姜黃素通過Akt/mTOR/HIF-1α通路調(diào)控氧糖剝奪PC12細(xì)胞自噬的機(jī)制研究

[摘要]目的探討姜黃素對(duì)氧糖剝奪（OGD）誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞自噬損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法通過體外建立OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞自噬損傷模型，將PC12細(xì)胞分為CON組、OGD組、右美托咪啶（DEX）組和姜黃素低、中、高劑量組。除CON組外，其余各組均換DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基，并且在 94%N₂.5%CO₂?1%O₂ 條件下培養(yǎng) ^6h 進(jìn)行OGD處理。姜黃素低、中、高劑量組和DEX組分別加入 1.25，5，20μmol/L 濃度的姜黃素以及 0.5μmol/L 的DEX干預(yù) 12h 采用MTT法檢測(cè)PC12細(xì)胞存活率；透射電子顯微鏡觀察姜黃素處理后的自噬小體及自噬溶酶體;MDC熒光染色法觀察自噬小體的熒光強(qiáng)度;Westem blot檢測(cè)微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）-II/LC3-I、芐氯素1（Beclin-1）、合體 ^1（p62） 、磷酸化蛋白激酶B/蛋白激酶 B（p-Akt/Akt） 磷酸化雷帕霉素/雷帕霉素（p-mTOR/mTOR ）、缺氧誘導(dǎo)因子 1α（HIF-1α） 等自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果與CON組相比，OGD組細(xì)胞存活率顯著降低（ Plt;0.01 ）PC12 細(xì)胞自噬小體熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（ Plt;0.01 ）;LC3-Ⅱ/LC3-IBeclin-1、HIF-1α蛋白表達(dá)顯著升高（ Plt;0.01? ）， p62.p -Akt/Akt、p-（204號(hào) 蛋白表達(dá)顯著降低（ Plt;0.01 ）。與OGD 組相比，姜黃素低、中、高劑量組及DEX組細(xì)胞存活率均升高（ （Plt;0.05，Plt;0.01） ；PC12細(xì)胞自噬小體熒光強(qiáng)度減弱 （Plt;0.05，Plt;0.01 ）。與OGD 組相比，姜黃素低、中劑量組及DEX組LC3-II/LC3-I、Beclin-1、HIF-1α蛋白表達(dá)顯著降低 ?（Plt;0.01），p2.p-Akt/Akt.p-mTOR/mTOR 蛋白表達(dá)顯著升高 （Plt;0.01） 。結(jié)論姜黃素的低、中劑量組可通過激活 Akt/mTOR 通路，繼而影響HIF- ?1α 蛋白表達(dá)，抑制OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞自噬損傷，從而發(fā)揮抗神經(jīng)元自噬損傷的保護(hù)作用。

本文引用：.姜黃素通過Akt/mTOR/HIF- ?1α 通路調(diào)控氧糖剝奪PC12細(xì)胞自噬的機(jī)制研究[J]湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2025，45（5）：836-844.

[關(guān)鍵詞]姜黃素；氧糖剝奪；細(xì)胞自噬；右美托咪啶； Akt/mTOR/HIF-α 通路；自噬損傷 中圖分類號(hào)]R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.05.008

