雷公藤多苷對糖尿病腎病大鼠腎損傷的影響

關鍵詞雷公藤多苷；糖尿病腎病；腎損傷；自噬；p53/miR-214/ULK1軸

糖尿病腎病（diabeticnephropathy，DN）是以蛋白尿持續和腎小球濾過率下降為主要表現的慢性腎臟病，是引發終末期腎臟病的重要因素之一，嚴重影響患者的生活質量[1]。目前，DN的治療主要是通過控制血糖來延緩病情的發展，但效果甚微[2]。研究表明，腎小管細胞自噬減少是誘發DN的病理因素之一，調控自噬在維持腎臟穩態方面具有至關重要的作用[3]。由此推測，調控細胞自噬水平，使其趨于正常、穩定，可能是治療DN的重要途徑之一。

腫瘤蛋白p53是細胞自噬的關鍵調節因子，存在于近曲小管上皮細胞的細胞核內，可促進自噬相關蛋白Beclin-1的泛素化，從而引發自噬[4]；而微RNA-214（microRNA-214，miR-214）可通過靶向結合p53來抑制下游UNC-51樣激酶1（UNC-51-likekinase1，ULK1）通路，從而抑制細胞自噬[5―7]。此外，有研究者指出，抑制p53、miR-214活性或恢復ULK1表達，均可能改善自噬受損[8]。由此可見，p53/miR-214/ULK1軸可能在DN的發生發展過程中發揮了關鍵作用。

雷公藤多苷（Tripterygiumwilfordiimultiglucoside，TWM）被稱為“中草藥激素”，是將雷公藤根去皮后精制而成的一種脂溶性混合物，可通過抑制炎癥反應、調節自噬、延緩腎纖維化等途徑來改善DN[9―10]。盡管目前尚無直接研究證實TWM與p53/miR-214/ULK1軸有關，但鑒于TWM可調節細胞自噬，且該信號軸在自噬調控中具有關鍵作用，遂本課題組推測TWM或許能通過調控此信號軸來恢復細胞自噬水平，從而減輕DN大鼠的腎損傷。基于此，本研究擬構建DN大鼠模型，以p53/miR-214/ULK1軸出發，初步探討TWM對DN大鼠腎組織的保護作用，以期為TWM的臨床應用提供理論依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括AU5800型全自動生化分析儀（美國BeckmanCoulter公司）、BA400型全自動特定蛋白分析儀（西班牙BioSystems公司）、SCG-W2000型化學發光成像系統（武漢賽維爾生物科技有限公司）、EclipseCi-L型正置光學顯微鏡（日本Nikon公司）、魚躍悅準Ⅰ型（710）血糖儀（江蘇魚躍醫療設備股份有限公司）、CRXConnect型熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）儀（美國Bio-Rad公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

TWM片（批號230801，規格10mg）購自江蘇美通制藥有限公司；纈沙坦膠囊（批號X3156，規格80mg）購自北京諾華制藥有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ；批號102651899）購自美國Sigma公司；檸檬酸鈉緩沖液（批號2312005）購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗β-肌動蛋白（β-actin）、p53、ULK1、Beclin-1、微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associatedprotein1lightchain3，LC3）抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗、RNA提取液（貨號分別為GB15003、GB15627、29005-1-AP、GB112053、GB113801、GB23303、G3013）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；魚躍血糖試紙（批號1311065）購自江蘇魚躍醫療設備股份有限公司；血尿素氮（bloodureanitrogen，BUN）、血肌酐（serumcreatinine，SCr）、白蛋白（albumin，ALB）、丙氨酸轉氨酶（alaninetransaminase，ALT）、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（totalcholesterol，TC）、葡萄糖測定試劑盒（批號分別為AUZ3094、AUZ2544、AUZ3215、AUZ3165、AUZ3171、AUZ3140、AUZ2287）均購自美國BeckmanCoulter公司；PCR所用引物由武漢賽維爾生物科技有限公司設計、合成。

1.3 實驗動物與飼料

34只6～8周齡的SPF級雄性SD大鼠，購自鄭州市惠濟區華興實驗動物養殖場，動物生產許可證號為SCXK（豫）2019-0002。所有大鼠均飼養于河南中醫藥大學第一附屬醫院動物實驗中心[環境溫度（22±2）℃、相對濕度40%～70%，晝夜各12h循環]，自由攝食、飲水。本實驗方案經河南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物福利倫理委員會審查，批準文號為FYDW2024003。

高糖高脂飼料和普通飼料分別購自北京華阜康生物科技股份有限公司和遼寧長生生物技術股份有限公司。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

