延胡索總生物堿對糖尿病心肌病大鼠銅死亡的調控作用及機制

關鍵詞延胡索總生物堿；糖尿病心肌病；銅死亡；Sirt/P53信號通路；鐵硫簇

糖尿病心肌病（diabeticcardiomyopathy，DCM）是導致糖尿病患者死亡的主要原因之一，通常伴有各種金屬離子調控功能失調，其中Cu2+代謝紊亂對DCM的發生發展尤其重要[1―2]。最近，Tsvetkov等[3]首次提出了一種與銅依賴相關的、可受調控的新型細胞死亡方式——銅死亡。有研究在此基礎上進一步驗證了DCM中銅死亡的發生機制：DCM發生時，Cu2+在心肌細胞中大量積累，導致心肌細胞線粒體功能障礙加重，最終造成心肌功能障礙[4]。沉默信息調節因子1（silenceinformationregulator1，Sirt1）/腫瘤抑制因子53（tumorprotein53，P53）通路的激活可以促進內源性銅螯合劑谷胱甘肽（glutathione，GSH）的產生，而GSH可以螯合因DCM所產生的過多的Cu2+[5]。由此推測，調控該通路可能是對抗DCM銅死亡的有效策略。

延胡索總生物堿（totalalkaloidsofCorydalisRhizoma，TAC）是一種高純度的延胡索塊莖提取物，有效成分含量高達85%[6]。TAC可以改善心肌梗死后的心功能損傷以及心肌缺血再灌注損傷[7]。相關研究表明，TAC對糖尿病并發癥有一定的治療作用，可以改善糖尿病大鼠神經病理性疼痛[8]；除此之外，還有研究發現，TAC可以激活Sirt1/P53信號通路，減少神經元凋亡[9]。TAC藥理作用研究表明，其有效成分可通過上調GSH生物合成和影響GSH/氧化型GSH比例等機制，促進細胞內GSH含量的增加，從而對細胞功能產生潛在的劑量依賴性影響[10]。但關于TAC能否通過激活Sirt1/P53信號通路，增加GSH的含量，螯合心肌組織中過多游離的Cu2+，抑制DCM大鼠心肌銅死亡的發生并改善心肌組織的損傷，尚未見相關報道。基于此，本研究基于Sirt1/P53信號通路探討了TAC對DCM大鼠心肌細胞銅死亡的調控作用及機制，旨在為TAC的臨床應用提供依據。

1 材料

1.1 主要儀器

YD1508B型組織切片機購自金華市益迪醫療設備廠；Motic3000型顯微攝影成像系統購自美國Motic公司；FR-4A型正置熒光顯微鏡購自上海光學儀器廠；DNM-9602型酶標儀購自北京普朗新技術有限公司；TanonEPS-300型電泳儀、Tanon-4600型凝膠成像系統均購自上海天能科技有限公司；ICEN-24R型臺式高速冷凍離心機購自杭州奧盛儀器有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

TAC（純度85%）由黑龍江中醫藥大學實驗實訓中心提供；蒂姆（Timm）染色試劑由黑龍江中醫藥大學解剖與組胚實驗室提供；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、ECL發光試劑盒（批號分別為MB1227、MAO186-1）均購自大連美侖生物技術有限公司；蘇木素、伊紅（批號分別為20220308、20220608）均購自上海惠世生化試劑有限公司；馬松（Masson）染色試劑盒（批號202410922）購自北京索萊寶科技有限公司；兔源Sirt1、P53、二氫硫辛酸二酰基轉移酶（dihydrolipoamidesuccinyltransferase，DLST）、GAPDH、β-肌動蛋白（β-actin）抗體以及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（批號分別為bs-0921R、bs-2090R、bs-13008R、bs-2188R、bs-0061R、bs-0295G）均購自北京博奧森生物技術有限公司；兔源溶質家族載體7成員11（solutecarrierfamily7membrane11，SLC7A11）抗體（批號4000000753）購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；兔源鐵氧還蛋白1（ferredoxin1，FDX1）、硫辛酸合成酶（lipoicacidsynthetase，LIAS）、線粒體烏頭酸酶2（aconitase2，ACO2）、二氫硫辛酸乙酰基轉移酶（dihydrolipoamideacetyltransferase，DLAT）、熱休克蛋白70（heatshockprotein70，HSP70）抗體（批號分別為FNab03066、FNab04772、FNab00088、FNab02404、FNab04049）均購自武漢菲恩生物科技有限公司；兔源泛醌氧化還原酶核心亞基S8（NADH-ubiquinoneoxidoreductasecoresubunitS8，NDUFS8）抗體（批號#DF9672）購自江蘇親科生物研究中心有限公司；肌酸激酶（creatinekinase，CK）、CK同工酶MB（creatinekinaseisoenzyme，CK-MB）、乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）、Cu2+、GSH測定試劑盒（批號分別為A032-1-1、E006、A020-2-2、E010-1-1、A006-2-1）均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 動物與飼料

