二甲雙胍對非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝損傷的改善作用

關鍵詞二甲雙胍；非酒精性脂肪性肝炎；肝損傷；脂代謝；肝纖維化；PI3K/AKT/PDGF信號通路

非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholicsteatohepatitis，NASH）是在沒有酒精濫用的情況下發展起來的晚期脂肪性肝病，也是最常見的慢性肝病[1]。根據“多重打擊”理論可知，肝脂肪變性使肝細胞對其他打擊敏感，導致肝細胞出現損傷和纖維化，進而發展為NASH[2]。運動和飲食改變是NASH常見的輔助性治療方式，但效果一般，目前尚無治療NASH的特效藥物。因此，迫切需要開發安全有效的藥物用于治療NASH。

二甲雙胍（metformin，Met）是治療2型糖尿病的一線藥物[3]，相關研究顯示，Met可通過調控非酒精性脂肪性肝病大鼠的腸道菌群結構，增加有益菌的豐度，改善脂代謝和肝損傷[4]；還可通過調控AMP活化的蛋白質激酶-過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子1α軸抑制炎癥反應，減輕敗血癥小鼠的肝損傷[5]。此外臨床研究顯示，Met聯合辛伐他汀可改善非酒精性脂肪性肝病合并2型糖尿病患者的脂代謝水平[6]。由此可見，Met在治療肝病方面顯示出巨大潛力。

磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide3-kinase/proteinkinaseB，PI3K/AKT）信號通路與非酒精性脂肪性肝病中的脂代謝和炎癥反應密切相關，研究表明，調節PI3K/AKT信號通路可以逆轉肝細胞壞死、炎癥反應和氧化應激誘導的肝損傷[7]。血小板源性生長因子（platelet-derivedgrowthfactor，PDGF）是間質細胞（如成纖維細胞）的生長刺激因子，過表達的PDGF能夠促進膠原的產生和沉積，而降低PDGF水平能夠有效地改善肝組織的纖維化[8]。相關研究發現，調控PI3K/AKT/PDGF信號通路活性，可影響代謝相關脂肪性肝病小鼠的肝脂肪變性和纖維化發展[9]。目前，尚不清楚Met能否通過調控PI3K/AKT/PDGF信號通路發揮對NASH的改善作用。基于此，本研究通過構建NASH大鼠模型，探究Met調控PI3K/AKT/PDGF信號通路對NASH大鼠肝損傷的影響，以期為Met治療NASH提供實驗依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有1645050型電泳儀（廣州維基科技有限公司）、GenoSensS2Pro型一體式凝膠成像儀（上海勤翔科學儀器有限公司）、卓越400型全自動生化分析儀（西安天隆科技有限公司）、SpectraMaxi3x型多功能酶標儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]、Ⅸ3-ICSI/IMSI型倒置熒光顯微鏡[儀景通光學科技（上海）有限公司]、ES-300型組織包埋機（上海聚慕醫療器械有限公司）、CX23型光學顯微鏡[桂寧（上海）實驗器材有限公司]。

1.2 主要藥品與試劑

Met（批號657-24-9，純度≥99.98%）購自美國MCE公司；PI3K激活劑740Y-P（批號Y648850）購自阿拉丁控股集團有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（批號ZY7070）購自上海澤葉生物科技有限公司；油紅O染色試劑盒（批號PCM-K-003）購自上海中喬新舟生物科技有限公司；Masson染色試劑盒（批號60532ES58）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（totalcholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low-densitylipoproteincholesterol，LDL-C）、丙氨酸轉氨酶（alanineaminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉氨酶（aspartateaminotransferase，AST）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）試劑盒（批號分別為BC0620、BC1980、BC5330、BC1550、BC1560、SEKM-0007、SEKM-0034）均購自北京索萊寶科技有限公司；兔源PI3K、磷酸化PI3K（p-PI3K）、AKT、磷酸化AKT（p-AKT）、PDGF、胱天蛋白酶3（Caspase-3）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（批號分別為ab302959、ab304351、ab8805、ab8933、ab178409、ab184787、ab8226、ab302644）均購自英國Abcam公司。

1.3 實驗動物

本研究動物為SPF級雄性SD大鼠，體重為（190±20）g，購自武漢有度生物科技有限公司，動物生產許可證號為SCXK（鄂）2021-0025。將大鼠單獨飼養于通風鼠籠中（相對濕度60%，溫度25℃，12h明暗循環）。本研究經武漢有度生物科技有限公司動物實驗中心倫理審查委員會審核批準，倫理批號為2021-11-158。

