吳門枳殼甘草湯調控HIF-1α/VEGF/Ang信號軸抑制退變椎間盤病理性血管新生的機制研究

關鍵詞枳殼甘草湯；椎間盤退變；病理性血管新生；HIF-1α/VEGF/Ang信號軸；髓核細胞退變；炎癥因子

椎間盤退變（intervertebraldiscdegeneration，IDD）是指受年齡增長、肥胖、負重等不良因素影響，髓核組織水分減少，椎間盤失去彈性和張力，纖維環結構破壞、髓核組織結構發生異常改變[1]。IDD是纖維環撕裂、脊柱不穩、小關節退變、椎間盤突出、椎管狹窄和慢性腰痛等脊柱疾病的基礎，延緩IDD具有重要臨床意義[1]。正常成年人的椎間盤僅外層的纖維環長有小毛細血管，而在IDD過程中，血管由纖維環外層沿著裂隙向終板和纖維環內層長入，為免疫細胞提供了遷移通道；此外，巨噬細胞等免疫細胞通過新生的血管浸潤到退變椎間盤之后，通過釋放腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）等促炎因子，啟動下游免疫炎癥反應，形成炎癥微環境，加速疾病進程[2]。因此，病理性血管新生被認為是IDD的重要標志之一。研究發現，由缺氧誘導因子1α（hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α）、血管內皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）、血管緊張素（angiotensin，Ang）構成的信號軸在血管生成過程中起著重要作用[3]。

枳殼甘草湯是蘇州市中醫醫院骨傷科治療腰椎退變疾病的常用經驗方，該方由全國名老中醫藥專家龔正豐教授創立，具有逐瘀利水、通絡止痛的功效。臨床研究顯示，該方單獨使用或與腰椎牽引、椎間孔鏡等療法聯用，均可有效緩解腰椎間盤突出及腰椎退變患者的疼痛癥狀、改善腰椎功能[4―5]。前期研究顯示，枳殼甘草湯可有效減少IDD模型大鼠椎間盤巨噬細胞浸潤，抑制IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子及單核細胞趨化蛋白1表達，延緩IDD進程[6―7]。本研究在前期研究基礎上，基于病理性血管新生與巨噬細胞浸潤的聯系，通過觀察枳殼甘草湯對退變椎間盤病理性血管新生及HIF-1α/VEGF/Ang信號軸的影響，進一步探討枳殼甘草湯治療IDD的效應機制。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器包括ELx800型光吸收酶標儀（美國Bio-Tek公司）、Tanon5200型化學發光成像系統（上海天能科技有限公司）、HeraeusFresco17型離心機（美國ThermoFisherScientific公司）、BSA124S-CW型電子天平（德國Sartorius公司）、DMI3000B型熒光顯微鏡（德國Leica公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

枳殼、黑丑、白丑飲片（批號分別為230307010、220906006、211227006，蘇州天靈中藥飲片有限公司）以及當歸、三棱、莪術、甘草飲片（批號分別為230411、221021、221025、230207，蘇州春暉堂有限公司）和丹參飲片（批號20230203-C5，貴州同德藥業股份有限公司）均由蘇州市中醫醫院藥劑科采購并鑒定為真品。

HIF-1α抑制劑Lificiguat（YC-1，批號S7958，純度99.94%）購自美國Selleck公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號分別為C0105S、P0010）均購自上海碧云天生物技術有限公司；IL-1β、IL-6、TNF-α酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號分別為LA167616H、LA160102H、LA166601H）均購自南京拉普達生物科技有限公司；兔源CD31、基質金屬蛋白酶3（matrixmetalloproteinase-3，MMP-3）、Ⅱ型膠原蛋白（CollagenⅡ）、HIF-1α、MMP-2、MMP-9、Ang1、Ang2、VEGF、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體以及辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗、AlexaFluor488標記的羊抗兔二抗、AlexaFluor594標記的羊抗兔二抗（批號分別為11265-1-AP、17873-1-AP、28459-1-AP、20960-1-AP、10373-2-AP、27306-1-AP、27093-1-AP、24613-1-AP、SA00001-2、19003-1-AP、81640-5-RR、SA00013-2、SA00013-4）均購自武漢三鷹生物技術有限公司；兔源血管內皮生長因子受體2（vascularendothelialgrowthfactorreceptor2，VEGFR2）多克隆抗體（批號AF6281）購自美國Affinity公司。