本研究所用動物為SPF級SD大鼠，共50只，雄性，體重（180±20）g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（遼）2020-0001。大鼠在溫度為（22±2）℃、相對濕度為45%～60%、12h光照/12黑暗循環的環境中適應性飼養1周，自由攝食、飲水。本實驗經黑龍江中醫藥大學實驗動物管理及福利倫理審查委員會批準，批準編號為2023113021。

高脂高糖飼料購自江蘇省協同醫藥生物有限公司。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

42只大鼠適應性喂養1周后，將正常飼料更換為高脂高糖飼料，繼續喂養16周，誘導肥胖和胰島素抵抗；禁食12h后腹腔注射STZ（35mg/kg）建立2型糖尿病模型，STZ注射1周后，測定大鼠空腹血糖（fastingbloodglucose，FBG），當FBG≥11.1mmol/L時，則表明2型糖尿病模型造模成功[11]；進一步尾靜脈取血檢測大鼠心肌損傷標志物CK、CK-MB、LDH的水平，當其水平高于不造模大鼠2倍時，表明DCM模型造模成功[12]。最終，35只大鼠造模成功，隨機取其中32只分為模型組（Model組）、TAC低劑量組（TAC-L組）、TAC中劑量組（TAC-M組）、TAC高劑量組（TAC-H組），每組8只。另取8只大鼠以正常飼料喂養作為正常對照組（NC組）。依據人與動物體表面積折算等效劑量[13]，并結合本課題組前期研究[9]，TAC-L、TAC-M、TAC-H組大鼠分別灌胃7、10.5、14mg/kgTAC混懸液；NC、Model組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續4周。另外，給藥期間除NC組外，其余各組大鼠仍保持高脂高糖飼料喂養。

2.2 大鼠FBG水平檢測

末次給藥后，檢測各組大鼠FBG水平。

2.3 大鼠血清、心肌組織中CK、CK-MB、LDH水平檢測

給藥前，各組大鼠尾尖取血約0.5mL，離心分離血清備用。末次給藥后，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（3mL/kg）進行麻醉，腹主動脈取血約3mL，離心分離血清備用。隨后處死大鼠，取心臟，觀察心臟情況后，一部分心肌組織置于－80℃冰箱保存，一部分心肌組織置于4%多聚甲醛固定。取各組大鼠給藥前和給藥后血清以及凍存的心肌組織適量，按試劑盒說明書方法檢測其中CK、CK-MB、LDH水平。

2.4 大鼠心肌組織病理學形態、纖維化程度及Cu2+沉積觀察

取各組大鼠于4%多聚甲醛中固定的心肌組織進行常規脫水、透明、石蠟包埋和切片，取切片分別進行蘇木素-伊紅（HE）、Masson、Timm染色，采用顯微鏡觀察大鼠心肌組織病理學形態、纖維化程度以及Cu2+沉積情況（Cu2+富集區會出現棕黑色顆粒狀或點狀沉積）。

