熊果酸對非小細(xì)胞肺癌H1975細(xì)胞的體內(nèi)外抑制作用研究

[摘要]目的 研究熊果酸（UA）對非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）H1975細(xì)胞的體內(nèi)外抑制作用，探討其對移植瘤裸鼠內(nèi)源性代謝物的影響。方法以H1975細(xì)胞為研究對象，MTT法篩選 UA（0～75μg/mL） 作用細(xì)胞的最佳濃度。將細(xì)胞分為對照組及UA低 （9.27μmol/L ）、中（ （18.53μmol/L 、高 27.8μmol/L 劑量組作用細(xì)胞 ^48h ，劃痕法檢測細(xì)胞遷移能力，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡，Western blot法檢測組織金屬蛋白酶抑制因子-2（TIMP-2）、促凋亡B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白（Bax）、活化的胱天蛋白酶-3（Cleaved-Caspase-3）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9和抗凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）蛋白的表達(dá)。在裸鼠背部皮下注射H1975細(xì)胞建立移植瘤模型，隨機(jī)分為對照組、吉非替尼組（ 50mg/kg 和UA低（ 100mg/kg） 、中 200mg/kg^? 、高 （400mg/kg） 劑量組，每3天給藥一次，連續(xù)18d，記錄裸鼠體質(zhì)量和移植瘤生長情況。采用UPLC-MS/MS法檢測裸鼠血清內(nèi)源性代謝物水平。結(jié)果UA抑制H1975細(xì)胞增殖 IC₅₀（48h） 為 與對照組比較，UA中、高劑量組阻滯細(xì)胞周期在 G₀/G₁ 期、細(xì)胞凋亡率增加、細(xì)胞遷移能力下降（ Plt; 0.05）;TIMP-2、Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)，MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)（ Plt;0.05 。與UA低劑量組比較，UA高劑量組阻滯細(xì)胞周期在 G₀/G₁ 期、細(xì)胞凋亡率增加、細(xì)胞遷移能力下降（ Plt;0.05） ;TIMP-2、Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)，MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào) （Plt;0.05） 。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，與對照組比較，UA各劑量組與吉非替尼組對移植瘤裸鼠的腫瘤生長有抑制作用 （Plt;0.05） ；與UA低、中劑量組比較，UA高劑量組對移植瘤裸鼠腫瘤生長有抑制作用 （Plt;0.05） 。代謝組學(xué)分析篩選出5S，15S-二羥基-6E，8Z，10Z，13E-二十碳四烯酸、4-羥基苯甲醇、氧化三甲胺等22個差異代謝物，主要涉及不飽和脂肪酸的生物合成、亞油酸代謝和酪氨酸代謝通路。結(jié)論UA在體內(nèi)外對NSCLC H1975細(xì)胞均有明顯抑制作用，其在體內(nèi)的抑制作用可能與調(diào)節(jié)不飽和脂肪酸的生物合成、亞油酸代謝和酪氨酸代謝相關(guān)。

本文引用：梁艷妮.熊果酸對非小細(xì)胞肺癌H1975細(xì)胞的體內(nèi)外抑制作用研究[J湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2025，45（5）：825-835.

[關(guān)鍵詞]熊果酸；H1975細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移；血清代謝組學(xué) [中圖分類號]R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.05.007