2 方法

2.1 造模

大鼠適應性喂養7d后，分為造模組（n＝63）和對照組（Control組，n＝15）。造模組大鼠參考文獻方法建立NASH模型[10]：大鼠以高糖高脂飲食[含20%蛋白質、35%碳水化合物（包括18%蔗糖、10%麥芽糖糊精、7%淀粉）、45%脂質]飼喂，Control組大鼠以基礎日糧飼喂，6周后，隨機挑選3只造模組大鼠與3只Control組大鼠進行指標檢測。若造模組大鼠相關指標（肝指數、組織病理變化、血清炎癥因子水平）顯著異于Control組，則視為造模成功。

2.2 分組與給藥

將造模成功的剩余大鼠隨機分為模型組（Model組）、Met低劑量組（Met-L組）、Met中劑量組（Met-M組）、Met高劑量組（Met-H組）、高劑量Met+PI3K激活劑組（Met-H+740Y-P組），每組12只。Met-L組、Met-M組、Met-H組大鼠分別灌胃100、200、400mg/kg的Met[11]，每天1次，連續6周。Met-H+740Y-P組大鼠在每次灌胃400mg/kgMet后，尾靜脈注射50mg/kg的740Y-P[12]。Control組和Model組大鼠除灌胃等體積的生理鹽水替代Met外，其他處理方式同藥物干預組。

2.3 體重及肝指數檢測

末次給藥后對所有大鼠禁食不禁水12h，稱重后腹腔注射戊巴比妥鈉（30mg/kg）麻醉大鼠并進行腹主動脈采血，血樣保存備用；處死大鼠后，取肝臟并稱重，計算肝指數（肝指數＝肝臟質量/體重×100%）；肝臟稱重結束后，保存備用。

2.4 血清中炎癥因子及生化指標水平檢測

取“2.3”項下血樣以3000r/min離心15min，取上層血清備用；一部分血清用于檢測炎癥因子（IL-6、TNF-α）水平，一部分血清用于檢測脂代謝（TC、TG、LDL-C）和肝功能（AST、ALT）指標水平，具體方法按試劑盒說明書操作。

2.5 肝組織中炎癥因子水平檢測

取“2.3”項下肝組織適量，加入預冷的生理鹽水進行勻漿，按照試劑盒說明書方法檢測大鼠肝組織中炎癥因子（IL-6、TNF-α）水平。

2.6 肝組織病理變化觀察

各組隨機取6只大鼠的部分肝組織（剩余部分用于脂質沉積檢測），置于10%甲醛溶液中固定24h；經脫水、包埋、切片（5μm）后，取部分切片（剩余切片用于纖維化檢測）進行HE染色，封片后，采用光學顯微鏡觀察大鼠肝組織病理變化并進行非酒精性脂肪性肝病活動度評分（non-alcoholicfattyliverdiseaseactivityscore，NAS）[13]。

2.7 肝組織脂質沉積觀察

取“2.6”項下各組6只大鼠剩余肝組織適量，經包埋、切片（4μm）、油紅O染色、60%異丙醇沖洗后，以蘇木精復染，封片后，采用倒置熒光顯微鏡觀察大鼠肝組織脂質沉積情況，并采用Image-proPlus6.0軟件分析油紅O陽性染色面積占比。

2.8 肝組織纖維化觀察

取“2.6”項下剩余肝組織切片，置于60℃條件下烤片過夜，再以二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水；經Masson染料依次染色后，以中性樹膠封片，采用光學顯微鏡觀察大鼠肝組織纖維化情況，并采用Image-proPlus6.0軟件計算膠原沉積分數（膠原沉積分數＝視野下膠原纖維化面積/總面積×100%）。