2.5 大鼠心肌組織中Cu2+、GSH水平檢測

取各組大鼠凍存的心肌組織適量，按試劑盒說明書方法處理，檢測心肌組織中Cu2+、GSH水平。

2.6 大鼠心肌組織中Sirt1/P53信號通路和鐵硫簇相關蛋白以及HSP70表達水平檢測

取各組大鼠凍存的心肌組織適量，加入裂解液后研磨提取總蛋白，離心；取上清液，測定蛋白濃度后，進行蛋白變性。取變性蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，再于200mA恒流條件下轉膜；以5%脫脂奶粉封閉2h，再加入Sirt1、P53、SLC7A11、FDX1、LIAS、DLAT、DLST、ACO2、NDUFS8、HSP70一抗（稀釋度均為1∶2000）于4°C條件下孵育過夜；次日，加入二抗（稀釋度為1∶5000）于室溫條件下孵育90min。采用ECL顯影，再進行凝膠成像，利用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內參蛋白（GAPDH或β-actin）的灰度值比值表示目的蛋白的表達水平。

2.7 統計學方法

采用SPSS26.0統計分析軟件處理數據。采用Shapiro-Wilk法進行正態性分布檢驗，對于符合正態分布的計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 大鼠FBG水平檢測結果

與NC組[（7.53±1.58）mmol/L]相比，Model組大鼠FBG水平[（17.81±2.16）mmol/L]顯著升高（P＜0.05）。與Model組相比，TAC-L、TAC-M、TAC-H組大鼠FBG水平[（13.88±1.59）、（12.26±0.87）、（11.48±0.97）mmol/L]均顯著降低（P＜0.05）。

3.2 大鼠血清中CK、CK-MB、LDH水平檢測結果

給藥前，與NC組相比，Model組和TAC各劑量組大鼠血清中CK、CK-MB、LDH水平均顯著升高（P＜0.05）。給藥后，與NC組相比，Model組大鼠血清中CK、CK-MB、LDH水平均顯著升高（P＜0.05）；與Model組相比，TAC各劑量組大鼠血清中CK、CK-MB、LDH水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見表1。

3.3 大鼠心肌組織中CK、CK-MB、LDH水平檢測結果

與NC組相比，Model組大鼠心肌組織中CK、CKMB、LDH水平均顯著升高（P＜0.05）；與Model組相比，TAC各劑量大鼠心肌組織中CK、CK-MB、LDH水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見表2。

NC組大鼠心肌組織結構相對致密，細胞排列整齊，細胞間隙較小；與NC組相比，Model組大鼠心肌組織可見明顯病理損傷，心肌組織結構疏松，細胞排列紊亂，局部細胞質明顯深染，細胞核固縮增多，細胞間隙明顯增大，且出現較多炎癥細胞浸潤；與Model組相比，TAC各劑量組大鼠心肌組織病理損傷明顯減輕，組織結構相對致密，細胞排列整齊，細胞間隙減小，僅見少量炎癥細胞浸潤。結果見圖1。

3.5 大鼠心肌組織纖維化程度觀察結果

NC組大鼠心肌組織無纖維化情況；與NC組相比，Model組大鼠心肌組織出現明顯的藍綠色膠原纖維，且染色不均勻；與Model組相比，TAC各劑量組大鼠心肌組織的藍綠色膠原纖維均明顯減少，且染色相對均勻。結果見圖2。

3.6 大鼠心肌組織Cu2+沉積觀察結果

NC組大鼠心肌組織幾乎無Cu2+沉積；與NC組相比，Model組大鼠心肌組織Cu2+沉積增多；與Model組相比，TAC各劑量組大鼠心肌組織Cu2+沉積均減少。結果見圖3。

3.7 大鼠心肌組織中Cu2+、GSH水平檢測結果

與NC組相比，Model組大鼠心肌組織中Cu2+水平顯著升高（P＜0.05），GSH水平顯著降低（P＜0.05）；與Model組相比，TAC各劑量組大鼠心肌組織中Cu2+水平均顯著降低（P＜0.05），GSH水平（TAC-L、TAC-M組除外）顯著升高（P＜0.05）。結果見表3。