[Abstract]ObjectiveToinvestigatetheinvitroandinvivoinhibitoryefectsofursolicacid（UA）onnon-smallcelllung cancer（NSCLC）H1975cels，andexploreitsefectsonendogenousmetabolitesintumor-xenograftednudemice.MethodsH1975 cellswereusedastheresearchbjectandtheoptimalconcentrationofUA（O-75μg/mL）forcelltreatmentwasscreenedusingthe MTTassay.Cellweredividedintocontrolgroupandlow-，medium-，andhigh-doseUA（9.27μmol/L，18.53μmol/L，27.8μmol/L） groupsandallgroupsweretreatedfor48hours.Cellmigrationwasassessedbythescratchassaycellcycledistributioand apoptosiswereanalyzedbyflowcyometryndproteinxpressonlevelsoftisseinbitorofmetaloproteinass-2pro apoptoticBsoatedprteax）sps3，trixalrotess9dtoc weredeterminedbyWestern blotAxenografttumormodelwasestablishedbysubcutaneousinjectionofH1975cellsintotheback of nudemice，whichwererandomlydividedintocontrol，gfitinib（5Omg/kg），andlow-，medium-，andhigh-doseUA（10mg/kg 200mg/kg，40Omg/kg）groups.Drugs wereadministeredeverythreedaysfor18consecutivedays，andnudemousebodyweightand tumor growth wererecorded.UPLC-MS/MSwasusedtodetermineendogenous metabolite levelsinnude mouseserum.Results The IC 50 value of UA for inhibiting H1975 cell proliferation at 48 h was 27.8 μmol/L Compared with the control group，medium- and high-dose UA groups arrested the cell cycle at the phase，and showed increased apoptosis rate and reduced cell migration ability （ P lt;0.05）.Aditionally，theproteinexpressionlevelsof TMP-2，BaxandCleavedCaspase-3wereupregulated，whileoseof MMP-2， MMP-9， and Bcl-2 were downregulated （ Pe lt;0.05）. Compared with the low-dose UA group，the high-dose UA group arrested the cell cyele at the G₀/G₁ phase，and exhibited elevated apoptosis rate， reduced cell migration ability P lt;0.05）， and upregulated TIMP-2， Bax， and Cleaved-Caspase ^-3 protein expression levels， as well as downregulated MMP-2， MMP-9，and Bcl-2 protein expression levels （ P lt;0.05）. In vivo，compared with the control group，alldose groups of UAandthe gefitinib group significantlyinhibited tumor growth in tumor-xenografted nude mice （ P： lt;0.05）.Furthermore，the high-dose UA group demonstrated enhanced tumor growth inhibition compared with the low- and medium-dose UA groups P lt;0.05）.Metabolomics analysis identified 22 differential metabolites， including5S5ydroxyE，8ZZ3Eicosatetraenoiccid4doxybenylohol，andtrimethaminid primarilyinvolvingpathwaysrelatedtounsaturatedfatyacidbiosynthesis，linoleicacidmetabolism，andtyrosinemetabolism. ConclusionUAexhibitssignifcantinhibitoryefectsonNSCLCH975cellbothinviroadinvivo.Itsinvivoinhibioryfcts maybeasociatedwiththeregulationofunsaturatedfattyacidbiosynthesis，linoleicacidmetabolism，andtyrosinemetabolism pathways.

[Keywords]ursolic acid;H1975cell；apoptosis;cell proliferation;cell migration;serum metabolomics

在全球癌癥相關(guān)死亡中，由肺癌引發(fā)的死亡居首位，肺癌按組織學(xué)類型可分為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lungcancer，NSCLC）和小細(xì)胞肺癌，其中NSCLC是最主要的類型。表皮生長因子受體（epi-dermalgrowth factorreceptor，EGFR）與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，EGFR為NSCLC的常見驅(qū)動基因，也是最容易發(fā)生突變和缺失的基因[2-3]。臨床采用EGFR-酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-tyrosinekinaseinhibitor，EGFR-TKI）治療NSCLC，但長期應(yīng)用易產(chǎn)生耐藥性[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，患者在使用一線治療藥物吉非替尼6＼～12個月后可能引發(fā)繼發(fā)性耐藥問題5。因此，亟須尋找新的治療NSCLC的藥物。

熊果酸（ursolicacid，UA）是一種五環(huán)三萜羧酸，白花蛇舌草、女貞子、山茱萸等多種中藥均含有該成分。UA對乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、NSCLC、胃癌、結(jié)腸癌、膀胱癌和肝癌等多種腫瘤的細(xì)胞系均有抑制作用。研究顯示，UA可通過抑制核因子κB（nuclearfactor- κB ， NF-κB ）活化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，通過激活胱天蛋白酶（cysteineasparticacidspecific protease， Caspase）（如 Caspase-3、Caspase-9、Caspase-8）促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[]。UA已被證明可以抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signaltransductionandactivatoroftranscription3，STAT3）活化，抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移。也有研究表明，UA可以通過靶向整合素 αVβ5/ 基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetal-loproteinases，MMP）信號通路抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor- _?β1 ，TGF-β1）誘導(dǎo)的H1975細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，為有前景的治療NSCLC的藥物[10]。

