貝母素乙對肺炎鏈球菌誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制

關(guān)鍵詞貝母素乙；肺炎鏈球菌；肺泡上皮細(xì)胞；Rac1/Akt/NF-κB信號通路

肺部上皮細(xì)胞由肺泡上皮細(xì)胞（alveolarepithelialcells，AEC）組成，可為交換氣體、隔離吸入的異物以及調(diào)節(jié)水和離子的傳輸提供場所，是肺穩(wěn)態(tài)環(huán)境的關(guān)鍵組成部分；此外，AEC作為保護(hù)性機(jī)械屏障，可防止病原體吸入，降低由促炎因子、病原體等所致細(xì)菌性肺炎和急性肺損傷（acutelunginjury，ALI）的發(fā)生風(fēng)險[1]。肺炎球菌性肺炎是最常見的細(xì)菌性肺炎類型，通常會引發(fā)劇烈的炎癥反應(yīng)，從而危及患者生命[2]。肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae，SP）是一種革蘭氏陽性菌，侵入機(jī)體后，其可從鼻咽擴(kuò)散到肺部，從而誘發(fā)細(xì)菌性肺炎。SP感染患者主要表現(xiàn)為腸寒、發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難，并可進(jìn)展為急性呼吸衰竭、膿毒性休克、多器官衰竭，甚至死亡[3]。臨床實(shí)踐顯示，細(xì)菌性肺炎的治療常受到抗菌藥物耐藥性的影響，因此探索有效緩解SP致肺炎的新型藥物十分重要。

貝母素乙（peiminineB，PEI）是貝母屬藥用植物的主要有效成分。研究指出，除具有抗炎活性外，PEI還可直接保護(hù)炎癥性疾病中的AEC、骨細(xì)胞等，這種保護(hù)作用可能與增加細(xì)胞對腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）等炎癥因子的耐受性，從而抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)[4]；此外，PEI可減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠ALI和炎癥反應(yīng)，并減弱磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide3-kinase，PI3K）和蛋白激酶B（proteinkinaseB，又稱Akt）的磷酸化水平，抑制核因子κB（nuclearfactorκB，NF-κB）的活性[5]，但PEI對AEC損傷影響的具體分子機(jī)制尚不明確。激活的伏隔核Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1（RasrelatedC3botulinumtoxinsubstrate1innucleusaccumbens，Rac1）在啟動炎癥相關(guān)通路Akt/NF-κB的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮了重要作用，可通過激活上述信號通路來促進(jìn)下游促炎介質(zhì)的表達(dá)，而抑制該信號通路則可顯著減輕機(jī)體的炎癥反應(yīng)[6]。由此推測，Rac1/Akt/NF-κB信號通路可能是PEI的作用靶點(diǎn)。本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PEI可能通過調(diào)控上述信號通路來影響肺炎等疾病的進(jìn)展。基于此，本研究以人AEC（HPAEpiC細(xì)胞）作為對象，基于Rac1/Akt/NF-κB信號通路，初步探索PEI對SP致AEC損傷的影響及潛在機(jī)制，以期為細(xì)菌性肺炎的臨床治療提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Ox-101C型細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海塔望智能科技有限公司）、CLARIOstarPLUS型酶標(biāo)儀（德國BMGLABTECH公司）、K-IMC-900TFL型熒光顯微鏡（德國KOSTER公司）、DxFLEX型流式細(xì)胞儀[貝克曼庫爾特國際貿(mào)易（上海）有限公司]、1645052型電泳儀（美國Bio-Rad公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

PEI對照品（批號SH8310，純度≥98%）購自北京索萊寶科技有限公司；Akt通路激活劑SC79的對照品（批號LM2730-10mM，純度≥98%）購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；兔抗周期蛋白依賴性激酶1（cyclin-dependentkinase1，CDK1）、B細(xì)胞淋巴瘤2相關(guān)X蛋白（Bcelllymphoma-2relatedXprotein，Bax）、Rac1、磷酸化Akt（p-Akt）、Akt、磷酸化NF-κB（p-NF-κB）、NF-κB、β-肌動蛋白（β-actin）抗體（批號分別為CSB-PA005061LA01-HU、CSB-PA002573GA01HU、CSB-PA019242GA01HU、CSB-RA001553A450phHU、CSB-PA15905A0Rb、CSBPA000579、CSB-PA10354A0Rb、CSB-PA01629A0Rb）均購自華美生物工程有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（批號33501ES60）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-18、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號分別為EH0201、AQ-H0205-B、EH0185）均購自武漢菲恩生物科技有限公司；乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）試劑盒（批號E1020-1）購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）試劑盒（批號50104ES60）購自翌圣生物（上海）股份有限公司；活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）試劑盒（批號JKG217）購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（批號YX-101409）購自上海億修生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基（批號A-CSH795-500mL）購自武漢佰瑞得生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)胞與菌株

