鉤苞大丁草的HPLC指紋圖譜建立及含量測定

摘要目的 建立鉤苞大丁草的指紋圖譜及其11種成分的含量測定方法。方法 采用高效液相色譜（HPLC）法，根據《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》建立13批（編號 ）鉤苞大丁草的指紋圖譜并進行相似度評價，同時進行共有峰指認；采用SPSS 25.0軟件和SIMCA14.1軟件進行分層聚類分析（HCA）、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）;采用HPLC法測定樣品中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、3，8-二羥基-4-甲氧基-5-羧基-香豆精、咖啡酸、3-羥基-4-甲氧基-5-羧基-香豆精、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、異綠原酸A、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、異綠原酸C、花椒毒素11種成分的含量。結果13批鉤苞大丁草的HPLC指紋圖譜相似度為 0 . 8 0 1～0 . 9 9 4 ;從中共標定了38個共有峰，并指認了其中13個共有峰。HCA、PCA結果均顯示， S 1～S 5. S 7 聚為一類，S6聚為一類，S8聚為一類，S9、S11聚為一類， 聚為一類；OPLS-DA結果顯示，峰7（綠原酸）峰21（異綠原酸A）、峰26（花椒毒素）峰19（異綠原酸B）、峰33、峰13、峰23（異綠原酸C）峰2（新綠原酸）峰17（木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷）的變量重要性投影值均大于1。上述11種成分在各自檢測質量濃度范圍內線性關系均良好（r均大于0.999）；精密度、重復性、穩定性試驗的RSD均不大于 2 % （n均為6）；平均加樣回收率為 9 2 . 5 4 % ～ 1 0 5 . 5 5 % ，RSD為 0 . 8 3 % ～ 1 . 9 3 % C n = 6 ；平均含量分別為 結論本研究建立的HPLC指紋圖譜和含量測定方法簡單、準確、穩定，可為鉤苞大丁草藥材的質量控制提供依據。花椒毒素、綠原酸、異綠原酸A、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、異綠原酸C、新綠原酸可作為鉤苞大丁草藥材的質量標志物。

中圖分類號 R917；R284.1 文獻標志碼A 文章編號1001-0408（2025）09-1052-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.09.06

ABSTRACTOBJECTIVEToestablish thefingerprintofGerberadelavayiandthemethodsforthecontentdeterminationof11 components inG.delavayi.METHODsHigh-performance liquidchromatography（HPLC）wasadoptedtoestablish thefingerprints of13batchesofG.delavayi（No.S1-S13），andthesimilaritieswereevaluatedacordingtoSimilarityEvaluationSystemof ChromatographicFingerprintofTCM（2O12edition），whilethecommonpeakswereidentified.Hierarchicalclusteringanalysis （HCA），principalcomponentanalysis（PCA）andorthogonal partialleastsquare-discriminantanalysis（OPLS-DA）werecaried outbyusing SPSs25.0softwareandSIMCA14.1software.Thecontentsof neochlorogenicacid，chlorogenicacid， cryptochlorogencid，-ddo-eo-Hbaarboxylccidaecci，roy

oxo-2H-1-benzopyran-5-carboxylicacid，luteolin-7-O- -Dglucoside，isochlorogenic acidA，apigenin-7-O -D-glucoside， isochlorogenic acid C and xanthotoxin were determined by HPLC.RESULTS The similarities in HPLC fingerprint of 13 batches of G. delavayi were O.801-0.994； a total of 38 common peaks were identified and 13 common peaks were identified.TheresultsofHCAshowedthatS1-S5andS7were