[Abstract]Objective Toexploretheprotectiveefectsofcurcuminonoxygen-glucose deprivation （OGD）-inducedautophagic injury inPC12celsanditsmechanism.MethodsAninvitroOGD-inducedautophagicinjurymodel was establishedinPC12 cels，andthePC12celswere divided into CONgroup，OGDgroup，dexmedetomidine （DEX）group，andlow-，medium-，and highdose curcumin groups.Except forthe CON group，celsinallother groups were switched to glucose-free DMEM mediumand subsequently subjected to OGD treatment by incubating them for six hours under conditions of 94% 1 v₂， 5% CO ²⁵ and 1% 心 0₂. The low-，medium-，andhigh-dosecurcumin groups，alongwiththeDEXgroup，wererespectively intervened withcurcuminat concentrations of 1.25，5，and 20μmol/L aswell as 0.5μmol/L DEX for 12 hours. The viability of PC12 cells was measured using theMTTassy.Transmission electron microscopewasusedtoobserveautophagosomesandautolysosomes following curcumin treatment，andtheMDCstainingmethodwasemployedtoobservethefluorescenceintensityofautophagosomes.Westernblotwas conductedtoeterminetherelativeexpresionlevelsofutophagyelatedproteinsinludingmcrotubuleassociatedproteinlight chain 3 （LC3）-I/LC3-I， Beclin-1，sequestosome 1 （p62），phosphorylated protein kinase B/protein kinase B（ p -Akt/Akt），phosphorylated mammaliantargetofrapamycin/mammaliantargetofrapamycin （p-mTOR/mTOR），andhypoxia-induciblefactorlα（HIF-lα）.Results Compared with the CON group，the OGD group exhibited a significantly reduced cell viability （ P lt;0.01）and a markedly enhanced fluorescent intensity of autophagosomes in PC12 cells （ Plt; lt;0.01）.The protein expression levels of LC3-I/LC3-I， Beclin-1，and HIF-1 α （20 were significantly upregulated （P ）and reduced autophagic fluorescence intensity in PC12 cells P lt;0.05， P lt;0.01）.Compared with the OGD group，thelow-and medium-dosecurcumin groupsandtheDEX group demonstrated significantlydecreasedprotein expresions of LC3-/LC3-I， Beclin-1，and HIF- _1α （ Plt;0.01 ）， along with significantly elevated protein expressons of p62， p-Akt/Akt， and p-mTOR/ mTOR（ Plt;0.01 ）.Conclusion The low-and medium-dose curcumin groups can exert protectiveefects against neuronal autophagic injurybyactivatingtheAkt/mTORpathwaysubsequentlymodulating HIF-1αproteinexpressionandinhibitingOGD-induced autophagic injury in PC12 cells.

[Keywords] curcumin; oxygen-glucose deprivation; autophagy; dexmedetomidine; Akt/mTOR/HIF- ??α∝ pathway; autophagic injury

中風(fēng)是全球第二大死亡病因，也是獲得性殘疾的主要病因，分為缺血性和出血性兩大類。缺血性腦卒中（ischemiastroke，IS）是局部腦組織區(qū)域血液供應(yīng)障礙，屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)病\"范疇，可導(dǎo)致腦組織缺血缺氧性病變壞死、神經(jīng)元損傷及代謝障礙疾病[2]。IS具有高致死率、致殘率的特點(diǎn)，且病理機(jī)制復(fù)雜。王永炎院士提出的\"毒損腦絡(luò)\"理論，總結(jié)了缺血性中風(fēng)的病因病機(jī)為瘀毒互結(jié)3]。已有研究證實(shí)，活血化瘀類中藥能有效調(diào)控自噬相關(guān)信號(hào)因子及通路4。氧糖剝奪（oxygen glucose deprivation，OGD）是常用的IS體外模型5。PC12細(xì)胞系可被神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)后分化為具有交感神經(jīng)元特性的細(xì)胞，故常用于缺血缺氧損傷的研究6-。因此，本實(shí)驗(yàn)采用OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞模型進(jìn)行體外研究。

