溫脾通絡開竅方抑制AD小鼠神經元壞死性凋亡的作用及機制

摘要目的 基于Z-DNA結合蛋白1（ZBPI）/混合譜系激酶結構域樣蛋白（MLKL）信號通路探討溫脾通絡開竅方對阿爾茨海默?。ˋD）小鼠神經元壞死性凋亡的影響及機制。方法將40只APP/PSI轉基因AD小鼠隨機分為模型組，溫脾通絡開竅方低、高劑量組 （ 1 0 . 4 ， 2 0 . 8 g / k g ，以生藥量計）和鹽酸多奈哌齊組（陽性對照， ，每組10只；并以10只C57BL/6J小鼠作為正常對照組。灌胃給藥，每天1次，連續(xù) 末次給藥 2 4 h 后通過Morris水迷宮實驗評估小鼠學習記憶能力，觀察海馬組織病理形態(tài)，檢測血清中腫瘤壞死因子 ）、白細胞介素4（IL-4）水平，檢測海馬組織中Tau蛋白、淀粉樣前體蛋白（APP）和ZBPI/MLKL信號通路相關蛋白表達水平，檢測海馬組織神經元內磷酸化受體相互作用蛋白激酶3（p-RIPK3）陽性表達及海馬組織中ZBPl mRNA相對表達水平。結果與正常對照組比較，模型組小鼠第 3～5 天的逃避潛伏期均顯著延長（ .Plt;0 . 0 5 ），穿越平臺次數(shù)顯著減少（ P lt; 0.05），海馬組織出現(xiàn)明顯病理性改變;TNF- 水平，APP、p-Tau、ZBP1蛋白表達水平和RIPK1、RIPK3、MLKL蛋白磷酸化水平，p-RIPK3熒光強度和ZBP1mRNA相對表達水平均顯著升高（ ? Plt;0 . 0 5 ；血清中IL-4水平顯著降低 ? Plt;0 . 0 5 ）。與模型組比較，各給藥組小鼠上述指標水平均顯著逆轉 ），海馬組織病理損傷減輕。結論 溫脾通絡開竅方可通過抑制ZBP1/MLKL信號通路，減少AD小鼠神經元壞死性凋亡，抑制炎癥反應，進而改善AD小鼠學習和空間記憶能力。

中圖分類號R285.5 文獻標志碼A 文章編號 1001-0408（2025）09-1046-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.09.05

ABSTRACTOBJECTIVEToinvestigate theeffectsandmechanismof Wenpitongluo kaiqiaoformula（WPTL）against neuronal necroptosis inAlzheimer'sdisease（AD）micebasedonthe Z-DNA binding protein1（ZBP1）/mixed lineage kinase domain-like protein（MLKL）signaling pathway. METHODsForty APP/PS1 transgenic AD mice were randomly divided into model group， WPTL low-dose （WPTL-L） group （ ，calculated by the raw medicine），WPTL high-dose（WPTL-H） group（ 2 0 . 8 g / k g ， calculated by the raw medicine）and donepezil hydrochloride group 3 m g / k g ），with 10 mice in each group；another10 C57BL/6J mice wereselectedasnormalcontrolgroup.Intragastricadministration，onceadayfor3Oconsecutivedays.Twenty-fourhours afterthelastadministration，Moriswatermazetestwasperformedtoevaluate leaingandmemoryabilities；thepathological

morphology ofhippocampal tissueswas observed;the serum levels of tumor necrosis factor- （TNF- α ）and interleukin-4 （IL-4）were determined；the expressions of amyloid precursor protein （APP），Tau protein，and ZBP1/MLKL signaling pathway-related proteinsin hippocampal tissues were detected; thepositive expression of phosphorylated receptor-interacting protein kinase 3（ p -RIPK3）in the neurons of hippocampal tissues and mRNA expression of ZBP1 were measured in