代謝組學(xué)技術(shù)通過代謝物檢測和生物學(xué)分析研究生物體的生理和疾病狀態(tài)，可用于藥物作用機(jī)制研究和疾病的臨床診斷等]。其中，LC-MS/MS法以能快速篩選多種樣品和具有高分辨率而成為代謝研究的首選方法[12]。血清代謝組學(xué)可以識別潛在的生物標(biāo)志物和相關(guān)的代謝途徑[13]。因此，本研究探討UA對EGFR-TKI耐藥的NSCLC細(xì)胞系H1975細(xì)胞的體內(nèi)外抑制作用，并采用UPLC-MS/MS方法檢測荷瘤裸鼠血清中內(nèi)源性差異代謝物，探討UA對NSCLC體內(nèi)代謝的影響。

1材料

1.1 細(xì)胞和動物

H1975細(xì)胞系購自中國西安茂鑫生物科技有限公司：60只體質(zhì)量（ 20±2） g的5＼～6周齡SPF級BALB/c雌性裸鼠[動物許可證號：SCXK（川）2020-0030]購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司。動物飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心[批準(zhǔn)號：SYXK（陜）2017-004]，溫度（ 24±0.3 ） C ，濕度 54%±1% ，室內(nèi)保持 12h 明暗交替。動物實(shí)驗(yàn)按照陜西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)的方案進(jìn)行（動物倫理批準(zhǔn)號：SUGMDL20200520001）。

1.2主要試劑和儀器

UA（純度 98% ）、吉非替尼（純度 99% ）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：A1810044、F190168）;組織金屬蛋白酶抑制因子-2（tissueinhi-bitorof metalloprotease ^-2 ，TIMP-2）抗體（英國Ab-cam公司，批號：ab180630）;B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-celllymphoma-2，Bcl-2）、Caspase-3、活化的胱天蛋白酶-3（Cleaved-Caspase-3）抗體（美國Cell SignalingTechnology公司，批號：15071、9662、9661）;MMP-2、MMP-9、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associatedX，Bax）抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：10373-2-AP、10375-2-AP、50599-2-lg）；PI染色細(xì)胞周期檢測試劑盒（沈陽萬世生物科技有限公司，批號：14A109）;AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（諾維生生物技術(shù)有限公司，批號：7E572G1）。

酶標(biāo)儀（美國BioTek公司，型號：Synergy H11）;熒光顯微鏡（日本Olympus公司，型號：OlympusFSX10O）；流式細(xì)胞儀（美國BectonDickinson公司，型號：FACSVerse）;凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司，型號：ChemiDoc XRS+ ）。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)和分組

H1975細(xì)胞系在含有 100U/mL 青霉素、 100U/mL 鏈霉素、 10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。H1975細(xì)胞接種至96孔板中，每孔密度為 1× 10⁵ 個細(xì)胞， 24h 后，用不同濃度 （0～75μg/mL 的UA分別處理H1975細(xì)胞 24，48，72h_? 加人MTT溶液 5mg/mL） ，置于培養(yǎng)箱 ⁴h ，每孔加入DMSO150μL 。用酶標(biāo)儀在 490nm 處檢測吸光度，并用SPSS26.0軟件計(jì)算 IC₅₀ 值，得出UA作用細(xì)胞 ^48h 的 IC₅₀ 值為 27.8μmol/L 。因此，將細(xì)胞設(shè)置為對照組及UA低 （9.27μmol/L） 、中（ 18.53μmol/L ）、高（27.8μmol/L） 劑量組進(jìn)行劃痕、免疫熒光、流式、Western bolt實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

將H1975以 1×10⁶ 個 ?/mL 密度接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，用移液管尖端在孔中心劃痕，然后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 0，24，48h 。在每個時間點(diǎn)使用顯微鏡拍照，每次固定位置拍照，測量各時間點(diǎn)劃痕寬度，根據(jù)公式計(jì)算：相對劃痕間隙 τ=t 時刻劃痕間隙/0h 劃痕間隙。

