柱前衍生-HPLC法測定桑枝總生物堿含量

Determination of Total Alkaloids in Mulberry Branch by Pre-column Derivatization and HPLC

YUWei QIN De-song TANG Xue-mei LI Yue-ping ZHOU Chun-hong （Chongqing Food and Drug Inspection and Testing Institute）

Abstract： Objective： To establish a pre-column derivatization and high performance liquid phase method for the determinationof totalalkaloids in mulberry plants.Methods： Samples werecolected with water and injected with 9-chloroformate methyl fluorene derivative reagent by HPLC with the volume of 20μL . The chromatographic analysis was performed at with red spectrum RDC18 5μm 4.6x250mm ） on the column and gradient elution of （citric acid buffer pH4.2 ）（A）-acetonitrile （B） B at 0～22min ， 47.5% Bat ， 37.5% B→37.5% Bat 22.01～38min 37.5% B→75% Bat 75% Bat ）. Theflow rate was 1.5 . Results： In the linear range of ， the linear relationship was good ， and the detection limit was . Conclusion： The method is rapid， simple and sensitive， and can be used for the determination of total alkaloid content in mulberry branch.

Keywords：mulberry branch，total alkaloids of mulberry plant，content determination， antifungal， pre-column derivation，RP-HPLC

桑枝是桑科植物桑（MrousalbaL.）的干燥嫩枝，已被收錄于2020版《中華人民共和國藥典》中的一味中藥，有祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)等作用。我國是蠶桑產(chǎn)業(yè)大國，2023年我國桑園總面積已達75.82萬 。桑枝作為養(yǎng)蠶業(yè)的副產(chǎn)物年產(chǎn)量約為1＼～1.5噸/畝/年，數(shù)量巨大，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，桑枝含有黃酮、多酚和生物堿等多種化學(xué)成分，有降血糖、抗氧化、抗炎、抗癌相關(guān)等作用3-6。2020年，隨著“桑枝總生物堿片”作為我國首個中藥創(chuàng)新藥獲批上市，作為蠶桑產(chǎn)業(yè)廢棄的桑枝將迎來新的契機

1 儀器與試劑

SPD-M20A型高效液相色譜儀（日本島津；DAD檢測器）；S220酸度計（美國梅特勒）；HH-6水浴鍋（常州榮華）；METTLERTOLEDO分析天平XP205型，感量 0.00001g （美國）；METTLERTOLEDO分析天平XP204型，感量 （美國）；SB-800DT超聲儀（寧波新芝）。

1-脫氧野尻霉素對照品（批號C15432816，純度 99.8% ），來自麥克林公司；精氨酸對照品（批號40685-202209，純度 100% ），來自中食品藥品檢驗檢定研究院；9-氯甲酸芬甲酯（麥克林），乙晴為色譜純，其余為分析純。桑枝總生物堿提取物由重慶科瑞南海制藥有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件

采用中譜紅-RDC18 （5μm，4.6 mm 250 mm）"，流動相為：[檸檬酸緩沖液（取檸檬酸三鈉 22g ，加水 800mL 使溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH至4.2]（A）-乙晴（B）梯度洗脫，梯度洗脫程序如下：（0～22min時 75%→47.5%B ，22＼～22.01min時 47.5%B →37.5%B ，22.01＼～38min時 37.5%B→37.5%B ，38＼～38.01min時 37.5%B？75%B ，38.01＼～43min時75%B？75%B ），柱溫 ，流速 1.5mL/min ，進樣量為 20μL.

2.2溶液制備

供試品溶液制備：準確稱取樣品 0.2g （精確至0.0001g ），置于 10mL 量瓶中，加入適量水，超聲30 ，冷卻后用水稀釋至刻度。

對照品溶液的制備：精密稱取1-脫氧野厲霉素對照品適量加水溶解并稀釋 0.1mg/mL 的溶液，搖勻，即得1-脫氧野尻霉素對照品溶液。精密稱取精氨酸對照品適量，加水溶解并稀釋至0.2 mg/mL 的溶液搖勻，即得精氨酸定位用對照溶液。

衍生溶液制備：準確量取 1mL 待測液放入試管中，準確加入 碳酸氫鈉溶液，渦旋，再準確加人 2mL [5mmol/L9-氯甲酸芬甲酯丙酮溶液（臨用新制）］，渦旋均勻，置 水浴中加熱 30min ，立即準確加入 4mL0.1mol/ L醋酸溶液，振搖混勻，濾過。