細(xì)胞自噬又稱Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，是真核細(xì)胞特有的、依賴于溶酶體或液泡的細(xì)胞內(nèi)降解過程大量研究提示，細(xì)胞自噬與IS的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是一把“雙刃劍\"[2]。適度的細(xì)胞自噬發(fā)生時(shí)，通過自噬小體一一溶酶體降解過程去除長(zhǎng)壽或受損的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)聚集物和多余的細(xì)胞成分，以此減輕細(xì)胞應(yīng)激，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。當(dāng)自噬反應(yīng)過度激活，會(huì)造成細(xì)胞中健康細(xì)胞器與其他關(guān)鍵蛋白降解，導(dǎo)致細(xì)胞的死亡及功能紊亂，還可誘發(fā)加重疾病。據(jù)相關(guān)研究表明，缺糖缺氧與細(xì)胞自噬之間呈現(xiàn)出顯著的相關(guān)性[]。蛋白激酶B（protein kinaseB，Akt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofra-pamycinm，mTOR）通路可進(jìn)行細(xì)胞自噬調(diào)控[12]。缺氧誘導(dǎo)因子 1α （hypoxia inducible factor1α， HIF-1α）是Akt或者mTOR下游的一個(gè)靶蛋白[13]。研究表明，HIF- ??1α∝ 的敲除導(dǎo)致細(xì)胞自噬水平顯著降低，且與神經(jīng)保護(hù)密切相關(guān)[14-15]。以上提示， Akt/mTOR/HIF-1α 信號(hào)通路可能在自噬的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

姜黃素是從姜科植物姜黃、郁金、莪術(shù)等的根莖中提取出來的一種多酚類活性成分，具有鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗菌、抗腫瘤等多種生物活性功效[，還可通過多種途徑發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、抗炎、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等藥理作用。目前，多項(xiàng)研究表明姜黃素具有抗炎、抗凋亡、抗氧化損傷等神經(jīng)保護(hù)作用，但有關(guān)其調(diào)控細(xì)胞自噬抗腦缺血損傷的研究尚不多[18-24]。且姜黃素具有安全無(wú)毒、人體耐受性好、易于獲取且價(jià)格低廉等諸多優(yōu)勢(shì)，即使 12g/d 連續(xù)服用3個(gè)月以上，亦不會(huì)造成肝腎實(shí)質(zhì)性損傷[25]。鑒于姜黃素在腦缺血損傷中潛在的應(yīng)用前景，可開展科學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究明確其具體的作用及其機(jī)制，以期為姜黃素的二次研發(fā)積累一定的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。

本研究擬構(gòu)建OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞模型，通過體外實(shí)驗(yàn)MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率，透射電鏡觀察自噬小體、自噬溶酶體；MDC法觀測(cè)自噬小體熒光強(qiáng)度；Westernblot檢測(cè)微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein light chain3， LC3）-II/LC3-I、芐氯素1（Beclin-1） 合體1（sequestosome 1，p62）、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、HIF-1α自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況，以期明確姜黃素對(duì)OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞自噬損傷的影響。

1材料

1.1細(xì)胞

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12細(xì)胞株（商品號(hào)：TCR9），購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2主要藥品與試劑

姜黃素、鹽酸右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）（貨號(hào)：B20614、B34611，上海源葉生物科技有限公司）;胎牛血清、DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基、DMEM無(wú)糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基（貨號(hào)：164210-50、PM150210、PM150270，武漢普諾賽生命科技有限公司）；BCA試劑盒（批號(hào)：BL521A，安徽蘭杰柯科技有限公司）；青鏈霉素混合液（100X）細(xì)胞自噬檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：P1400、20221217，北京索萊寶有限公司）； 2.5% 茂二醛、無(wú)蛋白快速封閉液、預(yù)染蛋白 Mark X（貨號(hào)：CR2405027、G2052、MPC2408042，塞維爾生物科技有限公司）；Plasticgel預(yù)制膠Tris-Gly 4% （批號(hào)：PSG2001-415F，萬(wàn)生昊天生物公司）。

羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（批號(hào)：D20802-25、D21207-05，北京萊闊生物科技有限公司）；二甲基亞砜、MTT（噻唑藍(lán)）（貨號(hào)：D8371、M8180，北京索萊寶有限公司）;mTOR、p-mTOR、LC3、Beclin-1β-actin、Akt、p-Akt一抗（貨號(hào)： 66888-1-Ig，67778-I- Ig?14600-1-Ig?6665-1-Ig?66009-1-Ig?60203-2- Ig-IgG1.66444-1-Ig-IgG1 ，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）； HIF-1α 一抗（貨號(hào)：ab179483，英國(guó)Abcam公司）；蛋白酶抑制劑PMSF（批號(hào)：21355980，安徽蘭杰柯科技有限公司）。

