英苷1.96 μg/mL、槲皮素 1.75 μg/mL的混合標準儲備液。使用時稀釋至所需質量濃度。

1.2.2 樣品前處理。

準確稱取0.2 g （精確至0.1 mg）羅布麻浸膏于50 mL錐形瓶中，準確加入20 mL 含內標的70%甲醇-水溶液，超聲提取60 min，凈置30 min后，取上清液經0.45 μm 微孔濾膜過濾，濾液用含內標的70%甲醇-水溶液稀釋100倍后進行儀器分析。

1.2.3 色譜及質譜條件。

1.2.3.1 色譜條件。ACQUITY UPLC HSS C18 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫30 ℃；進樣體積2 μL；流動相A為0.3%（V/V，下同）甲酸水溶液，B為乙腈；流速0.4 mL/min。梯度洗脫程序：0～0.5 min，87%～85%A；0.5～6.0 min，85%～85%A;6.0～10.0 min，85%～30%A。

1.2.3.2 質譜條件。離子源為ESI源；負離子電離模式；掃描方式為MRM；毛細管電壓2.6 kV；離子源溫度150 ℃；離子源脫溶劑氣溫度500 ℃，輔助氣流速1 000 L/h。

1.2.4 卷煙樣品制備。

選擇混合型中南海無添加煙絲作為空白樣品煙絲，混合均勻后放入相對濕度為（60±5）%、溫度為（22±2）℃的恒溫恒濕箱中平衡48 h備用。羅布麻浸膏按照香料廚房在線工藝方法處理，按照不同的施加比例（0、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%煙絲重量）施加到煙絲中，然后將煙絲樣品放入恒溫恒濕箱中待用。

將上述制備的樣品煙絲卷制成卷煙，根據重量、吸阻分選煙支，在（60±5）%相對濕度、（22±2）℃的恒溫恒濕箱中平衡48 h后分別進行感官評價、卷煙主流煙氣有害成分和主要功能成分轉移行為分析。

1.2.5 感官評價。

按照行業標準YC/T 138—1998《煙草及煙草制品" 感官評價方法》，組織7名具有資質的人員組成評吸小組對樣品進行感官評價；評吸采用單支打分法，從香氣質、香氣量、濃度、勁頭、雜氣、刺激性和余味7個方面進行評價。

1.2.6 有害成分分析。

按照ISO 4387的方法進行吸煙試驗，參照文獻［20］測定卷煙主流煙氣中的自由基釋放量。

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化 該研究考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液作為流動相對6種黃酮類成分及內標色譜分離效果的影響，結果顯示，乙腈-甲酸水溶液對各組分具有較好的分離效果。在此基礎上比較了不同體積比（0、0.1%、0.2%、0.3%和0.5%）的甲酸水溶液-乙腈流動相體系對黃酮類成分的分離效果，結果表明，甲酸的加入可以使分離效果和峰形得到改善，且隨著甲酸濃度的提高，各組分的保留時間提前。試驗結果表明，0.3%甲酸-水溶液條件下分離效果最好、靈敏度最高，因此選擇0.3%甲酸水溶液-乙腈作為流動相。

優化后的色譜分離效果如圖1所示，分別為混合標準品溶液和羅布麻浸膏樣品提取液的UPLC-MS/MS譜圖。

2.2 質譜條件的優化 在負離子模式下對6種黃酮類成分及內標進行質譜參數優化，結果見表1。

2.3 前處理方法的選擇

2.3.1 提取溶劑的選擇。

該研究考察了純水、不同濃度（50%、60%、70%、80%、90%、100%）甲醇-水溶液作為提取溶劑對目標化合物的提取效果，結果如圖2所示。從圖2可以看出，70%的甲醇-水溶液提取效率最高。

2.3.2 提取時間的選擇。

以70% 甲醇-水溶液為溶劑，在40 kHz 超聲頻率條件下，考察不同提取時間對提取效率的影響。結果表明（圖3），羅布麻浸膏中黃酮類成分提取量隨提取時間延長持續增加，60 min后基本趨于穩定。為了保證黃酮類成分的提取效率達到最高，該試驗選擇提取時間為60 min。

2.3.3 提取溶劑體積的選擇。分別以不同體積（5、10、20、40、80 mL）70%甲醇-水溶液為提取溶劑，在40 kHz超聲頻率條件下提取60 min，結果如圖4所示。從圖4可以看出，羅布麻浸膏中黃酮類成分提取量隨提取溶劑體積的增加略有增大；當提取溶劑體積為20 mL時，黃酮類成分提取量達到最大；當提取溶劑體積大于20 mL時，隨著提取溶劑體積的增加，黃酮類成分提取量并未增大，基本趨于穩定。因此，該試驗所采用的提取溶劑體積為20 mL。

2.4 標準曲線、檢出限和定量限

按照優化后的條件對混合標準溶液進行UPLC-MS/MS分析，以6種黃酮類成分的含量為橫坐標、相對應的峰面積為縱坐標進行線性回歸，繪制標準工作曲線。6種目標成分的線性范圍、線性方程和相關系數見表2。

對最低濃度標準工作溶液連續分析10次，計算標準偏差，以3倍標準偏差和10倍標準偏差分別作為方法檢出限（LOD）和定量限（LOQ），結果發現，該方法的LOD和LOQ分別為0.39～0.76和1.29～2.55 ng/mL，可以滿足實際定量要求。

2.5 方法的精密度和回收率

以組內測定結果的重復性和組間測定結果的重復性來評價方法的精密度。組內測定結果重復性是對同一樣品每天重復進樣5次，連續測定3 d，計算測定值的相對標準偏差（RSD）。組間測定結果重復性是每天測定5組樣品，連續測定3 d，計算測定值的RSD。從表3可以看出，6種目標物組內、組間測定值的RSD均在3%之內，說明該方法精密度較高。