2.3 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

將H1975細(xì)胞接種于帶有細(xì)胞爬片的6孔板中。待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行藥物處理， ^48h 后，用PBS洗滌細(xì)胞2次，用 4% 多聚甲醛校正 10min ，用 0.1% TritonX-100固定 10min ，用 5% BSA封閉。將Ki67抗體稀釋后加入細(xì)胞中， 4‰ 過夜。二抗孵育 ¹h ，用DAPI試劑染色固定細(xì)胞核。使用熒光顯微鏡進(jìn)行免疫熒光檢測。

2.4 Western blot法

用預(yù)冷PBS洗滌H1975細(xì)胞，用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物的RIPA緩沖液裂解。采用BCA法對蛋白進(jìn)行定量檢測。蛋白經(jīng)過 10% 或 12% 的SDS-PAGE進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用 2.5% 脫脂奶粉在室溫下封閉 ^2h 。取稀釋后的抗體[TIMP-2（1：1 000）MMP-9（1：1 500）、MMP-2（1：800）、Bcl-2（1：1 000）、Bax（1：8 00O）、Cleaved-Caspase ^-3 （1：1000）Caspase-3（1：1000）]加至膜上，在4 C 條件下孵育過夜。洗滌后，孵育二抗， 37°C 孵育 ¹h ，再次洗滌。PVDF膜加入ECL檢測試劑，使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測。采用ImageJ軟件對結(jié)果進(jìn)行灰度值分析和量化。

2.5 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

H1975細(xì)胞接種于6孔板中，用不同濃度的UA處理H1975細(xì)胞 ^48h ，用胰蛋白酶消化。PBS洗滌2次，懸浮于緩沖液中，與AnnexinV-FITC和PI在室溫下避光孵育 10min 。染色后 ¹h 內(nèi)使用FACS-Verse流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2.6裸鼠腫瘤異種移植實(shí)驗(yàn)

將約 2×10⁶ 個H1975細(xì)胞懸浮于 空白培養(yǎng)基中，注射至裸鼠背部皮下，每2天記錄體質(zhì)量和腫瘤體積（V）， V=0.5× 長 × 寬2，當(dāng)V約為 50mm³ 時（腫瘤接種后 10d ），將裸鼠隨機(jī)分為每組10只。每3天腹腔注射給藥1次，連續(xù) ^18d 。分組及劑量如下：對照組（生理鹽水）吉非替尼組（ 50mg/kg? 和UA低（ 100mg/kg） 、中 （200mg/kg） 高 （400mg/kg） 劑量組[14-15]。最后一次給藥后，裸鼠禁食不禁水過夜，麻醉后取血清和裸鼠腫瘤組織，于 -80^°C 保存。

2.7 血清代謝組學(xué)分析

2.7.1血清樣品制備于冰上解凍采集的血清，取對照組和UA中劑量組，每個血清樣品（ 50μL） 與純甲醇（ 300μL 混合 ，4%.12000r/min 離心 10min （離心半徑 6cm ）。收集上清液， -20^°C 放置 30min 后 ，4C，12 000r/min 離心 3min （離心半徑 6cm ）。取 150μL 上清液進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。取各樣品等體積混合，獲得質(zhì)量控制（quality control，QC）樣品，每10個樣品中插入1個QC樣品以監(jiān)測分析過程的可重復(fù)性。

2.7.2儀器檢測條件采用LC-ESI-MS/MS系統(tǒng)進(jìn)行色譜分析，所有分析均采用WatersACQUITYUPLC HSS T3 C₁₈ 色譜柱 （2.1mm×100mm，1.8μm） 。流動相由溶劑A（ 0.1% 甲酸水溶液）和溶劑B（ 0.1% 甲酸乙腈水溶液）組成。梯度洗脫： 0～10min 95% 210%A;10～11min，10%A;11.0～11.1min，10%～95%A 511.1～14.0min 95%A 。流速 0.4mL/min ，柱溫 40^°C 進(jìn)樣量 2μL 。

采用電噴霧電離對樣品進(jìn)行正、負(fù)離子模式檢測。在 500^qC 條件下建立三重四極線性離子阱質(zhì)譜LC-MS/MS體系。MS在電壓為5500V的正離子模式或電壓為4500V的負(fù)離子模式下工作。離子源氣體I的壓力為 ，離子源氣體Ⅱ的壓力為 ，氣簾氣的壓力為 ，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。