hippocampal tisues.RESULTs Comparedwithnormalcontrolgroup，theescape latencyof miceinmodel groupwasprolonged significantly on day 3 to 5（ ? Plt;0 . 0 5 ），the times of crossing platform reduced significantly （ Plt;0 . 0 5 ），and obvious pathological changes were observed in the hippocampal tissue. The level of TNF- ，the expressions of APP，p-Tau and ZBP1，the phosphorylation levels of RIPK1，RIPK3 and MLKL，the fluorescence intensity of p -RIPK3 as well as the mRNA expression of ZBP1 were significantly increased （Plt;0 . 0 5 ），while the serum level of IL-4 was decreased significantly（ ΔPlt;0 . 0 5 ）. Compared with model group，above indexes were reversed significantly in administration groups P lt; 0 . 0 5 ），and pathological damage of hippocampal tissewas aleviated.CONCLUSIONS WPTLcan inhibit the ZBPl/MLKL signaling pathway，reduceneuronal necroptosis inADmice，andinhibit inflammatoryresponses，therebyimproving learingandspatialmemoryabilities inADmice. KEYWORDSWenpi tongluo kaiqiao formula;Alzheimer’s disease; ZBPl/MLKL signaling pathway;necroptosis

阿爾茨海默?。ˋlzheimer'sdisease，AD）是一種與衰老密切相關的神經退行性疾病，主要表現(xiàn)為進行性的學習記憶能力減退和認知功能退化，是目前最常見的癡呆類型，占所有癡呆類型的 6 0 % ～ 8 0 % 。AD的發(fā)病機制復雜，主要病理特征包括由淀粉樣前體蛋白（amyloidprecursorprotein，APP）代謝異常引發(fā)的 β -淀粉樣蛋白（amyloid β -protein，Aβ）斑塊沉積、Tau蛋白過度磷酸化形成的神經纖維纏結、神經元丟失及神經炎癥反應等[2]。

當前，AD的西醫(yī)治療主要以多奈哌齊等乙酰膽堿酯酶抑制劑和美金剛等 N . 甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑為主，這些藥物可在一定程度上緩解AD癥狀，但無法阻止或逆轉疾病的進展，并且還可能引起不良反應。中藥具有多靶點、多途徑的作用特點，能夠綜合調節(jié)機體的生理功能，減少不良反應的發(fā)生，逐漸成為AD新型治療藥物的研發(fā)熱點。

溫脾通絡開竅方為全國老中醫(yī)藥專家學術繼承指導老師、廣西名老中醫(yī)吳子輝教授治療癡呆的經驗方。本課題組前期研究已證實，該方可通過抑制神經炎癥、保護神經元發(fā)揮對AD的保護作用4。然而，其具體作用機制尚不完全清楚。壞死性凋亡是由受體相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1）/RIPK3/混合譜系激酶結構域樣蛋白（mixedlineagekinasedomain-likeprotein，MLKL）信號通路介導的細胞程序性死亡形式，已被證明與AD的發(fā)生發(fā)展密切相關。有研究表明，Z-DNA結合蛋白1（Z-DNAbindingprotein1，ZBP1）可通過激活RIPK1/RIPK3信號通路，誘導MLKL介導的壞死性凋亡；且有研究表明，ZBP1在AD大鼠海馬神經元的氧化應激和炎癥進程中發(fā)揮了重要作用。鑒于此，本研究擬探討溫脾通絡開竅方是否可通過抑制ZBP1/MLKL信號通路來抑制AD小鼠神經元壞死性調亡，以期為該方治療AD提供更充實的理論基礎。

1材料

1.1主要儀器

本研究所用的主要儀器有：XR-XM101型Morris水迷宮（上海欣軟信息科技有限公司），CFX96型實時熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司），BX43型光學顯微鏡、UC90型成像系統(tǒng)（日本Olympus公司），DYY-4C型電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)（北京六一儀器廠）等。