1.3 動物與細胞

本研究所用動物為健康清潔級雄性SD大鼠，共74只（68只大鼠的體重為220～250g，用于動物實驗及含藥血清制備；6只大鼠的體重為140～160g，用于髓核細胞原代提取），所有大鼠均購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號為SCXK（京）2021-0011。飼養條件：規律進食，自由飲水，室溫（25±2）℃，相對濕度40%～70%，光暗周期（12h/12h）。所有動物實驗均獲得蘇州市中醫醫院醫學倫理委員會批準同意（批號為2021倫動批051）。

人臍靜脈內皮細胞（HUVEC；產品編號：DFSC-EC-01）購于上海中喬新舟生物科技有限公司。

2 方法

2.1 藥物制備

枳殼甘草湯由枳殼10g、當歸10g、丹參10g、三棱10g、莪術10g、黑丑6g、白丑6g和甘草6g組成。全方加入500mL冷水浸泡30min，煮沸后文火煎至200mL；藥渣加入300mL水，再次煎至200mL；將2次藥液混合后，用旋轉蒸發儀將其濃縮成質量濃度為1g/mL（以生藥量計，下同）的藥液[7]。精確稱取3mgYC-1，加入197.14μL二甲基亞砜配制成濃度為50mmol/L的YC-1溶液。

2.2 動物實驗

2.2.1 動物造模、分組與給藥

將48只大鼠隨機分為假手術組（8只）和造模組（40只）。造模組大鼠參考文獻[8]方法構建IDD模型：大鼠以3%戊巴比妥鈉（1mL/kg）腹腔注射麻醉后，用乙醇對尾部Co6/7/8節段進行消毒，用29G針頭避開動靜脈穿刺尾椎間盤，向椎間盤中心穿刺5mm，刺入后針頭旋轉360°并留置10s，消毒并標記穿刺位置，并以輸液貼保護。假手術組大鼠采用21G針頭在相同節段穿刺皮膚和肌肉（深度約為2mm），不損傷椎間盤。造模后大鼠自由活動，1周后，若大鼠尾椎X線檢查顯示椎間盤高度下降，則證明造模成功[9]。將造模成功的40只大鼠隨機分為模型組、HIF-1α抑制劑組和枳殼甘草湯低、中、高劑量組，每組8只。HIF-1α抑制劑組大鼠尾靜脈注射YC-1溶液[2mg/（kg·d）][10]；枳殼甘草湯低、中、高劑量組大鼠分別灌胃3.06、6.12、12.24g/（kg·d）枳殼甘草湯[7]，分別為臨床等效劑量的0.5、1、2倍；假手術組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水。各組大鼠的灌胃體積均為12.24mL/kg，每天給藥1次，連續3周。

2.2.2 樣本采集

末次給藥1h后，使用3%戊巴比妥鈉麻醉并處死大鼠，然后快速離斷大鼠Co5-9節段尾椎，一部分置于4%多聚甲醛中固定，用于病理染色；一部分在冰上分離提取Co6/7/8椎間盤組織，并置于－80℃低溫冰箱中保存，用于相關指標檢測（每組隨機選擇6只大鼠，進行各指標檢測）。

2.2.3 椎間盤組織中炎癥因子水平檢測

稱取“2.2.2”項下凍存的椎間盤組織100mg，加入100μL磷酸鹽緩沖液（PBS），置于冷凍研磨儀中研磨后，離心，吸取上清液。按ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

2.2.4 椎間盤組織病理變化觀察

取“2.2.2”項下4%多聚甲醛固定后的椎間盤組織，常規進行脫鈣、梯度脫水、石蠟包埋后，制成5μm切片。取部分切片行常規HE染色，顯微鏡下觀察椎間盤組織病理改變情況并拍照。

2.2.5 椎間盤組織病理性血管生成檢測

取“2.2.4”項下各組大鼠部分椎間盤組織切片，梯度復水后，進行抗原修復、5%脫脂奶粉室溫孵育封閉；加入血管生成標志物CD31一抗（稀釋比例1∶200），室溫孵育2h；加入AlexaFluor594標記的羊抗兔二抗（稀釋比例1∶1000），室溫孵育2h；常規DAPI復染、封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照，陽性表達呈紅色熒光。使用ImageJ軟件統計陽性表達面積比（陽性表達面積比＝陽性表達面積/總面積×100%）。