clusteredintoonegroup，S6intoonecategory，S8intoonecategoryS9andS1lintoonecategory，S10，S12andS13intoone category，andtheresultsofPCAwereconsistentwiththem.TheresultsofOPLS-DAshowedthatvariableimportancevalues for theprojectionofpeak7（chlorogenicacid），peak 21（isochlorogenicacidA），peak 26（xanthotoxin），peak19（isochlorogenic acid B），peak 33，peak13，peak 23（isochlorogenicacid C），peak 2（new chlorogenic acid），peak17（luteolin-7-O -Dglucoside）weregreaterthan1.Theabove11componentshadgoodlinearityintheirrespectivedetectionconcentrationranges（ r was greater than 0.999）. RSDs of precision，repeatability，and stability tests were not more than 2 % （ n=6 ）. The average recovery rates were 9 2 . 5 4 % - 1 0 5 . 5 5 % ，and the RSDs were 0 . 8 3 % 1 . 9 3 % （ n = 6 ）.The average contents of11 componentswere 0.744，5.014， 0.646，0.431，0.069，0.582，0.979，2.754，0.157，1.284 and 2 . 9 4 3 m g / g ， respectively. CONCLUSIONS The constructed HPLC fingerprintandcontentdeterminationmethodsaresimple，accurateandstable，whichcanprovidereferenceforquaitycontrolof G delavayi.Xanthotoxin，chlorogenic acid，isochlorogenic acid A，luteolin-7-O- β -D-glucoside，isochlorogenic acid C and new chlorogenic acid can be used as markers for G. delavayi.

KEYWORDsGerbera delavayi；high-performance liquid chromatographymethod；fingerprint；content determination；chemical pattern recognition

鉤苞大丁草GerberadelavayiFranch.是菊科大丁草屬多年生草本植物，主要分布在我國云南、四川南部及越南北部，全草入藥。其味辛、微苦，性平，具有清熱解毒、利濕消腫和化瘀止血等作用，可用于治療肺熱咳嗽、濕熱下痢、熱淋等癥。《哀牢本草》記載，鉤苞大丁草具有活血祛瘀、接骨續筋的作用，可用于治療四肢骨折及瘀血腫痛2。該藥的質量標準在《云南省中藥材標準（2005年版·第6冊·彝族藥Ⅲ）》中有所收載，但僅有水分、總灰分和酸不溶性灰分檢查項。目前，有關鉤苞大丁草的研究主要包括化學成分的提取分離4一、薄層鑒別、基因測序分析、纖維特性分析、花粉萌發與貯藏特性分析[等，而關于其質量控制的相關研究較少。

高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜作為一種控制傳統藥材、天然藥物質量的有效方法，可以實現多成分的快速檢測；同時，指紋圖譜可用于評估中藥質量的一致性，其結合化學模式識別分析方法還可有效評價中藥的整體質量[2]。基于此，本研究擬采用HPLC法建立13批鉤苞大丁草的指紋圖譜并進行相似度評價，結合分層聚類分析（hierarchicalclusteringanalysis，HCA）、主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA）正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least square-discriminantanalysis，OPLS-DA）等化學模式識別方法對不同批次藥材的質量差異進行分析，并對該藥材中含量較高且活性較強的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、3，8-二羥基-4-甲氧基-5-羧基-香豆精（后文簡寫為“3，8-Dhmcc”）、咖啡酸、3-羥基-4-甲氧基-5-羧基-香豆精、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、異綠原酸A、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、異綠原酸C、花椒毒素的含量進行測定，旨在為鉤苞大丁草藥材的質量評價奠定基礎，為其質量標準的完善及進一步開發利用提供參考。

1材料

1.1主要儀器

本研究所用主要儀器包括UItiMate3000型HPLC儀、MultifugeX3R型高速冷凍離心機（美國ThermoFisherScientific公司），KQ-5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），EL204型電子天平[梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司]，WP-UP-IV-10型超純水機（四川沃特爾科技發展有限公司）等。

1.2主要藥品與試劑

新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷對照品（批號分別為wkq22080406、wkq23022707、wkq22072103、wkq21011104、wkq23010903、wkq23041713、wkq23011-207、wkq23061211，純度均不低于 9 8 % ）均購自四川省維克奇生物科技有限公司；木犀草素-7-O ? β -D-葡萄糖苷、花椒毒素、異野漆樹苷、3-羥基-4-甲氧基-5-羧基-香豆精、3，8-Dhmcc對照品（批號分別為20220523、20220618、20220911、20220924、20220715）均為本課題組自行分離純化而得，純度均不低于 9 8 % ；乙腈、磷酸為色譜純，其他試劑均為分析純。