34只大鼠以普通飼料適應性喂養7d，測得其血糖、尿蛋白均正常。按隨機數字表法將其分為正常組（6只）和造模組（28只）。造模組大鼠予高糖高脂飼料喂養6周，再按35mg/kg的劑量單次腹腔注射STZ溶液（以檸檬酸鈉緩沖液為溶劑）；正常組大鼠予普通飼料喂養6周，再按相同體積單次腹腔注射檸檬酸鈉緩沖液。腹腔注射72h后，采集造模組大鼠尾靜脈血，使用血糖儀測定其隨機血糖，若連續3次所測隨機血糖均不低于16.7mmol/L，則表明糖尿病模型復制成功[11]。繼續按上述條件喂養各組大鼠1周，留取其24h尿液，若造模組大鼠24h尿蛋白定量（24h-urinarytotalprotein，24h-UTP）水平≥20mg，即表明DN模型復制成功[11]。造模過程中，造模組有4只大鼠死亡，將造模成功的24只大鼠分為模型組、纈沙坦組、TWM組，每組8只。藥物灌胃量按每千克體重劑量折算系數換算[12]：纈沙坦成人（體重60kg）日劑量為80mg，折算得纈沙坦組大鼠灌胃劑量為8.33mg/（kg·d）；TWM成人（體重60kg）日劑量為60mg，折算得TWM組大鼠灌胃劑量為6.25mg/（kg·d）；均以生理鹽水作為溶劑。正常組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水。每天1次，連續6周。

2.2 標本采集與生化指標檢測

末次給藥后，各組大鼠均禁食不禁水24h，使用代謝籠收集其24h尿液，以全自動蛋白分析儀檢測腎功能指標（24h-UTP）水平。隨后，大鼠以2%戊巴比妥鈉麻醉，于腹主動脈取血，取上層血清，使用全自動生化分析儀檢測肝腎功能指標（BUN、SCr、ALB、ALT）、血脂指標（TG、TC）、血糖指標[空腹血糖（fastingbloodglucose，FBG）]水平。取血后，大鼠以頸椎脫臼法處死，剝離腎臟，切取部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，余下部分于－80℃下凍存，待檢。

2.3 腎組織病理學改變觀察

取“2.2”項下各組大鼠固定的腎組織適量，經修剪、脫水、石蠟包埋后切片（厚約4μm），進行蘇木精-伊紅染色后，使用光學顯微鏡觀察腎組織病理學改變。

2.4 腎組織中p53/miR-214/ULK1軸相關蛋白及mRNA表達檢測

采用Westernblot法檢測相關蛋白的表達。取“2.2”項下各組大鼠凍存的腎組織適量，加入裂解液研磨，于冰上裂解30min，在4℃下以12000r/min離心10min，取上層總蛋白溶液，經變性、電泳分離、轉膜、封閉后，加入p53、ULK1、Beclin-1、LC3、β-actin一抗（稀釋比分別為1∶1000、1∶1000、1∶1000、1∶1000、1∶3000），于4℃下孵育過夜；加入相應二抗（稀釋比例為1∶3000），于溫室下孵育2h；以化學發光試劑顯影、曝光后成像。使用AIWBwellTM軟件，以β-actin為內參，計算各目的蛋白的表達水平。

采用實時熒光PCR（real-timePCR，RT-PCR）法檢測相關mRNA的表達。取“2.2”項下各組大鼠凍存的腎組織適量，充分研磨后，在4℃下以12000r/min離心10min，提取總RNA；測定其濃度、純度后，進行轉錄，得cDNA；以此cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR體系包括cDNA模板2.0μL，SYBRGreenqPCR預混液（2×）7.5μL，正、反向引物（具體序列及產物長度見表1）各0.75μL，無酶無菌水4.0μL。擴增條件為95℃預變性30s；95℃變性15s，60℃退火延伸30s，共40個循環。以GAPDH內參，采用2－ΔΔCt法計算各目的mRNA的表達水平，結果以正常組為參照進行歸一化處理。

2.5 統計學方法

使用SPSS23.0軟件對數據進行統計分析。數據以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗（方差齊）或Dunnett’sT3檢驗（方差不齊）。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 TWM對DN大鼠肝腎功能指標的影響

與正常組比較，模型組和各藥物組大鼠體內24h-UTP、BUN、SCr、ALT水平均顯著升高，ALB水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，纈沙坦組、TWM組大鼠體內24h-UTP、BUN、SCr、ALT水平均顯著降低，ALB水平均顯著升高（P＜0.01）。結果見表2。

3.2 TWM對DN大鼠血糖、血脂指標的影響

與正常組比較，模型組和各藥物組大鼠體內TG、TC、FBG水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，纈沙坦組、TWM組大鼠體內上述指標水平均顯著降低（P＜0.01）。結果見表3。

3.3 TWM對DN大鼠腎組織病理學改變的影響

正常組大鼠腎組織內腎小球分布均勻，腎小管上皮細胞圓潤，未見明顯的淋巴細胞浸潤；與正常組比較，模型組大鼠腎組織內腎小管上皮呈明顯的水腫狀態，細胞腫脹，細胞質呈空泡化質，可見結締組織增生，并伴有淋巴細胞浸潤；與模型組比較，纈沙坦組、TWM組大鼠腎組織病理學損傷明顯減輕，腎小管上皮有少許水腫，間質有少量纖維組織增生及淋巴細胞浸潤，趨于正常組但未完全恢復。結果見圖1。