2.2.6 椎間盤組織中血管生成相關蛋白表達檢測

采用Westernblot法檢測。稱取“2.2.2”項下凍存的椎間盤組織100mg，加入200μLRIPA裂解液，置于冷凍研磨儀中研磨后，以12000r/min離心20min，吸取上清液，采用BCA法測定總蛋白濃度，加入loadingbuffer后加熱使蛋白變性。取變性蛋白上樣后，以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（電壓150V，電泳時間50min）分離，將印跡轉移（電流400mA，轉膜時間35min）至PVDF膜，以5%脫脂奶粉封閉1h；加入GAPDH、HIF-1α、VEGF、VEGFR2、Ang1、Ang2一抗（稀釋比例分別為1∶5000、1∶2000、1∶2000、1∶1000、1∶1000、1∶1000），在4℃下孵育過夜；次日洗膜后加入對應HRP標記的羊抗兔二抗（稀釋比例1∶10000），在室溫下孵育1h。利用化學發光成像系統進行顯影，使用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內參（GAPDH）蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。

2.3 細胞實驗

2.3.1 枳殼甘草湯含藥血清制備

取SD大鼠20只，隨機分為空白對照血清組和枳殼甘草湯含藥血清組，各10只。枳殼甘草湯含藥血清組按臨床等效劑量灌胃6.12g/（kg·d）枳殼甘草湯，空白對照血清組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續7d。末次灌胃1h后，以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈采血，離心分離血清，56℃恒溫水浴滅活30min，微孔濾膜過濾除菌，分別得到空白對照血清和含藥血清，－80℃保存備用。

2.3.2 大鼠原代髓核細胞提取與培養

取6只SD大鼠（體重140～160g），以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后脫頸處死，乙醇浸泡消毒2min。切下尾部后剝離尾部皮膚，浸泡于乙醇中，轉移至超凈臺。在超凈臺中切開大鼠椎間盤，以刮匙取出髓核，剪成大小約1mm3的碎塊，用0.2%的Ⅱ型膠原酶37℃消化2h，細胞篩網過濾組織殘渣，離心后棄上清。用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM/F12細胞培養基重懸細胞，然后置于培養箱中常規培養。

2.3.3 髓核細胞分組干預后與HUVEC共培養

將第2代髓核細胞按5×105個/孔接種于6孔板中，隨機分成空白對照組、TNF-α組、YC-1組和5%、10%、15%含藥血清組。除空白對照組外，其余各組均采用50ng/mLTNF-α誘導髓核細胞退變模型[11]；同時，空白對照組、TNF-α組加入10%空白對照血清；YC-1組加入10%空白對照血清+0.2mmol/LYC-1；5%、10%、15%含藥血清組分別加入5%、10%、15%含藥血清[7]）。干預24h后，與提前接種于Transwell小室上室中的HUVEC（2×104個/孔）在37℃培養箱中共培養24h。

2.3.4 共培養后髓核細胞中CollagenⅡ和MMP-3蛋白表達檢測

按“2.3.3”項下分組操作，每組設置6個復孔。完成共培養后的髓核細胞加入4%多聚甲醛固定20min，加入50μL1%破膜劑破膜20min，再加入5%牛血清白蛋白室溫孵育30min；加入CollagenⅡ和MMP-3一抗（稀釋比例均為1∶200），4℃孵育過夜；次日加入AlexaFluor488標記的羊抗兔二抗和AlexaFluor594標記的羊抗兔二抗（稀釋比例均為1∶1000），室溫孵育30min；滴加含DAPI的抗熒光淬滅封片劑，置于熒光顯微鏡下拍照。使用ImageJ軟件計算蛋白陽性表達面積比，CollagenⅡ蛋白陽性表達呈綠色，MMP-3蛋白陽性表達呈紅色。陽性表達面積比＝陽性表達面積/總面積×100%。

2.3.5 共培養后HUVEC增殖活性檢測

將HUVEC均勻接種于96孔板中（5×103個/孔），每組設置6個復孔，并設置空白孔。常規培養24h后，加入按“2.3.3”項下分組干預后的髓核細胞上清液繼續培養24h，采用CCK-8法經酶標儀在450nm波長處檢測各孔吸光度，并計算細胞增殖率。細胞增殖率（%）＝（實驗組吸光度－空白孔吸光度）/（空白對照組吸光度－空白孔吸光度）×100%。

2.3.6 共培養后HUVEC遷移能力檢測

按“2.3.3”項下分組操作，每組設置6個復孔。完成共培養后取出Transwell小室，用PBS沖洗3次后用4%多聚甲醛固定20min；PBS沖洗2次，用0.1%結晶紫染液染色20min，再次用PBS沖洗掉多余的染料；用棉簽輕輕擦拭掉上室膜上未穿透的細胞，將小室膜取下，放在載玻片上，用中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察并計數下室膜上的細胞數量，每組隨機選取6個視野進行計數。