13批鉤苞大丁草藥材均采收自云南省，經貴州醫科大學藥學院劉春花副教授鑒定，均為菊科植物鉤苞大丁草G.delavayiFranch.的干燥全草，具體信息見表1。

2 方法與結果

2.1 HPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件

采用ACEExcel5 -PFP（ ，5μ m 色譜柱，以乙腈（A） . 0 . 2 % 磷酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫 ， 1 7 % A ： 4 5 ～ 5 5 m i n ， ：5 5 ～ 7 0 m i n ; 7 0 ～8 0 m i n 3 5 % A?6 0 % A ： ！柱溫為 ;檢測波長為 3 3 0 n m ;流速為 1 . 0 m L / m i n 進樣量為 5 μ L 。

2.1.2對照品溶液的制備

分別精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、3，8-Dhmcc、咖啡酸、3-羥基-4-甲氧基-5-羧基-香豆精、木犀草素-7-O ? β -D-葡萄糖苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、芹菜素-7-O -D-葡萄糖苷、異野漆樹苷、花椒毒素對照品適量，置于不同容量瓶中，以 70 % 甲醇溶解并稀釋，制成質量濃度分別為 0 . 5 0 2 ， 1 . 0 0 4 ， 0 . 4 9 6 ， 1 . 1 5 1" （200 . 9 7 2 m g / m L 的對照品儲備液。分別精密吸取上述13種對照品儲備液適量，置于同一 1 0 m L 容量瓶中，加入70 % 甲醇稀釋并定容，搖勻，制得上述成分質量濃度分別為9.79、57.80、9.97、21.68、3.47、20.23、68.97、13.61、50.35、 的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

取鉤苞大丁草藥材樣品，粉碎。取粉末（過三號篩，下同） 1 g ，置于 5 0 m L 具塞錐形瓶中，精密稱定，加入7 0 % 甲醇 2 5 m L ，稱質量；超聲（功率 2 0 0 W ，頻率40k H z 提取 ，放冷，再次稱質量；用 70 % 甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續濾液適量，以 1 2 0 0 0 r / m i n 離心 1 0 m i n ，取上清液，即得。

2.1.4 精密度試驗

取鉤苞大丁草藥材粉末（S1）1g，按\"2.1.3\"項下方法制備供試品溶液，按\"2.1.1\"項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄色譜圖。以21號峰（分離度較好，保留時間穩定且適中）為參照，計算得各共有峰相對保留時間的RSD為 0 . 0 1 % ～ 0 . 6 9 % 0 n=6 、相對峰面積的RSD為0 . 2 6 % ～ 2 . 8 9 % （ n = 6 ） ，表明該方法精密度良好。

2.1.5 重復性試驗

取鉤苞大丁草藥材粉末（S1） 1 g ，共6份，分別按“2.1.3\"項下方法制備供試品溶液，按\"2.1.1\"項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以21號峰為參照，計算得各共有峰相對保留時間的RSD為 0 . 0 2 % ～ 0 . 4 2 % （ n=6 ） 、相對峰面積的RSD為 0 . 7 8 % ～ 2 . 9 4 % （ n = 6 ） ，表明該方法重復性良好。

2.1.6 穩定性試驗

取鉤苞大丁草藥材粉末（S1） 1 g ，按\"2.1.3\"項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24h時按“2.1.1\"項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以21號峰為參照，計算得各共有峰相對保留時間的RSD為 0 . 0 1 % ～ 0 . 6 9 % （ n = 6 ） 、相對峰面積的RSD為 0 . 5 7 % ～