1.2 主要藥品與試劑

溫脾通絡開竅方由黃芪 益智仁 1 0 g 、三七10g、石菖蒲 何首烏 絞股藍 1 0 g 組成，上述飲片均購自廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院門診中藥房（批號分別為240501、240507、230801、240301、240903、240802）；鹽酸多奈哌齊片（批號211035，規(guī)格 5 m g 購自衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司；蘇木精、伊紅染液均購自珠海貝索生物技術有限公司；腫瘤壞死因子 （tumor ne-crosisfactor- ，TNF- ）、白細胞介素4（interleukin-4，IL-4）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（批號分別為MM-0132M1、MM-0165M1）均購自江蘇酶免實業(yè)有限公司；磷酸化Tau（ser396）[p-Tau（ser396）]、ZBP1、RIPK1、磷酸化RIPK1（ser166）[p-RIPK1（ser166）]、RIPK3抗體（批號分別為RM4630、BD-PN2476、BD-PN1850、BD-PP1467、BD-PP1882）均購自蘇州博奧龍科技有限公司；磷酸化RIPK3（ser277）[p-RIPK3（ser277）]、磷酸化MLKL（ser345）[p-MLKL（ser345）]抗體（貨號分別為HA721428、ET1705-51）均購自杭州華安生物技術有限公司；MLKL抗體、羊抗兔 I g G （ H + L ） 紅色熒光二抗（批號分別為21894、AS039）均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；APP抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗、HRP標記的山羊抗鼠IgG二抗（批號分別為25524-1-ap、60004-1-Ig、SA00001-2、SA00001-1）均購自武漢三鷹生物技術有限公司；實時熒光定量PCR試劑盒、RNA提取試劑、逆轉錄試劑盒（批號分別為Q712、R701-01、R123-

01）均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；PCR引物由南寧捷尼斯生物科技有限公司設計并合成。

1.3 動物

40只6月齡SPF級雄性APP/PS1轉基因AD小鼠（5XFAD小鼠）及10只同背景、同月齡的雄性野生型C57BL/6J小鼠均購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0004]。小鼠購入后，飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學動物實驗中心SPF級動物房，該動物房符合SPF級醫(yī)學實驗動物環(huán)境及設施要求。本研究動物實驗獲廣西中醫(yī)藥大學科學實驗中心動物倫理委員會審核通過（倫理號：DW20220215-053-02）。

2 方法

2.1溫脾通絡開竅方藥液的制備

按溫脾通絡開竅方組成稱取方中各飲片，置于燒瓶中，加水 2 0 0 0 m L ，煎煮 次；過濾，合并3次濾液，于 水浴中減壓濃縮至 2 . 0 8 g / m L （以生藥量計）；置于 下保存，備用。

2.2 分組與給藥

將40只5XFAD小鼠和10只C57BL/6J正常小鼠適應性喂養(yǎng)1周。然后將5XFAD小鼠隨機分為模型組（MOD組），溫脾通絡開竅方低、高劑量組（WPTL-L組、WPTL-H組），鹽酸多奈哌齊組（陽性對照，DH組），每組10只；并將10只C57BL/6J小鼠作為正常對照組（NC組）。WPTL-L組、WPTL-H組小鼠分別按 （以生藥量計，根據人與小鼠體表面積換算，分別為1、2倍臨床等效劑量）灌胃溫脾通絡開竅方藥液；DH組小鼠按 3 m g / k g 灌胃鹽酸多奈哌齊（根據文獻[8]及預實驗結果確定）;NC組和MOD組小鼠灌胃等體積生理鹽水。每天給藥1次，連續(xù) 3 0 d 。

2.3 行為學檢測

末次給藥 2 4 h 后進行水迷宮實驗以評估小鼠的學習及空間記憶能力。將水迷宮劃分為4個象限，平臺置于第三象限，注水沒過平臺。前5d進行定位航行實驗，分別將小鼠依次從4個象限放人，小鼠找到平臺則停正實驗，記錄每天的逃避潛伏期；若小鼠60s內未找到平臺，則引導其至平臺并停留10s，逃避潛伏期按60s計。第6天進行空間探索實驗，撤走平臺記錄每組小鼠 6 0 s 內穿越平臺次數(shù)。