2.3.7 共培養后HUVEC成管能力檢測

將DMEM/F12培養基和預冷的Matrigel基質膠按體積比2∶1混合后配制實驗用膠，并按300μL/孔加入24孔板中，置于培養箱中固化。按“2.3.3”項下分組操作，每組設置6個復孔，完成共培養后收集HUVEC。采用無血清培養基進行重懸，向鋪好基質膠的24孔板中加入細胞懸液（2×104個/孔），37℃培養箱中培養4h后，觀察血管形成情況，并拍照。采用ImageJ軟件分析成管情況，統計血管分支數量、總長度、總分支長度。

2.3.8 共培養后HUVEC中HIF-1α、VEGF、Ang2mRNA的表達檢測

按“2.3.3”項下分組操作，每組設置6個復孔。完成共培養后收集HUVEC，提取細胞中總RNA，測定RNA濃度及純度。合成cDNA后進行擴增實驗，PCR反應體系（20μL）為：PCR試劑10μL，正、反向引物各0.4μL，cDNA模板2μL，ddH2O7.2μL。擴增條件為：95℃預變性30s；95℃變性10s，60℃延伸/退火30s，循環40次。以GAPDH為內參，采用2－ΔΔCt法計算細胞中HIF-1α、VEGF、Ang2mRNA表達情況。引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司設計并合成，引物序列及擴增產物大小見表1。

2.3.9 共培養后HUVEC中HIF-1α/VEGF/Ang信號軸及血管生成相關蛋白表達檢測

按“2.3.3”項下分組操作，每組設置6個復孔。完成共培養后收集HUVEC，采用Westernblot法檢測細胞中相關蛋白表達情況，具體方法同“2.2.6”項下。其中，MMP-2、MMP-9一抗的稀釋比例均為1∶1000，對應HRP標記的羊抗兔二抗的稀釋比例為1∶10000。

2.4 統計學方法

采用SPSS21.0軟件進行數據統計分析。符合正態分布的計量資料用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 動物實驗結果

3.1.1 大鼠椎間盤組織中炎癥因子水平檢測結果

與假手術組比較，模型組大鼠椎間盤組織中IL-1β、TNF-α、IL-6水平均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，各藥物組大鼠椎間盤組織中上述炎癥因子水平均顯著降低（P＜0.05）。與HIF-1α抑制劑組比較，枳殼甘草湯高劑量組大鼠椎間盤組織中TNF-α水平進一步降低（P＜0.05），IL-1β、IL-6水平差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表2。

3.1.2 大鼠椎間盤組織病理改變觀察結果

模型組大鼠髓核大量丟失，纖維環局部撕裂、排列紊亂；枳殼甘草湯低劑量組大鼠椎間盤組織中髓核皺縮超過1/3、結構紊亂，纖維環結構排列紊亂；各藥物組大鼠椎間盤組織中髓核部分皺縮、結構尚完整，與纖維環界限清晰，纖維環結構和排列尚完整。結果見圖1（全部圖片可掃描本文首頁二維碼，進入“增強出版”頁面查看附圖1）。

3.1.3 大鼠椎間盤組織病理性血管新生情況觀察結果

與假手術組[（0.29±0.12）%]比較，模型組大鼠椎間盤組織中CD31陽性表達[（5.25±0.40）%]顯著增多（P＜0.05）。與模型組比較，HIF-1α抑制劑組[（1.49±0.18）%]和枳殼甘草湯低、中、高劑量組大鼠椎間盤組織中CD31陽性表達[分別為（3.66±0.21）%、（2.28±0.18）%、（1.73±0.09）%]均顯著減少（P＜0.05）。結果見圖2（全部圖片可掃描本文首頁二維碼，進入“增強出版”頁面查看附圖2）。

3.1.4 大鼠椎間盤組織中血管生成相關蛋白表達檢測結果

與假手術組比較，模型組大鼠椎間盤組織中HIF-1α、VEGF、VEGFR2、Ang1、Ang2蛋白表達均顯著上調（P＜0.05）。與模型組比較，各藥物組大鼠椎間盤組織中上述蛋白表達均顯著下調（P＜0.05）。與HIF-1α抑制劑組比較，枳殼甘草湯高劑量組大鼠椎間盤組織中VEGF、Ang2蛋白表達進一步下調（P＜0.05），VEGFR2、Ang1蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見圖3、表3。