人HPAEpiC細(xì)胞（批號HT-X2419）購自深圳市豪地華拓生物科技公司；SP（批號BKJ4126）購自上海帛科生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與給藥

將HPAEpiC細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)（每2d更換1次培養(yǎng)基），至對數(shù)生長期后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

取對數(shù)生長期的HPAEpiC細(xì)胞，隨機(jī)分為對照組（Control組），SP組，PEI低、中、高濃度組（P-L、P-M、P-H組），PEI高濃度+Akt通路激活劑組（P-H+SC79組），每組設(shè)置6個復(fù)孔。除Control組（正常培養(yǎng)，不經(jīng)任何處理）外，SP組細(xì)胞用1×108cfu/mL的SP菌液處理24h[7]，PEI各濃度組細(xì)胞分別用0.05、0.10、0.20mmol/L的PEI（濃度根據(jù)前期MTT實(shí)驗(yàn)確定）+1×108cfu/mL的SP菌液共同處理24h，P-H+SC79組細(xì)胞用0.20mmol/L的PEI+10μmol/L的SC79[8]+1×108cfu/mL的SP菌液共同處理24h。

2.2 細(xì)胞上清液中炎癥因子檢測

采用ELISA法檢測。取對數(shù)生長期的HPAEpiC細(xì)胞，按“2.1”項(xiàng)下方法分組、處理。24h后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，離心，取上清液，按照相應(yīng)試劑盒說明書方法操作，使用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8、IL-1β水平。

2.3 細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

采用比色法檢測細(xì)胞上清液中SOD、LDH含量。取對數(shù)生長期的HPAEpiC細(xì)胞，按“2.1”項(xiàng)下方法分組、處理。24h后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，離心，取上清液，按照相應(yīng)試劑盒說明書方法操作，使用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞上清液中SOD、LDH含量。

采用2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯（2′，7′-dichlorofluorescindiacetate，DCFH-DA）熒光探針法檢測細(xì)胞中ROS含量。取對數(shù)生長期的HPAEpiC細(xì)胞，按“2.1”方法分組、處理。24h后，收集各組細(xì)胞，用胰酶消化，加入DMEM培養(yǎng)基終止消化并制備細(xì)胞懸液（細(xì)胞密度1×106個/mL）；取上述細(xì)胞懸液，離心；收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，加入DCFH-DA探針，于室溫下避光孵育30min，離心；收集細(xì)胞，用PBS清洗2次后重懸，使用顯微鏡觀察各組細(xì)胞的熒光變化情況并使用ImageJ軟件分析其熒光強(qiáng)度，用以表示細(xì)胞中ROS含量。

2.4 細(xì)胞凋亡檢測

采用雙染法檢測。取對數(shù)生長期的HPAEpiC細(xì)胞，按“2.1”項(xiàng)下方法分組、處理。24h后，收集各組細(xì)胞，用PBS清洗，再以bindingbuffer重懸、離心，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個/mL。向細(xì)胞懸液中依次加入AnnexinⅤ-FITC溶液、PI溶液，混勻，避光孵育15min。使用流式細(xì)胞儀檢測，并采用FlowJo軟件分析凋亡數(shù)據(jù)（流式圖中，左上象限為壞死細(xì)胞，右上/下象限為凋亡細(xì)胞，左下象限為正常活細(xì)胞，凋亡率為右上/下象限凋亡細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的比例）。