2 . 7 6 % （ n = 6 ） ，表明該供試品溶液在室溫下放置 2 4 h 內穩定性好。

2.1.7 指紋圖譜的建立與相似度評價

取13批鉤苞大丁草藥材粉末各 1 g ，分別按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1\"項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將所得圖譜導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》，以樣品S1的色譜圖為參照圖譜，設置時間窗寬度為 0 . 1 m i n ，經多點校正后進行Mark峰匹配，生成13批鉤苞大丁草藥材的疊加指紋圖譜，并采用中位數法生成對照指紋圖譜R，詳見圖1。結果顯示，13批樣品共標定了38個共有峰。經與混合對照品溶液圖譜（圖2）比對，指認了其中13個共有峰，分別為新綠原酸（峰2）綠原酸（峰7）隱綠原酸（峰8）3，8-Dhmcc（峰9）咖啡酸（峰10）、3-羥基-4-甲氧基-5-羧基-香豆精（峰12）木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷（峰17）異綠原酸B（峰19）、異野漆樹苷（峰20）異綠原酸A（峰21）、芹菜素-7-0 ? β -D-葡萄糖苷（峰22）異綠原酸C（峰23）、花椒毒素（峰26）。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》對13批樣品進行相似度評價，得 的相似度分別為0.834、0.801、0.942、0.852、0.934、0.985、0.956、0.855、0.994、0.988、0.967、0.957、0.966，說明13批鉤苞大丁草藥材的相似度良好，整體化學成分基本一致。

2.2 化學模式識別分析

2.2.1 HCA

將13批鉤苞大丁草藥材中38個共有峰的峰面積導入SPSS25.0軟件，采用組間連接法進行HCA。結果（圖3）顯示，當平方歐氏距離為10時，13批鉤苞大丁草藥材可被分為5類： 聚為一類，S6聚為一類，S8聚為一類，S9、S11聚為一類， 聚為一類。這表明不同批次的藥材質量具有一定差異。

2.2.2 PCA

將13批鉤苞大丁草藥材中38個共有峰的峰面積導入SIMCA14.1軟件，建立PCA模型。結果（圖4）顯示，13批鉤苞大丁草藥材可被分為5類，與HCA結果一致。

圖2混合對照品溶液的HPLC圖

2.2.3 OPLS-DA

在PCA基礎上進一步進行OPLS-DA，采用SIMCA14.1軟件繪制OPLS-DA的變量重要性投影（variableim-portancefortheprojection，VIP）得分圖（圖5）。以VIP值 gt;1 為閾值[13]，篩選出了9個差異化合物，對應的共有峰依次為峰7（綠原酸）峰21（異綠原酸A）峰26（花椒毒素）峰19（異綠原酸B）峰33、峰13、峰23（異綠原酸C）、峰2（新綠原酸）、峰17（木犀草素-7-0 ?? β -D-葡萄糖苷）。由此推測，上述9個共有峰所代表的化學成分可能是導致13批鉤苞大丁草藥材之間質量差異的主要標志物。

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件

采用ACEExcel5 -PFP（ ，5μ m 色譜柱，以乙腈（A） . 0 . 1 % 磷酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫 1 7 % A 2 5 ～2 8 m i n 1 7 % A 2 8 ～ 5 0 m i n

5 0 ～5 5 m i n 5 5 ～ 6 5 m i n ： ）；柱溫為 ;檢測波長為 ;流速為 1 m L/ m i n ;進樣量為 5 μ L 。

2.3.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、3，8-Dhmcc對照品適量，以 5 0 % 乙醇定容至5mL容量瓶中，制成質量濃度分別為 1 . 9 5 2 、 1 . 2 0 9 、 2 . 0 5 2 2 . 0 5 0 ， 0 . 9 9 0 m g / m L 的單一成分對照品儲備液；分別精密稱取新綠原酸、咖啡酸、3-羥基-4-甲氧基-5-羧基-香豆精、木犀草素-7-O ? β -D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖昔和花椒毒素對照品適量，以 5 0 % 乙醇定容至 1 0 m L 容量瓶中，制成質量濃度分別為 0 . 5 0 2 、 0 . 5 0 3 、 0 . 4 9 6 1 . 0 3 9 ， 0 . 5 6 1 ， 2 . 0 5 8 m g / m L 的單一成分對照品儲備液。分別精密吸取上述11種單一成分對照品儲備液適量，置于同一 1 0 m L 容量瓶中，加 5 0 % 乙醇定容，得綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、3，8-Dhmcc、新綠原酸、咖啡酸、3-羥基-4-甲氧基-5-羧基-香豆精、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷和花椒毒素質量濃度分別為 0 . 1 7 3 ， 0 . 0 3 3 ， 0 . 1 6 4 ， 0 . 0 9 2 ， 0 . 0 7 7 ， 0 . 0 3 4 ， 0 . 0 1 1 ， 0 . 0 7 8 ， 0 . 2 1 0 ， 0 . 0 3 3 ， 0 . 2 9 0 m g / m L 的混合對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備