2.9 肝組織中PI3K/AKT/PDGF信號通路相關蛋白和Caspase-3蛋白表達檢測

取各組另外6只大鼠的肝組織適量，加入預冷的蛋白裂解液充分反應，離心取上清液，并采用BCA法對總蛋白進行定量。蛋白經變性處理后，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白并將其轉移到PVDF膜上；以5%脫脂奶粉封閉后，加入p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、PDGF、Caspase-3、β-actin一抗（稀釋比例均為1∶1000）在4℃下孵育過夜；以TBST洗膜后，加入二抗（稀釋比例為1∶1000）室溫孵育1h。經ECL顯影后，進行凝膠成像，以目的蛋白與內參β-actin的灰度值比值表示蛋白的表達水平，以p-PI3K與PI3K、p-AKT與AKT蛋白的表達水平比值表示PI3K、AKT蛋白的磷酸化水平。

2.10 統計學方法

采用SPSS24.0軟件進行統計分析，計量資料（均符合正態分布）以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 大鼠體重和肝指數檢測結果

如表1所示，相較于Control組，Model組大鼠體重和肝指數均顯著升高（P＜0.05）；相較于Model組，Met-L組、Met-M組、Met-H組大鼠體重和肝指數均顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；相較于Met-H組，Met-H+740Y-P組大鼠體重和肝指數均顯著升高（P＜0.05）。

3.2 大鼠血清中生化指標水平檢測結果

如表2所示，相較于Control組，Model組大鼠血清中脂代謝和肝功能指標水平均顯著升高（P＜0.05）；相較于Model組，Met-L組、Met-M組、Met-H組大鼠血清中脂代謝和肝功能指標水平均顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；相較于Met-H組，Met-H+740Y-P組大鼠血清中脂代謝和肝功能指標水平均顯著升高（P＜0.05）。

3.3 大鼠血清和肝組織中炎癥因子水平檢測結果

如表3所示，相較于Control組，Model組大鼠血清和肝組織中IL-6、TNF-α水平均顯著升高（P＜0.05）；相較于Model組，Met-L組、Met-M組、Met-H組大鼠血清和肝組織中IL-6、TNF-α水平均顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；相較于Met-H組，Met-H+740Y-P組大鼠血清和肝組織中IL-6、TNF-α水平均顯著升高（P＜0.05）

3.4 大鼠肝組織病理變化觀察結果

如圖1所示，Control組大鼠肝細胞分布均勻、排列規則、結構完整，NAS為（0.17±0.01）分。Model組大鼠肝細胞內可見脂肪空泡，肝細胞排列紊亂且出現炎癥細胞浸潤現象，NAS[（6.83±0.72）分]相較于Control組顯著升高（P＜0.05）。Met-L組、Met-M組、Met-H組大鼠相較于Model組，肝細胞內脂肪空泡數均明顯減少，肝細胞均有序排列，炎癥細胞浸潤程度均減輕，NAS[分別為（5.16±0.58）、（3.83±0.45）、（2.50±0.20）分]均顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。Met-H+740Y-P組大鼠相較于Met-H組，肝組織病理損傷更重，NAS[（6.33±0.65）分]顯著升高（P＜0.05）。

3.5 大鼠肝組織脂質沉積觀察結果

如圖2所示，Control組大鼠肝組織含有少量脂滴，油紅O陽性染色面積占比為（1.50±0.10）%。相較于Control組，Model組大鼠肝組織富含脂滴，呈鮮紅色，油紅O陽性染色面積占比[（13.33±1.21）%]顯著升高（P＜0.05）。相較于Model組，Met-L組、Met-M組、Met-H組大鼠肝組織脂滴數量均減少，油紅O陽性染色面積占比[分別為（10.67±1.04）%、（7.34±0.68）%、（4.83±0.37）%]均顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。相較于Met-H組，Met-H+740Y-P組大鼠肝組織脂滴數量增多，油紅O陽性染色面積占比[（11.17±0.99）%]顯著升高（P＜0.05）。

3.6 大鼠肝組織纖維化觀察結果

如圖3所示，Control組大鼠肝組織無纖維化現象，膠原沉積分數為0。相較于Control組，Model組大鼠肝組織出現明顯藍色膠原纖維沉積，膠原沉積分數[（15.21±1.42）%]顯著升高（P＜0.05）。相較于Model組，Met-L組、Met-M組、Met-H組大鼠肝組織纖維化程度均減輕，膠原沉積分數[分別為（12.06±1.15）%、（9.55±1.00）%、（6.73±0.54）%]均顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。相較于Met-H組，Met-H+740Y-P組大鼠肝組織纖維化程度加重，膠原沉積分數[（14.45±1.37）%]顯著升高（P＜0.05）。