2.7.3代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理使用Analyst1.6軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析;MultiQuant3.03軟件對色譜峰進(jìn)行整合和校正;R3.5.0 軟件（www.r-project.org/）對代謝物數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，包括主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares dis-criminantanalysis，OPLS-DA）。根據(jù)變量對OPLS-DA模型的投影（ VIP?1 ）和差異倍數(shù)值（ Log₂FC 絕對值 ?1 篩選差異代謝物。使用KEGG數(shù)據(jù)庫（http：//www.kegg.jp/kegg/compound/）對代謝物進(jìn)行注釋，并將注釋代謝物輸人KEGGPathway數(shù)據(jù)庫（http：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html）。通過MetaboAnalyst5.0數(shù)據(jù)庫（https：//www.metaboanalyst.ca/）對篩選的差異代謝物進(jìn)行代謝途徑分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“ ”表示。GraphPadPrism8.0軟件用于統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。單因素方差分析用于多組之間的比較，以 Plt;0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1UA對H1975細(xì)胞活力、周期和增殖的影響

UA升高H1975細(xì)胞抑制率，呈劑量和時間相關(guān)性；UA作用于細(xì)胞 24，48，72h 的 IC₅₀ 分別為70.2，27.8，12.9μmol/L 詳見圖1。

與對照組及UA低劑量組比較，UA中、高劑量組 G₀/G₁ 期的細(xì)胞比例增加（ Plt;0.05） ）， G₂ 期和S期的比例降低 （Plt;0.05） 。與UA中劑量組比較，UA高劑量組 G₀/G₁ 期的細(xì)胞比例增加（ Plt;0.05 ），S期的比例降低 （Plt;0.05） 。與對照組比較，UA各劑量組H1975細(xì)胞中Ki67熒光強(qiáng)度減弱。詳見圖2。

3.2 UA對H1975細(xì)胞凋亡的影響

與對照組比較，UA各劑量組H1975細(xì)胞凋亡率升高 （Plt;0.05） ，UA中、高劑量組Bcl-2表達(dá)降低Plt;0.05） ，UA各劑量組Bax和Cleaved-Caspase-3表達(dá)升高 （Plt;0.05） 。與UA低劑量組比較，UA高劑量組H1975細(xì)胞凋亡率和Cleaved-Caspase-3表達(dá)升高 （Plt;0.05） ，UA中、高劑量組Bcl-2表達(dá)降低（ Plt; 0.05）、Bax表達(dá)升高 （Plt;0.05） 。與UA中劑量組比較，UA高劑量組H1975細(xì)胞凋亡率和Cleaved-Cas-pase-3表達(dá)升高 （Plt;0.05） 。詳見圖3。

3.3UA對H1975細(xì)胞遷移的影響

與對照組比較，作用 24h 后UA中、高劑量細(xì)胞劃痕間隙增加 Plt;0.05） ，作用 ^48h 后UA各劑量組細(xì)胞劃痕間隙增加 （Plt;0.05） ：UA各劑量組H1975細(xì)胞TIMP-2表達(dá)水平升高 ，MMP-2和MMP-9表達(dá)降低 （Plt;0.05） 。與UA低劑量組比較，作用24、^48h 后，UA中、高劑量組細(xì)胞劃痕間隙增加（ Plt; 0.05）;UA高劑量組MMP-2表達(dá)降低（ （Plt;0.05） ，UA中、高劑量組TIMP-2表達(dá)升高（ Plt;0.05） ，MMP-9表達(dá)降低 （Plt;0.05） 。與UA中劑量組比較，作用24、^48h 后，UA高劑量組細(xì)胞劃痕間隙增加 （Plt;0.05） ：

注：A.細(xì)胞周期分布圖;B.細(xì)胞周期分布量化圖;C.免疫熒光檢測各組Ki67表達(dá)情況。與對照組比較， ^*Plt;0.05 ;與UA低劑量組比較， ^*Plt;0.05 ;與UA中劑量組比較， □