3.8 大鼠心肌組織中Sirt1/P53信號通路和鐵硫簇相關蛋白以及HSP70表達水平檢測結果

與NC組相比，Model組大鼠心肌組織中Sirt1、SLC7A11、FDX1、LIAS、DLAT、DLST、ACO2、NDUFS8蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05），P53、HSP70蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與Model組相比，TAC各劑量組大鼠心肌組織中上述蛋白表達水平均顯著逆轉（P＜0.05）。結果見圖4、表4。

4 討論

DCM是1型和2型糖尿病的主要并發癥之一[14]，其傳統的治療方式多為降糖藥配合治療心臟方面疾病藥物使用，缺乏有效且針對性強的藥物。TAC是一種中藥提取物，具有降糖和抗心肌缺血再灌注損傷的作用[7]。本研究結果發現，TAC可減輕DCM大鼠心肌組織病理損傷，降低心肌組織中CK、CK-MB、LDH水平，這表明TAC對DCM大鼠有一定的改善作用。目前，DCM的發病機制尚不明確，研究表明，DCM進程中銅轉運蛋白功能異常，導致心肌細胞內Cu2+濃度異常升高，最終造成心肌細胞死亡[4]，這表明Cu2+穩態失衡可能是DCM的重要驅動因素。此次研究中，Model組大鼠心肌組織中Cu2+水平顯著高于NC組，這與之前的研究結果一致[4]。

Cu2+在線粒體呼吸、抗氧化防御和生物合成等重要過程中發揮著關鍵作用[15]。在銅死亡過程中，過量的Cu2+會直接和參與有氧呼吸三羧酸循環中的硫辛酰化蛋白DLAT和DLST結合，導致這些蛋白發生寡聚化，進而阻礙三羧酸循環的正常進行；同時，鐵硫簇相關蛋白降解可進一步影響氧化磷酸化和三羧酸循環速率，最終抑制線粒體能量的生成，引發蛋白毒性應激和細胞死亡[3]。在應激情況下，HSP70會大量表達，響應外在刺激，維持細胞穩態[16]。關于DCM的最新研究發現，當DCM中銅死亡發生時，鐵硫簇相關蛋白FDX1、LIAS、ACO2、NDUFS8的表達水平降低[4]。本研究結果發現，相較于NC組，Model組大鼠心肌組織中鐵硫簇相關蛋白的表達水平均顯著降低，HSP70表達水平顯著升高，這表明Model組大鼠的線粒體代謝出現異常并且發生了蛋白質的毒性應激。

P53可以促進不同類型的細胞程序性死亡，其調控細胞凋亡的作用與Cu2+穩態存在一定的關系[17]：生理濃度的Cu2+可抑制P53表達，而高濃度的Cu2+可激活P53并誘導細胞凋亡[18]。激活的P53可抑制SLC7A11基因的轉錄，從而減少胱氨酸的攝取，導致GSH合成受阻[5，19]。GSH是一種重要的內源性銅螯合劑，其水平降低會使細胞無法有效地螯合游離的Cu2+，進一步導致Cu2+濃度增加并誘導銅死亡[20]。Sirt1是NAD+依賴性的蛋白去乙酰化酶，促進其表達可改善糖尿病大鼠的心臟功能[21]。Sirt1可以調節P53在K328位點的乙酰化[22]，促進P53的降解，降低心肌細胞的死亡率[23]。本研究結果發現，經TAC干預后，大鼠心肌組織中Sirt1以及鐵硫簇相關蛋白的表達水平均升高，P53、HSP70蛋白的表達水平均降低，GSH水平升高。這提示，TAC可激活Sirt1/P53信號通路活性，促進GSH與Cu2+的螯合作用，從而減少線粒體代謝障礙與蛋白質毒性應激，最終改善銅死亡相關心肌損傷。

綜上所述，TAC可改善大鼠DCM，其作用機制可能與激活Sirt1/P53信號通路活性，促進GSH與Cu2+的螯合作用，抑制心肌細胞銅死亡有關。