3.7 大鼠肝組織中PI3K/AKT/PDGF信號通路相關蛋白和Caspase-3蛋白表達水平檢測結果

如圖4、表4所示，相較于Control組，Model組大鼠肝組織中PI3K、AKT蛋白磷酸化水平和PDGF、Caspase-3蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）。相較于Model組，Met-L組、Met-M組、Met-H組大鼠肝組織中PI3K、AKT蛋白磷酸化水平和PDGF、Caspase-3蛋白表達水平均顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。相較于Met-H組，Met-H+740Y-P組大鼠肝組織中PI3K、AKT蛋白磷酸化水平和PDGF、Caspase-3蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）。

4 討論

隨著人們飲食和作息等生活方式的改變，非酒精性脂肪性肝病的發病率不斷上升，且并發癥復雜多樣。非酒精性脂肪性肝病經歷了從單純性脂肪變性逐漸發展為NASH的過程，整個過程的發病機制較為復雜，包括脂代謝失調、氧化應激、炎癥反應和腸道微生物群失衡。Met作為抗糖尿病藥物，已被廣泛使用，近年來研究表明，Met不僅具有抗炎作用[14]，還可調控非酒精性脂肪性肝病的脂代謝[15]。由此可見，Met可能對NASH具有改善作用。本研究通過構建NASH大鼠模型發現，Met能有效降低NASH大鼠肝指數，并減輕肝損傷。

體重減輕對于改善NASH至關重要，相關文獻指出，患者體重降低4%左右可以減輕肝脂肪變性現象[16]。TC、TG和LDL-C是血脂的組成部分，也是反映脂代謝的重要指標[17]。AST和ALT是反映肝功能的重要指標，當肝臟發生炎癥反應或氧化應激時，肝細胞中的AST和ALT就會被釋放入血[18]。本研究結果顯示，NASH大鼠體重和血清中TC、TG、LDL-C、AST、ALT水平均顯著升高，提示NASH大鼠脂代謝紊亂、肝功能異常；經Met干預后，大鼠體重和上述指標水平均顯著降低，表明Met能夠調節脂代謝、改善肝損傷。此外，NASH與肝臟中的炎癥反應密切相關，一些炎癥因子可通過作用于肝臟，誘發局部炎癥反應進而導致肝細胞凋亡和肝纖維化[19]。IL-6是炎癥反應的直接促進因子，其可通過促進脂質在肝臟中的集聚影響脂代謝，最終導致脂肪肝形成；TNF-α由巨噬細胞等免疫細胞產生，可直接促進脂質增加，還可加速其他炎癥因子的釋放，最終造成肝組織損傷[19]。本研究結果顯示，Met能有效降低NASH大鼠血清和肝組織中的炎癥因子水平，提示Met具有抗炎作用，這與Feng等[20]的研究結論一致。

研究發現，調節PI3K/AKT信號通路可改善非酒精性脂肪性肝病大鼠的氧化應激和炎癥反應[21]。PDGF在各種細胞反應（包括增殖和肌動蛋白重組）中起著關鍵作用，其可影響肝臟、腎臟等器官的纖維化進展[22]。PDGF的高表達可促進膠原的產生和沉積[23]。Ye等[9]研究指出，PI3K、AKT、PDGF蛋白表達量的變化與脂肪性肝病小鼠的肝脂肪變性和纖維化發展有關。此外抑制肝細胞凋亡可以改善NASH相關的肝損傷，而Caspase-3是凋亡途徑的調節因子[24]。本研究結果顯示，NASH大鼠肝組織中PI3K、AKT蛋白磷酸化水平和PDGF、Caspase-3蛋白表達水平均顯著升高，這提示NASH大鼠肝損傷與PI3K/AKT/PDGF信號通路相關蛋白異常表達有關。經Met干預后，大鼠肝組織中上述指標水平均逆轉，由此推測，Met可能通過抑制PI3K/AKT/PDGF信號通路活性，發揮改善NASH的作用。為了驗證該推測，本研究在高劑量Met干預治療的基礎上，尾靜脈注射PI3K激活劑740Y-P，結果顯示，Met對PI3K/AKT/PDGF信號通路的抑制作用可被740Y-P逆轉。

綜上所述，Met可改善NASH大鼠肝損傷，減輕炎癥反應和肝纖維化，其作用機制可能與抑制PI3K/AKT/PDGF信號通路活性有關。