1.3 主要儀器

超凈工作臺(tái)（型號(hào)：SJ-CJ-2FD，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司）；倒置顯微鏡（型號(hào)：AE2000，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）； CO₂ 細(xì)胞培養(yǎng)箱（型號(hào)：NU-5810E，蘇州紐艾設(shè)備有限公司）；三氣培養(yǎng)箱（型號(hào)：150i，美國(guó)ThermoFisher公司）;酶標(biāo)儀、多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)（型號(hào)：ELX800、CytationTM5，美國(guó)Bio-Tek 公司）;紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（型號(hào)：OdysseyCLX，美國(guó)LI-COR公司）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（型號(hào)：JY-600HE型、JY-ZY5型，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）。

2方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞置于 37°C 水浴箱中迅速?gòu)?fù)蘇，將其接種于含有 10% 的胎牛血清 .1% 青鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于 及濕度飽和的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，適時(shí)換液，經(jīng)1～2次傳代后，收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞備用。

2.2 OGD誘導(dǎo)PC12細(xì)胞自噬損傷模型的制備

從培養(yǎng)箱中取出PC12細(xì)胞，棄去高糖培養(yǎng)液，用PBS清洗2遍，加入適量的DMEM無(wú)糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基（缺糖），放置于 94%N₂.5%CO₂?1%O₂ 條件下缺氧處理 6h^[26-27]

2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率

分組及給藥處理：收集對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期細(xì)胞，以 5× 10³ 個(gè)/孔接種于96孔板。設(shè)置CON組、OGD組、DEX組和姜黃素低、中、高劑量組，共計(jì)6組，每組5個(gè)復(fù)孔，每孔接種 100μL 細(xì)胞。 飽和濕度培養(yǎng)箱下繼續(xù)培養(yǎng) 24h 。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，姜黃素組低、中、高劑量組分別加入 1.25，5，20μmol/L 濃度的姜黃素進(jìn)行干預(yù)，DEX組加入 0.5μmol/L 的DEX，加藥干預(yù) ^12h 。加藥干預(yù) 12h 后，除CON組外，其余各組均換為DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基，并且于 94% N₂，5%CO₂，1%O₂ 條件下培養(yǎng) 6h 進(jìn)行OGD處理。

采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率：每孔加入 0.5mg/mL MTT 100μL_ν 。 37°C 孵育 ⁴h ，吸棄培養(yǎng)基，每孔再加入 100μL 二甲基亞砜，酶標(biāo)儀振蕩 10min ，于490nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各組吸光度（A）值，計(jì)算各組細(xì)胞存活率 （R）^[26-27] 。 R=[（A_Fd^???-A_Fd^??）/（A_{fEd^?×fd^?-Ase^??}）]× （24100% 。

2.4透射電鏡觀察PC12細(xì)胞自噬小體和自噬溶酶體

細(xì)胞以 1.5×10⁶ 個(gè) /mL 的密度接種于 6cm 的培養(yǎng)血中，按“2.3\"中的分組方法進(jìn)行培養(yǎng)，棄除舊培養(yǎng)基，用含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，收集至 1.5mL 棕色離心管 離心 10min 。離心后棄上清液，細(xì)胞團(tuán)用 2.5% 戊二醛固定液進(jìn)行重懸，置于4‰ 冰箱中保存過夜。

2.5MDC熒光法觀察PC12細(xì)胞自噬小體

細(xì)胞以 1×10⁶ 個(gè) /mL 的密度接種于6孔板，按“2.3”中的分組方法進(jìn)行培養(yǎng)，各組處理后，棄舊培養(yǎng)基，PBS清洗2次，加入 100μL MDC熒光染色液，37℃孵育 15min ；吸棄染色液，PBS清洗3次，細(xì)胞成像多功能檢測(cè)儀CFP20倍鏡下觀察各組自噬小體的熒光斑點(diǎn)，拍照記錄，用ImageJ軟件分析并計(jì)算熒光強(qiáng)度。