2.4 樣本制備

水迷宮實驗結束后，小鼠經 2 0 % 烏拉坦麻醉，腹主動脈取血。血樣以 離心 1 5 m i n ，取上清液于 下儲存，備用。取血后處死小鼠，每組隨機選取7只剝離其海馬組織，并于 下保存，用于實時熒光定量PCR（每組3只）和Westernblot檢測（每組4只）；快速取出每組剩余3只小鼠的腦組織，并置于 4 % 多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋后切片（厚度約 ），用于蘇木精-伊紅（HE）染色及組織免疫熒光化學染色分析。

2.5小鼠海馬組織病理形態(tài)學觀察

采用HE染色法觀察。取“2.4”項下小鼠腦組織石蠟切片，經脫蠟、水洗后，行HE染色，顯微鏡下觀察其海馬組織病理形態(tài)學變化并拍照，采集圖像并分析。

2.6 小鼠血清中TNF- 水平檢測

采用ELISA法檢測。取“2.4\"項下血清樣品，室溫解凍，按照ELISA試劑盒說明書步驟操作，采用酶標儀于 4 5 0 n m 波長處檢測小鼠血清中TNF- ? α ? I L - 4 水平。

2.7小鼠海馬組織中ZBP1/MLKL信號通路相關蛋白表達檢測

采用Westernblot法檢測。取“2.4\"項下各組凍存的小鼠海馬組織適量，提取組織中總蛋白，測定總蛋白濃度后作變性處理，制備蛋白上樣樣品，隨后進行電泳（電壓 ，電泳時間 分離，并將分離的蛋白轉移（電流 ，轉膜時間 到PVDF膜上，在室溫下用 5 % 脫脂牛奶封閉 。加入GAPDH、APP、p-Tau、ZBP1、p-RIPK1、RIPK1、p-RIPK3、RIPK3、p-MLKL、MLKL一抗（稀釋比例分別為 于 下孵育過夜；洗膜后，加入相應二抗（稀釋比例均為 ，于室溫下孵育 1 . 5 h ；洗膜后顯影，成像。使用ImageJ軟件分析各蛋白條帶的灰度值，以APP、p-Tau、ZBP1與內參蛋白（GAPDH）條帶的灰度值比值表示APP、p-Tau、ZBP1蛋白的表達水平，以p-RIPK1與RIPK1、p-RIPK3與RIPK3、p-MLKL與MLKL條帶的灰度值比值表示RIPK1、RIPK3和MLKL蛋白的磷酸化水平。

2.8小鼠海馬組織神經元內p-RIPK3陽性表達檢測

采用免疫熒光染色法檢測。取“2.4\"項下小鼠腦組織切片，經脫水、漂洗、封閉后與p-RIPK3抗體（稀釋比例為1：100）孵育過夜，再使用羊抗兔IgG（ H + L 紅色熒光二抗（稀釋比例為1：200）進行孵育；用DAPI染色細胞核，室溫下孵育 5 ～ 1 0 m i n ，以標記核位置。對樣本進行封片，并使用顯微鏡觀察和成像。以紅色熒光強度反映p-RIPK3陽性表達水平高低，采用ImageJ軟件對陽性表達蛋白的熒光強度進行分析。

2.9 小鼠海馬組織中ZBP1mRNA水平檢測

采用實時熒光定量PCR法檢測。取各組小鼠凍存的海馬組織適量，提取組織中總mRNA，分析純度與濃度后，將總RNA逆轉錄合成cDNA并進行PCR擴增。PCR反應體系包括：cDNA模板 1 μ L ，SYBR GreenMasterMix 5 μ L ，正、反向引物各 0 . 4 μ L ，加無核酸酶水至 2 0 μ L 。PCR擴增條件如下： 預變性 變性 1 0 s 退火/延伸 3 0 s ，共40個循環(huán)。以GAPDH為內參，采用 法計算ZBP1mRNA的相對表達水平，結果以NC組為參照進行歸一化處理。PCR引物序列及產物大小見表1。