2.5 細(xì)胞中增殖/凋亡、通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測

用Westernblot法檢測。取對數(shù)生長期的HPAEpiC細(xì)胞，按“2.1”項(xiàng)下方法分組、處理。24h后，以裂解液提取各組細(xì)胞的總蛋白，再以BCA法測定蛋白含量。將蛋白與緩沖液混合，于水浴中加熱5min變性。取變性蛋白適量，進(jìn)行電泳分離并轉(zhuǎn)膜，以脫脂奶粉封閉1h；洗膜后，加入增殖/凋亡相關(guān)蛋白（CDK1、Bax）、通路相關(guān)蛋白（Rac1、p-Akt、Akt、p-NF-κB、NF-κB）、內(nèi)參蛋白（β-actin）一抗（稀釋比例分別為1∶1000、1∶1000、1∶2000、1∶2000、1∶2000、1∶2000、1∶2000、1∶2000），于4℃下孵育過夜；洗膜后，加入相應(yīng)二抗（稀釋比例為1∶2000），室溫下孵育2h；洗膜后，以ECL顯色、成像。使用ImageJ軟件，以β-actin為內(nèi)參蛋白，分析各目的蛋白的表達(dá)水平，以p-Akt與Akt、p-NF-κB與NF-κB蛋白的表達(dá)水平比值表示Akt、NF-κB蛋白的磷酸化水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 PEI對SP誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞上清液中炎癥因子的影響

與Control組比較，SP組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8、IL-1β水平均顯著升高（P＜0.05）；與SP組比較，P-L、PM、P-H組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8、IL-1β水平均顯著降低，且呈濃度依賴性（P＜0.05）；與P-H組比較，P-H+SC79組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8、IL-1β水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

3.2 PEI對SP誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

與Control組比較，SP組細(xì)胞SOD含量顯著降低，LDH、ROS含量均顯著升高（P＜0.05）；與SP組比較，PL、P-M、P-H組細(xì)胞SOD含量均顯著升高，LDH、ROS含量均顯著降低，且呈濃度依賴性（P＜0.05）；與P-H組比較，P-H+SC79組細(xì)胞SOD含量顯著降低，LDH、ROS含量均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表2、圖1。

3.3 PEI對SP誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡率及增殖/凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與Control組比較，SP組細(xì)胞的凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與SP組比較，P-L、P-M、P-H組細(xì)胞的凋亡率均顯著降低，且呈濃度依賴性（P＜0.05）；與P-H組比較，P-H+SC79組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表3、圖2。

與Control組比較，SP組細(xì)胞中CDK1蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)，Bax蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）；與SP組比較，P-L、P-M、P-H組細(xì)胞中CDK1蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào)，Bax蛋白的表達(dá)均顯著下調(diào)，且呈濃度依賴性（P＜0.05）；與P-H組比較，P-H+SC79組細(xì)胞中CDK1蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)，Bax蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）。結(jié)果見表3、圖3。

3.4 PEI對SP誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與Control組比較，SP組細(xì)胞中Rac1蛋白的表達(dá)和Akt、NF-κB蛋白的磷酸化水平均顯著上調(diào)或升高（P＜0.05）；與SP組比較，P-L、P-M、P-H組細(xì)胞中Rac1蛋白的表達(dá)和Akt、NF-κB蛋白的磷酸化水平均顯著下調(diào)或降低，且呈濃度依賴性（P＜0.05）；與P-H組比較，P-H+SC79組細(xì)胞中Rac1蛋白的表達(dá)和Akt、NF-κB蛋白的磷酸化水平均顯著上調(diào)或升高（P＜0.05）。結(jié)果見表4、圖4。

4 討論

SP是一種革蘭氏陽性致病菌，常在動物或人鼻咽部定植，可導(dǎo)致細(xì)菌性肺炎。SP在世界范圍內(nèi)迅速傳播，老年人、兒童或免疫功能低下人群是該菌的易感人群[9]。該菌具有侵入肺組織并激活上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的能力，可破壞肺泡毛細(xì)血管屏障，但其致肺損傷的具體機(jī)制十分復(fù)雜，尚未被完全闡明[9]。細(xì)菌性肺炎的治療往往受到抗菌藥物耐藥性的影響，因此尋找有效藥物減輕SP誘導(dǎo)的肺損傷、降低患者死亡率至關(guān)重要。