2.6Western blot 檢測(cè) LC3-ⅡI/LC3-I 、p62、Be-clin-1、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、HIF-1α 蛋白的表達(dá)情況

收集對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期細(xì)胞，以 2.5×10⁶ 個(gè) ?/mL 密度接種于 10cm 培養(yǎng)皿中。按“2.3\"中的分組方法進(jìn)行培養(yǎng)處理后，棄除舊培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS清洗2次，在含有 1% PMSF的RIPA裂解液冰上裂解 下 離心 10min 后取上清液（即為細(xì)胞總蛋白）。BCA法定量、SDS-PAGE電泳后蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，快速封閉液封閉 5min ，TBST洗膜， 4°C 孵育一抗（稀釋比 1：1 000 ）過夜。次日TBST洗膜，室溫避光孵育二抗（稀釋比 1：10 000）1.5h OdysseyCLX雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)分析Beclin-1、LC3-II/LC3-I、Akt、p-Akt、mTOR ?p? -mTOR、HIF-1α蛋白的表達(dá)情況， β? -actin為內(nèi)參。計(jì)算相對(duì)灰度值及 p-Akt/Akt.p-mTOR/mTOR 的比值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpadprism9.5和 SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理及分析，兩組間比較采用 χ_t 檢驗(yàn)，結(jié)果均以“ ”表示，以 Plt;0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1各組細(xì)胞存活率比較

與CON組相比，OGD組細(xì)胞存活率顯著降低（Plt;0.01） ;與OGD組相比，姜黃素低、中、高劑量組及DEX組細(xì)胞存活率均升高 （Plt;0.05，Plt;0.01） 。與DEX組比較，姜黃素低、高劑量組細(xì)胞存活率降低（Plt;0.05） 。詳見圖1。

3.2各組細(xì)胞自噬小體及自噬溶酶體情況

CON組細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)均勻，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)清晰，膜上可見密集的微絨毛，有極少量的自噬空泡及自噬小體。與CON組相比，OGD組細(xì)胞自噬損傷程度明顯，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，有大量的自噬溶酶體、自噬空泡和自噬小體存在。DEX組和姜黃素中劑量組自噬程度較輕，細(xì)胞質(zhì)輕微不均勻，未見自噬小體存在，有少量的自噬溶酶體和自噬空泡。姜黃素低、高劑量組輕度自噬，有較多的自噬溶酶體、自噬空泡和自噬小體。詳見圖2。

3.3各組PC12細(xì)胞自噬小體情況

CON組可見少量熒光斑點(diǎn)，熒光強(qiáng)度減弱；與CON組相比，OGD組熒光斑點(diǎn)增多，且熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng) （Plt;0.01 ）;與OGD組相比，姜黃素低、中、高劑量組和DEX組熒光斑點(diǎn)減少，熒光強(qiáng)度減弱（ Plt;0.05 Plt;0.01 ）；與DEX組和姜黃素低、中劑量組相比，姜黃素高劑量組熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（ （Plt;0.05） 。詳見圖3-4。

3.4各組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況

與CON 組相比，OGD 組細(xì)胞中LC3-II/LC3-I、Beclin-1 HIF-1α 蛋白表達(dá)顯著升高（ （Plt;0.01 ），p62、p-Akt/Akt?p-mTOR/mTOR 蛋白表達(dá)顯著降低（ Plt; 0.01）。與OGD組相比，姜黃素低、中劑量組和DEX組細(xì)胞中LC3-I/LC3-I、Beclin-1、HIF-1α蛋白表達(dá)顯著降低 （Plt;0.01），p62?p-Akt/Akt.p-mTOR/mTOR 蛋白表達(dá)顯著升高 （Plt;0.01） ;姜黃素高劑量組HIF-1α 蛋白表達(dá)降低 （Plt;0.05 ） 蛋白表達(dá)升高 （Plt;0.05） 。與DEX組和姜黃素低、中劑量組比較，姜黃素高劑量組LC3-II/LC3-I、Beclin-1、HIF-1α蛋白表達(dá)升高 （Plt;0.05，Plt;0.01），p62，p-Akt/Akt，p- mTOR/mTOR 蛋白表達(dá)降低 （Plt;0.05，Plt;0.01） 。詳見圖5。