2.10 統(tǒng)計學方法

采用SPSS25.0軟件對數(shù)據進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以 表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊時組間兩兩比較采用Games-Howell檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以 表示，組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。檢驗水準 α=0 . 0 5 。

3結果

3.1小鼠學習及空間記憶能力考察結果

與NC組比較，MOD組小鼠第 3～5 天的逃避潛伏期均顯著延長（ （ P lt; 0 . 0 5 ） ，穿越平臺次數(shù)顯著減少（ P lt; 0.05）；與MOD組比較，各藥物組小鼠第 3～5 天的逃避潛伏期均顯著縮短 ? Plt;0 . 0 5 ），穿越平臺次數(shù)均顯著增加 ? lt; 0 . 0 5 ）。結果見表2。

3.2小鼠海馬組織病理形態(tài)學觀察結果

NC組小鼠海馬組織結構正常，CA1區(qū)錐體細胞（藍色箭頭所指）排列整齊，胞核飽滿，核仁清晰，染色均勻；

未發(fā)現(xiàn)細胞凋亡及壞死情況，無炎癥細胞浸潤。與NC組比較，MOD組小鼠海馬組織損傷較嚴重，CA1區(qū)錐體排列紊亂、染色不均；錐體細胞較少，大量神經元固縮、深染（黃色箭頭所指），甚至凋亡、消失。與MOD組比較，WPTL-L組小鼠海馬組織損傷有所減輕，CA1區(qū)錐體細胞排列相對整齊，部分神經元固縮、深染；WPTL-H組和DH組小鼠海馬組織損傷明顯減輕，CA1區(qū)錐體細胞排列整齊，僅少量神經元固縮、深染。結果見圖1。

3.3小鼠血清中TNF- 水平測定結果

與NC組比較，MOD組小鼠血清中TNF 水平顯著升高 （ Plt;0 . 0 5 ，IL-4水平顯著降低（ Plt;0 . 0 5 ）。與MOD組比較，各藥物組小鼠血清中TNF- α 水平均顯著降低中 （ Plt;0 . 0 5 ） ，IL-4水平均顯著升高 （ Plt;0 . 0 5 。結果見表3。

3.4小鼠海馬組織中ZBP1/MLKL信號通路相關蛋白表達檢測結果

與NC組比較，MOD組小鼠海馬組織中APP、p-Tau、ZBP1蛋白表達水平以及RIPK1、RIPK3、MLKL蛋白磷酸化水平均顯著升高 （ Plt;0 . 0 5 ） ；與MOD組比較，各藥物組小鼠海馬組織中上述指標水平均顯著降低中 ? Plt;0 . 0 5 。結果見圖2、表4。

3.5小鼠海馬組織神經元內 p -RIPK3陽性染色檢測結果

與NC組 0 . 2 4 ± 0 . 0 7 ， n=3 比較，MOD組小鼠海馬組織神經元內p-RIPK3熒光強度 （ 3 . 5 2 ± 0 . 3 7 ， n = 3 ） 顯著增強（ ）。與MOD組比較，WPTL-L組、WPTL-H組和DH組小鼠海馬組織神經元內 p -RIPK3熒光強度（分別為 1 . 6 5 ± 0 . 0 9 ， 0 . 6 7 ± 0 . 0 9 ， 0 . 3 9 ± 0 . 0 7 ， n = 3 ） 均顯著減弱（ ? Plt;0 . 0 5 ）。結果見圖3。