3.4UA對H1975細(xì)胞移植瘤裸鼠腫瘤生長的影響各組裸鼠體質(zhì)量無顯著變化。與對照組比較，在第28天，吉非替尼組和UA各劑量組抑制H1975異種移植瘤裸鼠的腫瘤增長 （Plt;0.05） ；與UA低、中劑量比較，UA高劑量組抑制H1975異種移植瘤裸鼠的腫瘤增長 （Plt;0.05） 。詳見圖5。

3.5UA對H1975移植瘤裸鼠血清代謝組學(xué)的影響

PCA結(jié)果顯示，各組血清樣本之間有分離的趨勢，UA中劑量組給藥后血清樣本遠(yuǎn)離對照組，表明UA中劑量組治療后裸鼠血清代謝發(fā)生變化。O-PLS-DA評分圖結(jié)果顯示，UA中劑量組和對照組可以較好分開。根據(jù)各變量的分布確定各組化合物的差異。對照組和UA中劑量組的 R²Y=0.998，Q²= 0.722，表明所建立的兩模型的數(shù)據(jù)均有效且可靠。詳見圖6。

3.5.1血清內(nèi)源性差異代謝物與對照組比較，UA中劑量組維生素 D₃ 阿糖肌苷、甲基馬來酸、黃嘌呤核苷、5S，15S-二羥基-6E，8Z，10Z，13E-二十碳四烯酸、前列腺素 F2α 、維生素 B₅ 和腎上腺酸8個代謝物上調(diào)；4-羥基苯甲醇、N-乙酰-L-酪氨酸、3-脲基丙酸、9，12-十八碳二烯酸、高 -γ- 亞麻酸、氧化三甲胺、23-脫甲脫氧膽酸和左旋甲狀腺素等14個代謝物下調(diào)。KEGG通路富集結(jié)果顯示，UA中劑量組處理后差異代謝物主要富集于甲狀腺激素合成、甲狀腺激素信號通路、自身免疫性甲狀腺疾病等20條通路中。詳見表1、圖7。

3.5.2差異代謝物代謝通路將顯著變化的差異代謝物通過MetaboAnalyst5.0進(jìn)行通路富集分析，有9條代謝途徑與UA的抗腫瘤作用相關(guān)。UA干預(yù)NSCLC主要與酪氨酸代謝（ P=0.01 ， Impact=0.01 ）、亞油酸代謝（ P=0.05 ，Impact _=1.00 ）和不飽和脂肪酸的生物合成 （P=0.05，Impact=0.00） 有關(guān)。根據(jù)代謝途徑中的差異代謝物構(gòu)建代謝網(wǎng)絡(luò)圖。詳見圖8—9。

4討論

目前，解決治療NSCLC藥物出現(xiàn)的耐藥性是治療NSCLC的首要問題。有研究表明，UA對NSCLC細(xì)胞系H460、H1975、A549、H1299、H520均有抑制作用，能夠誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞的凋亡和自噬，通過抑制mTOR信號通路而非激活ERK1/2信號通路[1因此，本研究從體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討UA治療NSCLC的作用機(jī)制。

癌細(xì)胞周期發(fā)生異常會導(dǎo)致細(xì)胞快速增殖，因此，調(diào)控癌細(xì)胞周期進(jìn)程對其增殖具有重要意義[]。本研究結(jié)果表明，UA能阻斷H1975細(xì)胞于 G₀/G₁ 期，使其在DNA準(zhǔn)備復(fù)制階段受到抑制，而抑制細(xì)胞增殖。有研究表明，UA作用于NSCLCA549細(xì)胞可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在 G₀/G₁ 期[18]。細(xì)胞凋亡是一注：1.酪氨酸代謝;2.亞油酸代謝;3.不飽和脂肪酸的生物合成；4.α-亞麻酸代謝；5.泛酸和輔酶A生物合成；6.β-丙氨酸代謝；7.嘧啶代謝;8.類固醇生物合成;9.嘌呤代謝。