取鉤苞大丁草藥材粉末 1 g ，置于 5 0 m L 具塞錐形瓶中，精密稱定，加入 5 0 % 乙醇 2 5 m L ，稱定質量；加熱回流 3 0 m i n ，放冷，用 5 0 % 乙醇補足減失的質量，搖勻，過濾。取續濾液適量，以 離心 1 0 m i n ，取上清液作為供試品溶液A；再精密吸取上述續濾液 2 . 5 m L 至 1 0 m L 容量瓶中，以 5 0 % 乙醇稀釋至刻度，搖勻，以 離心 1 0 m i n ，取上清液作為供試品溶液B。

2.3.4 專屬性考察

分別吸取“2.3.2\"和“2.3.3”項下混合對照品溶液、供試品溶液 A 5 μ L ，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示，供試品溶液A與混合對照品溶液圖譜相同保留時間處有相應的色譜峰，各待測成分與相鄰色譜峰間的分離度均大于1.5，且空白溶液（ 5 0 % 乙醇）不干擾測定，說明該方法專屬性良好（圖6，空白溶液色譜圖略）。

2.3.5 線性關系考察

分別取“2.3.2”項下混合對照品溶液 2 . 0 ， 1 . 2 ， 0 . 6 ， 至 2 m L 容量瓶中，加 5 0 % 乙醇定容，制成系列混合對照品溶液。取上述系列混合對照品溶液各適量，按“2.3.1\"項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以各成分的質量濃度為橫坐標 （ X） 、峰面積為縱坐標 （ Y ） 進行線性回歸，結果見表2。由表2可知，11個成分在各自進樣質量濃度范圍內的線性關系均良好（r均大于0.999）。

2.3.6 精密度試驗

取鉤苞大丁草藥材粉末（S1）1g，按\"2.3.3\"項下方法制備供試品溶液A、B，分別按“2.3.1\"項下色譜條件重復進樣測定6次，記錄峰面積。結果顯示，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、3，8-Dhmcc、咖啡酸、3-羥基-4-甲氧基-5-羧基-香豆精、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、異綠原酸A、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、異綠原酸C、花椒毒素11個成分峰面積的RSD分別為 0 . 1 9 % ， 0 . 0 7 % ， 0 . 2 1 % 0 . 1 7 % ！ 0 . 1 9 % 、 0 . 3 9 % 人 0 . 2 4 % 、 0 . 0 5 % ！ 1 . 4 7 % ！ 0 . 3 3 % 、0 . 1 2 % （ n=6 ） ，表明該方法精密度良好。

2.3.7 重復性試驗

取鉤苞大丁草藥材粉末（S1）1g，共6份，分別按“2.3.3\"項下方法制備供試品溶液A、B，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按外標法計算樣品含量。結果顯示，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、3，8-Dhmcc、咖啡酸、3-羥基-4-甲氧基-5-羧基-香豆精、木犀草素-7-O-β -D-葡萄糖苷、異綠原酸A、芹菜素-7-O ? β -D-葡萄糖苷、異綠原酸C、花椒毒素11個成分平均含量的RSD分別為1 . 1 7 % 、 1 . 4 7 % 、 1 . 0 0 % 、 1 . 5 8 % 、 1 . 1 2 % 、 1 . 5 7 % 、 1 . 8 3 % 、1 . 3 5 % ， 1 . 3 9 % ， 1 . 2 3 % ， 1 . 4 5 % （ n = 6 ） ，表明該方法重復性良好。

2.3.8 穩定性試驗

取鉤苞大丁草藥材粉末 ，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液A、B，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24h時按\"2.3.1\"項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、3，8-Dhmcc、咖啡酸、3-羥基-4-甲氧基-5-羧基-香豆精、木犀草素-7-O ? β -D-葡萄糖苷、異綠原酸A、芹菜素-7-O ? β -D-葡萄糖苷、異綠原酸C、花椒毒素11個成分峰面積的RSD分別為 0 . 3 8 % 0 . 3 3 % 0 . 3 3 % 0 . 0 . 4 7 % 1 . 9 6 % 1 . 9 7 % 0 . 4 8 % 0 . 2 9 % 0 . 3 9 % 0 . 2 0 % 0 . 3 4 % （ n = 6 ） ，表明上述供試品溶液A、B在室溫下放置 2 4 h 內穩定性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗

取已知含量的鉤苞大丁草藥材粉末（S1） ，精密稱定，共6份，分別置于 5 0 m L 具塞錐形瓶中，分別加入新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、3，8-Dhmcc、咖啡酸、3-羥基-4-甲氧基-5-羧基-香豆精、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、異綠原酸A、異綠原酸C、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、花椒毒素對照品 0 . 0 8 5 ， 0 . 4 3 9 ， 0 . 0 8 5 ， 0 . 1 8 8 ， 0 . 0 2 8 ， 0 . 1 7 6 ， 0 . 5 5 1 ， 0 . 4 1 0 ， 0 . 0 9 0 ， 0 . 2 3 6 ， 0 . 7 0 0 m g ，按“2.3.3\"項下方法制備供試品溶液A、B，分別按“2.3.1\"項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，采用外標法計算樣品含量并計算加樣回收率。結果顯示，上述11個成分的平均加樣回收率分別為 9 8 . 6 6 % 、 1 0 0 . 7 8 % ！ 1 0 1 . 4 1 % ！ 9 7 . 9 6 % / 9 6 . 6 5 % 、9 5 . 5 6 % / 9 2 . 5 4 % 、 1 0 0 . 9 0 % 、 1 0 5 . 5 5 % 、 9 6 . 0 6 % / 1 0 0 . 9 7 % ，RSD分別為 （201 . 0 1 % 1 . 1 0 % 0 . 9 7 % 1 . 6 3 % 0 . 9 0 % 1 n = 6 ） ，表明該方法準確度良好。

2.3.10 樣品含量測定

取13批鉤苞大丁草藥材粉末各 1 g ，精密稱定，分別按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液A、B，再分別按“2.3.1\"項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，采用外標法計算樣品中各成分含量。各樣品平行測定2次，取平均值。結果見表3。

3討論

3.1色譜條件的優化及供試品溶液制備方法的選擇

本研究通過對供試品溶液進行全波長掃描，選擇了 作為最佳檢測波長。此外，本研究對不同流動相（甲醇-水、乙腈 . 0 . 1 % 磷酸溶液、乙腈 . 0 . 2 % 磷酸溶液、甲醇 . 0 . 1 % 磷酸溶液）進行了考察，發現在含量測定過程中以乙腈 . 0 . 1 % 磷酸溶液為流動相時，各色譜峰的峰形較為尖銳、對稱，雜質干擾較少，且出峰時間穩定；在指紋圖譜分析過程中以乙腈 . 0 . 2 % 磷酸溶液為流動相時，各色譜峰的分離度均較好。

本研究以色譜峰數量、峰形、分離度及雜質多少為指標，分別對樣品的不同提取方式、提取溶劑、提取時間進行了考察，最終確定以 70 % 甲醇超聲提取 和5 0 % 乙醇加熱回流提取 3 0 m i n 分別作為建立指紋圖譜和測定含量用供試品溶液的處理方法。

3.2含量測定指標成分的確定

本研究前期通過查閱文獻發現，花椒毒素是一種呋喃香豆素類天然產物，具有抗菌、抗腫瘤和抗炎作用[14]。酚酸類化合物如綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸和咖啡酸等，均具有抗氧化、抗病毒和抗菌等藥理活性[15-17]。黃酮類化合物芹菜素-7-0 ?? β -D-葡萄糖苷具有抗菌和抗炎的作用;而木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷除了對心肌細胞具有保護作用以外，還具有抗氧化損傷的能力，其可經β . -葡萄糖苷酶水解成木犀草素，從而抑制環氧合酶2蛋白在小鼠單核巨噬細胞白血病細胞中的表達[18-21]。異綠原酸A和異綠原酸C可通過清除自由基的方式起到抗氧化的作用[22]。上述成分的藥理活性與鉤苞大丁草的藥效作用相關。此外，由OPLS-DA結果可知，綠原酸、異綠原酸A、花椒毒素、異綠原酸C、新綠原酸和木犀草素-7-0 -D-葡萄糖苷可能是導致13批鉤苞大丁草之間存在質量差異的主要標志物，再結合本課題組前期研究結果—3，8-Dhmcc、3-羥基-4-甲氧基-5-羧基-香豆精可能是鉤苞大丁草在體內發揮作用的藥效物質，故本研究選擇這些成分作為含量測定的指標。由OPLS-DA結果還可知，異綠原酸B也可能是導致13批鉤苞大丁草藥材之間質量差異的主要標志物，但本課題組在前期研究中嘗試過多種方法，都無法使異綠原酸B達到含量測定的分離度和回收率要求，所以在本研究中沒有選擇異綠原酸B作為含量檢測指標。