研究指出，炎癥因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6等，其中TNF-α、IL-1β可誘導(dǎo)肺中性粒細(xì)胞蓄積并促進(jìn)包括IL-6在內(nèi)的其他炎癥因子的釋放[10]。大量的促炎介質(zhì)可進(jìn)一步引發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，使巨噬細(xì)胞過度激活，從而產(chǎn)生以IL-1β為代表的炎癥因子，最終加重機(jī)體炎癥反應(yīng)[11]。研究顯示，細(xì)菌感染發(fā)生時，機(jī)體內(nèi)的主要效應(yīng)分子是ROS，過度的ROS積累會誘發(fā)氧化應(yīng)激，從而進(jìn)一步參與介導(dǎo)炎癥細(xì)胞募集和炎癥級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致組織損傷[10]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)SP誘導(dǎo)后，細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8、IL-1β、LDH水平/含量和細(xì)胞中ROS含量均較Control組顯著升高，上清液中SOD含量較Control組顯著降低，說明SP可導(dǎo)致AEC出現(xiàn)ROS過度積累，使炎癥因子分泌增加，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，PEI具有鎮(zhèn)痛、抗炎和抗腫瘤等生物活性，還可松弛平滑肌[12]。PEI能夠顯著抑制促炎因子（如TNF-α、IL-6和IL-1β）的分泌，增加抗炎因子（如IL-10）的表達(dá)，并抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生；同時，PEI還可抑制A549細(xì)胞中IL-8的產(chǎn)生，并可抑制NF-κB信號通路的激活、減少脂多糖誘導(dǎo)的Akt蛋白的磷酸化[5，13]。本研究結(jié)果顯示，用低、中、高濃度的PEI處理SP誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞后，細(xì)胞的凋亡率均顯著降低，增殖相關(guān)蛋白CDK1的表達(dá)顯著上調(diào)，凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)顯著下調(diào)，SOD含量顯著升高，ROS和LDH含量均顯著降低，IL-6、IL-8、IL-1β分泌均顯著減少，且上述作用呈濃度依賴性，說明PEI可抑制AEC凋亡，降低其炎癥水平，減輕氧化應(yīng)激損傷，初步證實(shí)了PEI的抗炎及抗氧化應(yīng)激作用。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，抑制Rac1/Akt/NF-κB信號通路可減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而改善膿毒癥大鼠的腸損傷[14]。NF-κB是位于Akt蛋白下游的重要炎癥信號通路，其被激活后可加重機(jī)體炎癥反應(yīng)，與多種炎癥性疾病（如肺炎、炎癥性腸病、乳腺炎等）的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；此外，NF-κB的激活可促進(jìn)炎癥介質(zhì)的表達(dá)，包括炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和促炎蛋白酶，抑制NF-κB蛋白的磷酸化是有效緩解肺部疾病相關(guān)癥狀的潛在靶點(diǎn)[11]。當(dāng)炎癥發(fā)作時，Akt蛋白的磷酸化水平明顯升高，進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥因子及促炎蛋白酶表達(dá)的增加[11]。據(jù)報道，Rac1/Akt/NF-κB信號通路可能是藥物改善急性肺炎模型大鼠炎癥反應(yīng)的潛在靶點(diǎn)[15]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)SP誘導(dǎo)后，HPAEpiC細(xì)胞中Rac1蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)，Akt、NF-κB蛋白的磷酸化水平均顯著升高；經(jīng)低、中、高濃度PEI處理后，細(xì)胞中Rac1蛋白的表達(dá)呈濃度依賴性下調(diào)，Akt、NF-κB蛋白的磷酸化水平呈濃度依賴性降低，提示PEI減輕SP誘導(dǎo)的肺組織炎癥和氧化應(yīng)激損傷的作用可能與抑制Rac1/Akt/NF-κB信號通路有關(guān)。為驗(yàn)證上述假設(shè)，本研究以高濃度PEI聯(lián)合Akt通路激活劑SC79對HPAEpiC細(xì)胞進(jìn)行了干預(yù)，結(jié)果顯示，PEI對細(xì)胞的保護(hù)作用被SC79顯著逆轉(zhuǎn)，提示PEI可能通過抑制Rac1/Akt/NF-κB信號通路來改善SP誘導(dǎo)的AEC損傷。

綜上所述，PEI可減輕SP誘導(dǎo)的AEC炎癥和氧化應(yīng)激損傷，抑制細(xì)胞凋亡，上述作用可能是通過抑制Rac1/Akt/NF-κB信號通路而實(shí)現(xiàn)的。然而，本研究僅通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對PEI的保護(hù)作用及機(jī)制進(jìn)行了初步探究，尚需體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究。