種程序性死亡，其能有效清除受損細(xì)胞，在癌癥治療中發(fā)揮重要作用[]。Bcl-2家族通過高度調(diào)控抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax之間的平衡，影響細(xì)胞凋亡的進(jìn)程[20]。Cleaved-Caspase-3是Caspase-3的活性形式，也存在于凋亡細(xì)胞中。本研究結(jié)果顯示，UA可顯著上調(diào)Bax和Cleaved-Caspase-3蛋白水平，下調(diào)Bcl-2蛋白水平，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。MMPs與腫瘤的生長發(fā)育密切相關(guān)，MMP-2和MMP-9是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中重要的蛋白酶，而TIMPs抑制MMP-2和MMP-9的活性[2]。本研究結(jié)果顯示，UA可顯著下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，上調(diào)TIMP-2的表達(dá)，阻止H1975細(xì)胞遷移。綜上所述，本研究結(jié)果表明UA可以抑制H1975細(xì)胞的增殖、遷移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。體內(nèi)研究結(jié)果顯示，UA對H1975細(xì)胞移植瘤裸鼠腫瘤生長有抑制作用，表明其能抑制荷瘤動物腫瘤生長。

腫瘤代謝過程中，代謝物水平反映代謝酶活性，干預(yù)其活性或途徑可能抑制腫瘤進(jìn)展[22]。據(jù)報道，UA在含有原型輔酶Ⅱ生成系統(tǒng)的人肝微粒體孵育液中發(fā)生代謝，且UA能夠抑制人肝微粒體中的CYP450同工酶，而CYP450可能參與UA在機(jī)體內(nèi)的代謝過程2。在NSCLC異種移植模型中UA的血清代謝組學(xué)研究尚未見報道。在本研究中，UA改變了H1975荷瘤裸鼠的內(nèi)源性代謝物。對照組氧化三甲胺水平上調(diào)，該內(nèi)源代謝物上調(diào)可誘發(fā)心血管疾病、代謝綜合征和癌癥24]。高水平的氧化三甲胺促進(jìn)炎癥發(fā)生，能形成或產(chǎn)生N-亞硝基化合物和超氧化物，導(dǎo)致和誘發(fā)癌癥的發(fā)生[25-27]。氧化三甲胺的升高注：與對照組比較，UA中劑量組處理后，紅色標(biāo)記代謝物呈上調(diào)，綠色標(biāo)記代謝物呈下調(diào)。

被認(rèn)為是腫瘤組織增殖的標(biāo)志[28。B族維生素和維生素D可降低氧化三甲胺的水平[29]。在本研究中，UA干預(yù)后，NSCLC裸鼠體內(nèi)維生素D含量升高，氧化三甲胺含量降低。

5S，15S-二羥基-6E，8Z，10Z，13E-二十碳四烯酸可以抑制花生四烯酸衍生的5-脂氧合酶代謝物的合成，進(jìn)而減少雙高- ?γ -亞麻酸代謝產(chǎn)生的花生四烯酸促炎產(chǎn)物[3。在本研究中，UA處理后5S，15S-二羥基-6E，8Z，10Z，13E-二十碳四烯酸上調(diào)。目前，蛋白酪氨酸激酶是抗腫瘤靶向藥物研發(fā)中最理想的“靶點(diǎn)”， 50% 以上的原癌基因和癌基因產(chǎn)物為酪氨酸激酶，其與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、新生血管生成以及化療耐藥性密切相關(guān)[31。酪氨酸激酶的異常表達(dá)會打亂細(xì)胞增殖的規(guī)則，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[32]。據(jù)報道，對羥基苯甲醇可抑制蘑菇酪氨酸酶活性，當(dāng)對羥基苯甲醇與該酶結(jié)合時，酶的構(gòu)象發(fā)生改變，活性降低[33]。在本研究中，UA處理后對羥基苯甲醇和L-酪氨酸減少。對差異代謝物通路進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，UA治療NSCLC的機(jī)制可能與亞油酸代謝、酪氨酸代謝和不飽和脂肪酸生物合成三條代謝通路有關(guān)。

綜上所述，UA可明顯抑制NSCLC細(xì)胞系H1975細(xì)胞在體外的增殖和遷移，促進(jìn)其凋亡，同時還能抑制H1975細(xì)胞在體內(nèi)的生長。本研究首次探究了UA對H1975細(xì)胞移植瘤裸鼠血清差異代謝物的影響，發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤作用可能與不飽和脂肪酸生物合成、亞油酸代謝和酪氨酸代謝有關(guān)。本研究可為UA治療NSCLC的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]中國抗癌協(xié)會腫瘤病理專業(yè)委員會肺癌協(xié)作組，中國抗癌協(xié)會 腫瘤病理專業(yè)委員會分子病理協(xié)作組，國家癌癥中心，等.非小 細(xì)胞肺癌 BRAF V60OE突變免疫組織化學(xué)檢測中國專家共識[J] 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2024，40（10）：1021-1026.