3.3指紋圖譜和化學模式識別結果分析

本研究通過HPLC法建立了13批鉤苞大丁草藥材的指紋圖譜，共確定了38個共有峰，指認了其中13個共有峰；相似度評價結果顯示，13批樣品與對照指紋圖譜R的相似度為 0 . 8 0 1～0 . 9 9 4 ，其中部分批次樣品的相似度低于0.900，這可能是因為13批鉤苞大丁草藥材產地不同，受氣候、地理位置及采收時間等自然因素及人為因素的共同影響，導致不同批次藥材之間存在一定的質量差異。通過HCA、PCA結果可知， 聚為一類，S6聚為一類，S8聚為一類，S9、S11聚為一類，S10、S 1 2～S 1 3 聚為一類。該結果提示：2021年采收于不同產地的藥材質量差異較小，除S6以外的藥材樣品相似性較高；2023年采收于不同產地的藥材質量不完全一致，這可能是因為產地的氣候（降雨量和光照等）不同所導致的，例如樣品S8的產地云南省永仁縣，與其他產地相比，其日照時間較長，年均日照時間居云南省第—[23]。經OPLS-DA可知，峰7（綠原酸）峰21（異綠原酸A）峰26（花椒毒素）峰19（異綠原酸B）峰33、峰13、峰23（異綠原酸C）峰2（新綠原酸）峰17（木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖昔）9個共有峰所代表的化學成分可能是導致13批不同產地和不同年份鉤苞大丁草藥材之間質量差異的主要標志物，并且其中花椒毒素、綠原酸、異綠原酸A、木犀草素-7-0 -D-葡萄糖苷、異綠原酸C、新綠原酸的含量較高。因此，可考慮將這6個含量較高且有較好藥理活性的成分作為鉤苞大丁草藥材的質量標志物。

3.4含量測定結果分析

由于新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A這4個成分在不同批次鉤苞大丁草藥材中的含量差異過大，線性關系考察時混合對照品溶液的配制存在困難，因此本研究選擇對供試品溶液A進行稀釋制得供試品溶液B的方式，實現對上述4個成分的含量測定。結果顯示，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、3，8-Dhmcc、咖啡酸、3-羥基-4-甲氧基-5-羧基-香豆精、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、異綠原酸A、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、異綠原酸C、花椒毒素的含量范圍分別為0.159～2.109、0.852～15.910、0.154～1.738、0.102～0.731、0.035～0.132、0.136～1.297、0.490～1.611、0.793～4.918、0.083～0.247、0.487～2.170、1 . 2 4 2～5 . 3 8 3 m g "g ，平均含量分別為0.744、5.014、0.646、0.431、0.069、0.582、0.979、2.754、0.157、1.284、2.943mg/g。13批鉤苞大丁草藥材中有效成分含量存在差異可能與存放時間相關，如2023年采收藥材中的有效成分含量相較2021年采收藥材更高。其具體原因可能為2021年采收的藥材存放時間更長，導致藥材中綠原酸等有機酸類和花椒毒素等香豆素類成分損失。因此，筆者建議在存放鉤苞大丁草藥材時應注意其存放時間和儲存條件，以保證藥材的質量穩定。

綜上所述，本研究建立的HPLC指紋圖譜和含量測定方法簡單、準確、穩定，能夠為鉤苞大丁草藥材的質量控制提供依據，還可為進一步開發應用鉤苞大丁草資源提供參考。

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（編輯：胡曉霖）