3.6小鼠海馬組織中ZBP1mRNA水平測定結果

與NC組 （ 1 . 0 1 ± 0 . 2 0 ， n = 3 ） 比較，MOD組小鼠海馬組織中ZBP1mRNA相對表達水平 （ 2 . 9 5 ± 0 . 5 8 ， n = 3 ） 顯著升高 （ Plt;0 . 0 5 ）；與MOD組比較，WPTL-L組、WPTL-H組和DH組小鼠海馬組織中ZBP1mRNA相對表達水平（分別為 2 . 1 6 ± 0 . 2 8 ， 1 . 4 2 ± 0 . 4 2 ， 1 . 5 1 ± 0 . 2 0 ， n = 3 ） 均顯著降低（ Plt;0 . 0 5 ）。

4討論

AD屬中醫(yī)學“健忘”“癡呆\"范疇。本課題組認為脾胃虛弱是AD發(fā)病的根本原因，痰濁瘀血阻竅是AD的關鍵病機，并針對AD病機演變過程中的關鍵環(huán)節(jié)，提出了“從脾論治癡呆”的觀點，創(chuàng)立了“溫脾通絡開竅”治則，驗之于臨床療效頗佳。本研究中Morris水迷宮實驗結果顯示，溫脾通絡開竅方干預后AD小鼠的逃避潛伏期顯著縮短、穿越平臺次數(shù)顯著增加；HE染色結果顯示，溫脾通絡開竅方干預后AD小鼠海馬CA1區(qū)神經元固縮和深染顯著減少。APP在淀粉樣代謝途徑中可剪切形成Aβ，而Aβ沉積與Tau蛋白過度磷酸化形成神經纖維纏結是AD的主要病理特征[2。本研究Westernblot實驗結果顯示，相較于NC組，MOD組小鼠海馬組織中APP及p-Tau蛋白表達增強；而給予溫脾通絡開竅方干預后，可在一定程度上抑制AD小鼠腦組織中APP蛋白的表達及Tau蛋白的磷酸化。這說明溫脾通絡開竅方能夠調節(jié)APP及p-Tau這2個關鍵病理蛋白的表達，減輕海馬神經元損傷和病理表現(xiàn)，有效改善AD小鼠的認知功能。

以小膠質細胞數(shù)量增加和促炎細胞因子水平升高為特征的慢性神經炎癥，被認為是AD的病理標志之_[10]。當受到TNF- 等炎癥介質的刺激時，RIPK1會發(fā)生磷酸化并招募RIPK3形成復合體，隨后，磷酸化的RIPK3進一步激活MLKL，啟動損傷相關分子模式，并釋放多種炎癥因子，如TNF- IL-1β和IL-6，這些炎癥因子會提高周圍環(huán)境中警報信號水平，吸引巨噬細胞聚集到受影響的區(qū)域，從而加劇炎癥反應。研究顯示，ZBP1可通過識別病毒Z型雙鏈RNA并招募RIPK3激活MLKL，從而觸發(fā)感染細胞的壞死性凋亡；沉默AD大鼠神經元細胞中ZBP1可顯著減少其神經元損傷、氧化應激和炎癥。另有研究發(fā)現(xiàn)，RIPK1、RIPK3、MLKL等蛋白的上調與AD患者神經元壞死性凋亡的進展密切相關[13-15]。本研究結果顯示，溫脾通絡開竅方能夠顯著抑制AD小鼠海馬組織中ZBP1mRNA及其蛋白表達，降低RIPK1、RIPK3及MLKL蛋白磷酸化水平，同時降低血清中促炎因子TNF- 水平，升高抗炎因子IL-4水平。

綜上所述，溫脾通絡開竅方可通過抑制ZBP1/MLKL信號通路，減少AD小鼠神經元壞死性凋亡發(fā)生，抑制炎癥反應，進而改善AD小鼠學習和空間記憶能力。然而，本研究仍存在一定局限性，如未采用ZBP1/MLKL信號通路的抑制劑和激動劑進行通路驗證等，后續(xù)本課題組將設計相關實驗進行深入研究。

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（編輯：林靜）