3.2 細胞實驗結果

3.2.1 共培養后髓核細胞中CollagenⅡ和MMP-3蛋白表達檢測結果

與空白對照組比較，TNF-α組髓核細胞中CollagenⅡ蛋白表達顯著下調（P＜0.05），MMP-3蛋白表達顯著上調（P＜0.05）。與TNF-α組比較，各藥物組髓核細胞中CollagenⅡ蛋白表達均顯著上調（P＜0.05），MMP-3蛋白表達均顯著下調（P＜0.05）。與YC-1組比較，15%含藥血清組髓核細胞中CollagenⅡ蛋白表達進一步上調（P＜0.05），10%含藥血清組髓核細胞中CollagenⅡ蛋白表達和15%含藥血清組髓核細胞中MMP-3蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表4[可掃描本文首頁二維碼，進入“增強出版”頁面查看免疫熒光染色圖（附圖3）]。

3.2.2 共培養后HUVEC增殖、遷移和成管能力考察結果

與空白對照組比較，TNF-α組細胞增殖率顯著升高（P＜0.05），遷移細胞數量顯著增多（P＜0.05），成管能力顯著增強（P＜0.05）。與TNF-α組比較，各藥物組細胞增殖率及成管能力均顯著降低/減弱（P＜0.05），遷移細胞數量均顯著減少（P＜0.05）。與YC-1組比較，15%含藥血清組細胞增殖率、遷移細胞數量及成管能力差異均無統計學意義（P＞0.05）。結果見圖4（全部圖片可掃描本文首頁二維碼，進入“增強出版”頁面查看附圖4）、表5。

3.2.3 共培養后HUVEC中HIF-1α、VEGF、Ang2mRNA表達檢測結果

與空白對照組比較，TNF-α組HUVEC中HIF-1α、VEGF、Ang2mRNA表達均顯著上調（P＜0.05）。與TNF-α組比較，各藥物組HUVEC中上述mRNA（除5%含藥血清組Ang2mRNA）表達均顯著下調（P＜0.05）。與YC-1組比較，15%含藥血清組HUVEC中上述mRNA表達差異均無統計學意義（P＞0.05）。結果見表6。

3.2.4 各組HUVEC中HIF-1α/VEGF/Ang信號軸及血管生成相關蛋白表達檢測結果

與空白對照組比較，TNF-α組HUVEC中HIF-1α、VEGF、VEGFR2、Ang1、Ang2、MMP-2、MMP-9蛋白表達均顯著上調（P＜0.05）。與TNF-α組比較，各藥物組HUVEC中上述蛋白（除5%含藥血清組HIF-1α、VEGFR2、Ang2蛋白）表達均顯著下調（P＜0.05）。與YC-1組比較，15%含藥血清組HUVEC中VEGFR2、MMP-9蛋白表達進一步下調（P＜0.05），15%含藥血清組HUVEC中VEGF、Ang2、MMP-2及5%含藥血清組HUVEC中MMP-2和10%含藥血清組HUVEC中MMP-9蛋白表達差異均無統計學意義（P＞0.05），結果見圖5、表7。

4 討論

椎間盤由內部的髓核、外部的纖維環以及上下軟骨終板組成。作為連結相鄰椎體的纖維軟骨樣組織，椎間盤在維持脊柱平衡、緩沖脊柱機械負荷等方面具有重要作用。正常椎間盤除了纖維環的外1/3有些許血管和神經末梢的浸潤外，內部無血管和神經生長，營養供應主要依賴于椎體和軟骨終板之間的液體交換[1]。IDD多由椎間盤內部合成代謝和分解代謝過程的不平衡而引起，引發細胞外基質降解、纖維環破裂、病理性血管新生、氧化應激和炎癥反應等一系列病理改變，最終導致椎間盤突出、椎間盤高度下降等[1]。退變的椎間盤組織可分泌大量趨化因子，誘使單核巨噬細胞通過新生血管從外周循環遷移至退變的椎間盤，參與椎間盤的炎癥反應[2]。隨著炎癥反應的不斷加劇，椎間盤的炎癥微環境逐漸形成，纖維環細胞的凋亡和壞死增加，膠原和蛋白多糖的合成減少，進一步導致椎間盤基質的降解和退行性改變[12]。同時，炎癥反應也可以促進血管內皮細胞的增殖和遷移，促進病理性血管新生，形成惡性循環[13]。