3.4 TWM對DN大鼠腎組織中p53/miR-214/ULK1軸相關蛋白及mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組和各藥物組大鼠腎組織中p53蛋白的表達顯著上調，ULK1、Beclin-1蛋白的表達和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均顯著下調或降低（P＜0.01）；與模型組比較，纈沙坦組、TWM組大鼠腎組織中p53蛋白的表達均顯著下調，ULK1、Beclin-1蛋白的表達和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均顯著上調或升高（P＜0.01）。結果見圖2、表4。

與正常組比較，模型組和各藥物組大鼠腎組織中p53mRNA、miR-214的表達均顯著上調，ULK1、Beclin-1、LC3mRNA的表達均顯著下調（P＜0.01）；與模型組比較，纈沙坦組、TWM組大鼠腎組織中p53mRNA、miR-214的表達均顯著下調，ULK1、Beclin-1、LC3mRNA的表達均顯著上調（P＜0.01）。結果見表5。

4 討論

DN是糖尿病最常見的微血管并發癥之一，可對腎臟造成嚴重損害并引發腎衰竭。DN的臨床表現包括蛋白尿、進行性腎功能減退及腎小球濾過率降低[13]。在中醫學中，DN歸屬于“消癉”“消渴”范疇，以情志抑郁、憤怒為重要發病因素，即肝氣郁結化火傷肝陰，乙癸同源致腎陰不足，虛火灼腎絡，使腎失固攝，蛋白隨尿流失。本病本虛標實，病機與“虛”“瘀”“毒”密切相關[14]。

雷公藤，味苦辛，性涼，歸肝腎經，具有祛風除濕、活血消腫、通絡止痛之功效，可發揮抗炎、抗腫瘤、抑制免疫等藥理作用，常被用于治療慢性腎炎、腎小球腎炎、系統性紅斑狼瘡、血小板減少性紫癜等疾病[15]。研究指出，TWM含有雷公藤甲素、二萜類成分等活性物質，具有抗炎、改善氧化應激、調節免疫等作用，可通過多種途徑降低尿蛋白、血尿水平，從而達到保護腎臟的目的[16]。臨床研究顯示，纈沙坦可改善DN患者的腎功能指標，減輕相關癥狀[17]；基礎研究顯示，該藥可緩解DN小鼠的腎功能衰退，改善其腎小管間質纖維化，并可通過上調細胞自噬、減少腎小管損傷、改善相關生化指標來發揮腎保護作用[18―19]。基于此，本研究選擇纈沙坦作為陽性對照藥物。

本研究以高糖高脂喂養聯合STZ腹腔注射的方法建立DN大鼠模型。結果顯示，模型組大鼠體內24h-UTP、BUN、SCr、ALT、TG、TC、FBG水平均較正常組顯著升高，ALB水平較正常組顯著降低；腎小管上皮細胞水腫明顯，可見腎小球血管擴張、細胞質疏松淡染以及少量結締組織增生。與模型組比較，TWM組大鼠上述肝腎功能、糖脂指標水平均顯著改善，腎組織病理學損傷明顯減輕，但均未完全恢復正常，表明TWM對DN大鼠腎臟具有一定的保護作用。

Zhang等[20]研究發現，自噬在DN的發生發展中具有關鍵作用。自噬是一種進化上保守的分解代謝機制，可降解自噬溶酶體包裹的內容物，產生新的代謝底物，從而協助細胞適應應激和存活，但過度自噬會造成細胞死亡。自噬的發生通常與Beclin-1、LC3蛋白的表達密切相關。Beclin-1編碼基因是酵母自噬相關基因ATG6的同系物，是參與哺乳動物體內自噬的特異性基因，上調其在哺乳動物細胞中的表達可促進自噬體的形成，從而刺激自噬的發生[21]。LC3是評價細胞自噬水平的標志物，可參與自噬的各個階段：LC3包括LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ兩種形式，當自噬發生時，LC3-Ⅰ會轉變為LC3-Ⅱ，且后者對于自噬體的形成起決定性作用，故可通過檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ來評估細胞的自噬水平[22]。微RNA是一類內源性的、非編碼的短RNA分子，其中miR-214可參與調控各種細胞自噬[23]。當應激發生時，細胞質中的p53蛋白可通過磷酸化作用轉移到細胞核內，從而誘導自噬；p53蛋白也是miR-214的上游轉錄因子，可誘導miR-214的激活[8]。ULK1是一種蛋白激酶，可在哺乳動物細胞的自噬體膜上廣泛表達，是miR-214的直接靶點，參與自噬啟動的調控，當ULK1與miR-214結合后，miR-214可下調ULK1在腎臟中的表達，增加對自噬的抑制作用，從而減弱細胞自噬活性，導致腎損傷，最后進展為DN[24―25]。本研究結果顯示，TWM能顯著上調/升高DN大鼠腎組織中ULK1、Beclin-1蛋白及mRNA的表達和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，下調p53蛋白及mRNA、miR-214的表達，恢復細胞自噬。

綜上所述，TWM能減輕DN大鼠的腎損傷，改善其肝腎功能和糖脂水平，上述作用可能與調控p53/miRNA-214/ULK1軸、恢復細胞自噬有關。