4討論

IS因腦部血管缺血，致大腦供血及供能不足，引發(fā)神經(jīng)元不可逆性損傷壞死。其具有發(fā)病率高、死亡率高和致殘率高的特點(diǎn)，為我國(guó)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[28]。OGD是IS經(jīng)典的體外模型[5。細(xì)胞自噬是細(xì)胞通過溶酶體系統(tǒng)清除自身廢物、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制[2]。研究表明，IS后會(huì)誘發(fā)自注：與CON組比較， ^**Plt;0.01 ;與OGD組比較， ^*Plt;0.05 **Plt;0.01 ：與DEX組比較， ^?Plt;0.05 ；與姜黃素低劑量組比較， ?_Plt;0.05 ;與姜黃素中劑量組比較， ?_Plt;0.05 （20

噬，且自噬貫穿IS病理過程，在其急性期、亞急性期、恢復(fù)期和后遺癥期4個(gè)分期中發(fā)揮不同的調(diào)控作用30。據(jù)研究證明，適度激活海馬神經(jīng)元自噬，可保護(hù)神經(jīng)元免受缺血損傷[31，而過度自噬導(dǎo)致皮質(zhì)神經(jīng)元和SH-SY5Y細(xì)胞自噬損傷32。姜黃素作為傳統(tǒng)活血化瘀類的中藥單體，其具備脂溶性高、易透過血腦屏障，并具有經(jīng)濟(jì)成本低、效果顯著等特點(diǎn)。多項(xiàng)研究表明，其能清除自由基、抑制血小板聚集、抑制炎癥因子產(chǎn)生等原發(fā)作用繼而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[16-22]本研究旨在通過PC12細(xì)胞OGD體外模型，探討姜黃素是否通過 Akt/mTOR/HIF-1α 通路調(diào)控細(xì)胞自噬抗OGD損傷。

白、磷脂酰肌醇 3-激酶、自噬相關(guān)蛋白（autophagy-relatedprotein，ATG）14等蛋白發(fā)生相互作用，進(jìn)而協(xié)同執(zhí)行細(xì)胞自噬和膜運(yùn)輸?shù)闹匾δ躘33]。LC3是酵母中的泛素樣修飾劑ATG8的同源物，參與自噬。LC3蛋白合成后被ATG4家族蛋白切割掉C端5肽，暴露甘氨酸殘基，產(chǎn)生胞漿定位的LC3-I；LC3-I會(huì)被包括Atg7和Atg3在內(nèi)的泛素樣體系修飾和加工，隨后與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-Ⅱ[34]。LC3-Ⅱ/LC3-I比值升高表明自噬水平升高[35]。p62是反映自噬活性的標(biāo)記蛋白，其蛋白的水平與自噬呈負(fù)相關(guān)，即出現(xiàn)自噬時(shí)，在細(xì)胞質(zhì)中p62蛋白不斷被降解；當(dāng)自噬活性減弱、自噬功能缺陷時(shí)，p62蛋白會(huì)在細(xì)胞質(zhì)中不斷累積[3。Akt位于一個(gè)級(jí)聯(lián)信號(hào)通路的頂端[37I，通過與溶酶體蛋白2結(jié)合，參與抑制自噬體形成和溶酶體積累，可以直接或間接使mTOR磷酸化38。mTOR是一種相對(duì)分子質(zhì)量為 的非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可形成mTORCl和mTORC2兩種不同復(fù)合物3。自噬啟動(dòng)因子由Atg13、Unc-51樣激酶、抑癌基因RB1誘導(dǎo)卷曲螺旋1組成，mTOR能高度磷酸化Atg13，使Atg13與Unc-51樣激酶分離，降低Unc-51樣激酶的活性，從而抑制細(xì)胞自噬，是自噬調(diào)控的中心蛋白[4]。研究表明， 可以減輕OGD損傷，發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用[41]。HIF- 1α 是在缺血缺氧的病理狀態(tài)下表達(dá)的一種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[42]，位于 下游。在缺氧條件下，HIF- ?1α 在細(xì)胞內(nèi)積累，并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核中。mTOR調(diào)控HIF- 1α mRNA的合成與蛋白的表達(dá)[43]。研究表明，抑制HIF- 1α 的表達(dá)或基因敲除可抑制細(xì)胞自噬，增加細(xì)胞活力[14，44]，說明 HIF-1α 與神經(jīng)元自噬調(diào)控相關(guān)。綜上， Akt/Λ mTOR/HIF- 1α 可能參與了細(xì)胞自噬的調(diào)控。