現代醫家將病理性血管新生歸屬于中醫學“絡病”范疇，其認為西醫血管相關疾病（如血管生成亢進的腫瘤、血管生成不足的心腦缺血性疾病等）的病理特征與中醫“絡脈亢進”“絡脈虛滯”等理論相契合[14―15]。龔正豐教授傳承并發揚吳門醫派“絡病”理論，將“絡病”理論應用于椎間盤疾病的診治中，認為椎間盤髓核突出會破壞周圍正常絡脈的結構和功能，同時椎間盤內部也會新生病理性絡脈[16]。龔教授治療腰痛以通絡止痛為原則，擬方枳殼甘草湯，方中枳殼破氣、行痰，三棱、莪術通經絡、破瘀血，黑丑、白丑消痰利水，當歸、丹參活血補血，甘草和中緩急；枳殼、三棱、莪術、黑丑、白丑皆為辛藥，取“辛藥通絡”之法。該方被收錄于《國家級名醫秘驗方》，臨床應用廣泛，療效頗佳[4―5]。

髓核組織細胞外基質降解是IDD的主要病理特征之一，其主要由IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子驅動。CollagenⅡ是細胞外基質的主要成分，而細胞外基質降解與MMP-3的升高相關[1]。本研究中模型大鼠椎間盤出現髓核組織細胞外基質降解、纖維環結構紊亂等病理改變，椎間盤組織中炎癥因子水平升高；給予枳殼甘草湯后，模型大鼠椎間盤組織中炎癥因子水平降低，椎間盤病理變化減輕，髓核細胞中CollagenⅡ表達增強，MMP-3表達減弱，表明枳殼甘草湯可通過抑制炎癥因子表達及髓核組織細胞外基質降解延緩模型大鼠IDD進展。

研究表明，退變的椎間盤組織中HIF-1α、VEGF、Ang2等血管生成相關因子的表達均顯著升高[17―18]。在缺氧條件下，HIF-1α的表達增加，其通過與HIF-1β結合形成具有活性的HIF-1轉錄因子復合物，識別并結合DNA上的缺氧反應元件，從而啟動一系列與血管生成相關的基因轉錄[19]。VEGF是血管生成過程中的主要驅動因子之一，主要由HIF-1α調節產生，可通過刺激血管內皮細胞的增殖、遷移和分化，以及增加血管的通透性，為新血管的形成提供基礎；此外，VEGF可通過與血管內皮細胞上的受體（如VEGFR1和VEGFR2）結合，刺激內皮細胞中的懷布爾-帕拉德小體表達Ang2、MMP-2、MMP-9等蛋白[20]。在血管生成初期，Ang2的表達可以破壞血管內皮細胞與周圍基質的連接，使血管內皮細胞變得更具遷移性；在血管生成后期，Ang2與Ang1協同作用，促進血管的穩定和成熟[21]。MMP-2和MMP-9通過降解細胞外基質中的膠原蛋白、明膠和彈性蛋白等多種成分，從而在細胞遷移和組織重塑中發揮關鍵作用[22]。本研究結果顯示，模型大鼠椎間盤組織中血管明顯增多，出現病理性血管新生，且HIF-1α、VEGF、VEGFR2、Ang1、Ang2蛋白表達增加。而給予枳殼甘草湯后，其可抑制模型大鼠椎間盤病理性血管新生及HIF-1α、VEGF、VEGFR2、Ang1、Ang2蛋白表達。

髓核細胞退變是IDD的早期表現。本研究將髓核細胞與HUVEC進行共培養，結果顯示，退變髓核細胞能增強HUVEC增殖、遷移和成管能力，提高其HIF-1α/VEGF/Ang信號軸及血管生成相關蛋白表達；經枳殼甘草湯含藥血清干預后，髓核細胞退變減輕，HUVEC增殖、遷移和成管能力減弱，細胞中HIF-1α/VEGF/Ang信號軸及血管生成相關蛋白表達降低。這提示枳殼甘草湯能通過抑制髓核細胞退變及血管內皮細胞中HIF-1α/VEGF/Ang信號軸表達，減弱血管內皮細胞增殖、遷移和成管能力，從而抑制病理性血管新生。

綜上所述，枳殼甘草湯可以減弱血管內皮細胞的血管生成能力，改善椎間盤病理性血管新生，延緩IDD，這可能與抑制HIF-1α/VEGF/Ang信號軸有關。但本研究未與臨床進行結合，日后將采用動態增強磁共振等技術觀察枳殼甘草湯對患者椎間盤血管生成的影響，進一步闡明IDD機制及枳殼甘草湯的干預效果。