采用標準加入法，從低、中、高3個濃度水平考察方法的回收率，結果如表4所示。從表4可以看出，6種目標物的回收率為93.11%～105.77%，說明該方法測量準確性較好。

2.6 樣品分析

按照上述建立的試驗方法，對不同生產廠家的19個批次羅布麻浸膏樣品進行分析，結果發現（表5），不同批次間羅布麻浸膏的6種黃酮類成分含量存在明顯差異。由于受原材料產地、土壤、種質、提取工藝、儲存、制劑過程等因素的影響，導致羅布麻浸膏品質的差異，從而會直接影響卷煙產品質量穩定性。

2.7 羅布麻浸膏在卷煙中的應用研究

2.7.1 羅布麻浸膏對卷煙感官品質的影響。

采用調整加料比例（0、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%），研究羅布麻浸膏對卷煙感官品質的影響。結果表明，不同加料比例羅布麻浸膏對感官品質的影響不盡相同，低施加量（≤1.0%）羅布麻浸膏明顯提升了煙氣細膩度，增強了卷煙香氣，持續時間長且香氣質不變，與混合型卷煙煙氣協調性較好，能夠明顯降低煙氣刺激性，并且有回甜感，整體效果較好。隨著羅布麻浸膏施加比例的提高，香氣質量提升，刺激性降低，但是香氣風格明顯改變，晾曬煙特征香氣被掩蓋，略有枯焦氣，無法突出混合型卷煙的香氣特征，原因可能是羅布麻浸膏濃度過高，燃燒過程中產生的氣味掩蓋混合型卷煙特征香氣。因此，低施加量（≤1.0%）羅布麻浸膏不僅能保持混合型卷煙風格特征，同時能有效提升混合型卷煙感官品質。

2.7.2 有效成分在卷煙中的轉移率研究。

為了進一步研究施加羅布麻浸膏對卷煙成品性能的影響及有效成分在煙氣中轉移率，對施加不同比例羅布麻浸膏的煙絲卷制成卷煙進行主流煙氣分析。由于不同批次間羅布麻浸膏中有效成分含量差異較大，該研究選取同一批次羅布麻浸膏進行煙絲加料。

從單施加（A）和全配方里料施加（B）不同比例羅布麻浸膏后煙絲中6種黃酮類成分含量（表6）可以看出，煙絲中白麻苷、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素的含量均是隨著施加比例的增加而增加；由于煙絲本身含有蘆丁，且相對含量較大，占比超過有效成分總量的95%，因此羅布麻浸膏的施加并未對煙絲中蘆丁含量產生顯著影響。

該試驗同時測定了不同加料比例羅布麻浸膏對主流煙氣中6種分析物釋放量的影響，選擇無添加煙絲作為空白樣品煙絲。其中，白麻苷、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷這5種黃酮類成分未在煙氣中檢出，而主流煙氣中槲皮素釋放量隨羅布麻浸膏施加比例的增加而增加。羅布麻浸膏主要功能成分轉移行為研究結果表明，主流煙氣中槲皮素的轉移率在0.89%～2.93%，而其他5種成分在主流煙氣中均未檢出，原因可能是其他成分分子量大，由于受卷煙燃燒、裂解以及煙絲、濾棒的吸附過濾作用，轉移率較低。

2.7.3 煙用羅布麻浸膏對主流煙氣自由基清除率的影響。

該試驗將單施加（A）和全配方里料施加（B）不同比例羅布麻浸膏的煙絲卷制成卷煙，并分別進行主流煙氣自由基清除率分析，結果如表7所示。從表7可以看出，施加羅布麻浸膏后，主流煙氣中自由基清除率呈現上升趨勢，且隨著施加比例的增加，自由基清除率持續提高，當施加4.0%的羅布麻浸膏時，烷類和烷氧類等氣相自由基的清除率達到30%左右，降低效果較為明顯，這與中草藥中黃酮類成分能夠起到抗氧化、抗炎、抗病毒等藥理作用的研究結果一致。單施加和全配方里料施加羅布麻浸膏對自由基的清除效率差異不大。

通過方差分析（表8）和多重比較分析（表9）結果表明，羅布麻浸膏施加比例≥1.0%時，與對照組（施加比例為0）有顯著差異（Plt;0.05），且施加比例越高，差異越顯著。結果說明羅布麻浸膏的施加比例≥1.0%時，對卷煙主流煙氣中自由基有較強的清除作用。

3 結論與討論

該研究建立了一種超聲提取-UPLC-MS/MS法同時測定煙用羅布麻浸膏中6種有效成分含量的方法。該方法操作簡便、響應快速、準確度高、重復性好，可適用于羅布麻浸膏中有效成分的快速測定。羅布麻浸膏在混合型卷煙中的應用研究結果表明，羅布麻浸膏主要功能成分在主流煙氣中的轉移率雖然不高（槲皮素轉移率＜3%），但其對卷煙主流煙氣中自由基有較強的清除作用，且施加比例越高，其作用越明顯；合適的施加比例（≤1.0%）能有效提升混合型卷煙感官品質。該研究為進一步研究卷煙產品加料工藝、中草藥添加劑應用效果評價、減害降焦研究提供技術支持。

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基金項目 上海煙草集團有限責任公司科技項目（K2022-2-005P）。

作者簡介 王麗達（1988—），女，河南洛陽人，工程師，博士，從事煙草化學研究。*通信作者，工程師，碩士，從事煙草化學和香精香料研究。

收稿日期 2024-07-19