2.3方法學(xué)驗證

2.3.1專屬性試驗

取2.2供試品溶液及對照品溶液各適量進行衍生化處理，在對照品溶液色譜出峰時間處均無相應(yīng)吸收峰，表明其他成分對其測定無干擾。詳見圖1。

2.3.2線性關(guān)系考察

以濃度為 的1-脫氧野尻霉素為標準溶液，制備含1-脫氧野尻霉素 5，10，50，100，200， 的溶液，按2.2章節(jié)衍生化溶液的制備方法處理，定量取 20μL ，分別注人，以質(zhì)量濃度（X， ）和峰面積（Y）為坐標記錄色譜圖，進行線性回歸。得方程 Y=10117.8X+1345.10 ， r=0.9999 0結(jié)果表明，1-脫氧野尻霉素在 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3檢出限與定量限

取2.3項下系列標準曲線溶液，逐級稀釋，以3倍信噪比（ S/N=3 ）和10倍信噪比（ S/N=10 ）確定方法的檢測限和定量限。結(jié)果：檢測限為 6.28ug/g ，定量限為

2.3.4加標回收率試驗

稱取桑枝提取產(chǎn)物（批號：240926）各18份，每份約 0.2g ，精密加入濃度 1-脫氧野尻霉素對照溶液 300，1000，3000 μ L，平行6份，按2.2.制備得加標溶液，分別測定，計算回收率，結(jié)果見平均回收率低中高依次為 84.5% （ RSD0.4% 、87.2% （ RSD0.5% ）、 91.7% （RSD 0.3% ）。表明方法準確度良好。

精密度：取濃度為 的標準曲線溶液，按2.1條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果表明，RSD為 0.3% ，儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗[8：精密吸取相同的空白加標試液，按2.1的色譜、質(zhì)譜條件，于0、4、8、12、16、20、24h 測定。記錄峰面積并計算RSD。結(jié)果表明， 12h 內(nèi)峰面積無明顯變化，溶液穩(wěn)定性良好。 12～24h 峰面積下降約 3%～5% 。因此，為了保證溶液的穩(wěn)定性，建議樣品在衍生化反應(yīng)后12小時內(nèi)進行測定。

2.3.5耐用性

運用2.1的條件，選擇中譜紅RDC18色譜柱，不同的高效液相色譜儀（島津SPD-M20A型、安捷倫Agilent1260、沃特世Waterse2695）進行分析，結(jié)果1-脫氧野尻霉素對照保留時間為11.4、10.0、10.7min，峰型呈正態(tài)分布；選擇島津SPD-M20A型高效液相色譜儀，不同的色譜柱（中譜紅RD-C18、AgilentExtend-C18、島津INERTSUSTAIN-C18）進行實驗，1-脫氧野尻霉素對照保留時間為 11.4min 、14.6min ， ，分離良好，表明耐用性良好。

3討論

本實驗考察了不同水浴加熱時間（20、30、45min）、不同的水浴溫度（ 25，30，35degree ）對目標組分的回收率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當水浴溫度為 時間 30min 時，回收率最高。考察了不同超聲時長 （20，30，45min ）對目標組分的回收率的影響。結(jié)果表明，超聲處理30分鐘時回收率最高。

對桑枝總生物堿供試樣品中的活性成分進行分析[9-10]，確定主要活性成分為1-脫氧野尻霉素等多羥基哌啶類化合物。多羥基吡咯類，例如，1，4-二脫氧-1，4-亞氨基-D-阿拉伯糖醇。多羥基降托烷類，如calysteginB2、 2α 3β -二羥基降托烷等。通過對該提取物進行實驗，發(fā)現(xiàn)1-脫氧野霉素的峰響應(yīng)良好，峰值高。因此，以1-脫氧野尻霉素衍生物為基礎(chǔ)，計算出受試品中活性成分衍生物的相對保留時間。結(jié)果均在0.5至1.4范圍內(nèi)。因此，選擇相對保留時間在0.5～1.4范圍內(nèi)來計算桑枝總生物堿含量。夏學(xué)軍等9在研究過程中發(fā)現(xiàn)氨基酸也會衍生對測定結(jié)果產(chǎn)生干擾，必須控制精氨酸的含量。本方法用將精氨酸定位用對照品一起衍生，扣除供試品中相應(yīng)保留時間的精氨酸峰，免除干擾。

4結(jié)語

本文建立了桑枝提取物中桑枝總生物堿檢測方法，采用柱前衍生，上高效液相色譜儀進行測試。該方法前處理簡單、試劑耗材簡單易得、靈敏度高、專屬性強、可進行桑枝總生物堿定性定量分析，具有較高的實用價值。

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作者簡介

余為，本科，主管藥師，研究方向為藥品、化妝品檢驗檢測。周春紅，通信作者，碩士研究生，高級工程師，研究方向為食品藥品管理。

（責(zé)任編輯：張瑞洋）