DEX是近年來應(yīng)用于臨床麻醉和鎮(zhèn)靜的新型、高選擇性 ∝2 腎上腺素受體激動(dòng)劑[45]。研究提示，DEX對(duì)海馬和皮質(zhì)缺血損傷具有保護(hù)作用4，且其神經(jīng)保護(hù)作用與激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路和下調(diào)HIF-1α 蛋白表達(dá)有關(guān)[47-48]。故本研究選擇DEX作為本研究的陽(yáng)性對(duì)照藥。據(jù)本研究結(jié)果顯示，OGD誘導(dǎo)細(xì)胞后，細(xì)胞存活率顯著降低，自噬小體及自噬溶酶體顯著增多，MDC熒光斑點(diǎn)及強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，LC3-II/LC3-I、Beclin-1、HIF-1α 的表達(dá)量顯著上調(diào)， p62.p-Akt/AktΩ，p-mTOR/mTOR 顯著下調(diào)，提示OGD可激活 Akt/mTOR/HIF-1α 通路，增強(qiáng)細(xì)胞自噬。經(jīng)過DEX和姜黃素低、中劑量處理后，上述指標(biāo)逆轉(zhuǎn)，被OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞存活率升高，細(xì)胞自噬小體、自噬溶酶體數(shù)量及熒光斑點(diǎn)、熒光強(qiáng)度降低，并下調(diào)Beclin-1LC3-II/LC3-I HIF-1α 蛋白相對(duì)表達(dá)量， p62.p-Akt/Akt.p-mTOR/mTOR 上調(diào)。這表明姜黃素可抑制OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞自噬損傷，與調(diào)控 Akt/mTOR/HIF-1α 信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，姜黃素可能通過 Akt/mTOR/HIF-1α 通路，抑制OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞自噬損傷。從西醫(yī)機(jī)制論述，姜黃素通過抑制細(xì)胞自噬發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；從中醫(yī)角度論述，姜黃素通過發(fā)揮活血化瘀、阻止瘀毒侵蝕，使腦絡(luò)通、氣血暢，達(dá)“驅(qū)邪扶正\"之效。近年研究提示，mTOR是缺血損傷細(xì)胞自噬調(diào)控的關(guān)鍵激酶5。經(jīng)由mTOR調(diào)控的信號(hào)通路主要包括3條，其中Akt和絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可激活mTOR從而抑制細(xì)胞自噬49]，而絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)則抑制mTOR促進(jìn)細(xì)胞自噬等[50]。同時(shí)存在線粒體損傷時(shí)，PTEN基因誘導(dǎo)激酶1穩(wěn)定并招募E3連接酶帕金蛋白，啟動(dòng)的線粒體自噬機(jī)制。另外，自噬和焦亡、銅死亡、鐵死亡之間亦存在串話機(jī)制。后續(xù)可深入探究姜黃素抗細(xì)胞自噬的其他機(jī)制，明確IS缺血損傷的現(xiàn)代病理分子機(jī)制，以期為后續(xù)研究及臨床治療提供一定參考靶標(biāo)和思路。

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（本文編輯 田夢(mèng)妍）