[2]OGISO H，ISHITANIR，NUREKIO，et al.Crystalstructure of the complex of human epidermal growth factor and receptor extracellular domains[J].Cell，2002，110（6）：775-787.

[3]王安，李濤，盧迪，等.晚期經(jīng)治非小細(xì)胞肺癌EGFRTKIs獲得性RET融合突變耐藥的研究進(jìn)展[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜 志，2024，49（9）：1080-1087.

[4]WANG S H， CANG S D，LIU D L. Third-generation inhibitors targeting EGFR T79OM mutation in advanced non-small cell lungcancer[J]. Journalof Hematologyamp;Oncology，2016，9：34.

[5] SINGH M， JADHAV H R. Targeting non-small cell lung cancer withsmall-moleculeEGFRtyrosinekinaseinhibitors[J].Drug Discovery Today，2018，23（3）： 745-753.

[6] IKEDA Y， MURAKAMI A， OHIGASHI H. Ursolic acid： An anti-andpro-inflammatory triterpenoid[J].Molecular Nutritionamp; Food Research， 2008， 52（1）： 26-42.

[7] NGUYEN HN， ULLEVIG S L， SHORT J D， et al. Ursolic acid andelatedanalogues：Triterpenoidswithbroadealthbefis] Antioxidants， 2021，10（8）：1161-1185.

[8] LI Y L，XING D，CHEN Q，et al. Enhancement of chemotherapeutic agent-induced apoptosisby inhibition of NF-kB using ursolic acid[J]. International Journal of Cancer，2010，127（2）：462- 473.

[9]劉榮榮，張濤，相芬芬，等．熊果酸對 IL-6介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞 侵襲與遷移的抑制作用[J].中國藥房，2023，34（8）：955-960.

[10] RUAN JS，ZHOU H， YANG L，etal. Ursolic acid attenuates TGF-β1-induced epithelial-mesenchymal transition in NSCLC by targeting integrinαVβ5/MMPs signaling[J]. Oncology Research， 2019， 27（5）： 593-600.

[11] HE W J， CAO D M，CHEN YB，et al. Explore of the beneficial effects of Huang-Lian-Jie-Du Decoction on diabeticencephalopathy in db/db mice by UPLC-Q-Orbitrap HRMS/MS based untargeted metabolomics analysis[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2021，192：113652.

[12] ZHOU B，XIAO JF，TULI L， et al LC-MS-based metabolomics[J]. Molecular BioSystems，2012， 8（2）： 470-481.

[13] JOHNSON C H， IVANISEVIC J， SIUZDAK G. Metabolomics： Beyond biomarkers and towardsmechanisms[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology，2016，17（7）：451-459.

[14] SHANMUGAM M K， RAJENDRAN P， LI F， et al. Ursolic acid inhibitsmultiple cellsurvival pathwaysleading tosuppression of growth of prostate cancer xenograft innude mice[J]. Journal of Molecular Medicine，2011，89（7）： 713-727.

[15] HSU H Y，YANG JJ，LIN C C. Effects of oleanolic acid and ursolicacid oninhibiting tumorgrowth and enhancing therecoveryof hematopoietic system postirradiationin mice[J]. Cancer Letters，1997，111（1/2）：7-13.

[16] WANG M，YU H，WUR，et al. Autophagy inhibition enhances theinhibitory effects of ursolicacidon lung cancer cells[J]. International Journal of Molecular Medicine，2O20，46（5）：1816- 1826.

[17]LUO YH，LI JQ， ZHANG Y，etal.Quinalizarininduces cyclearrestandapoptosisviareactiveoxygenspecies-mediated signaling pathwaysin human melanoma A375 cels[J].Drug Development Research，2019，80（8）： 1040-1050.

[18]KANGDY，SPN，LEEJM，etal.Antitumor effects ofursolic acid through mediating the inhibition of STAT3/PD-L1 signaling in non-small cell lung cancer cells[J]. Biomedicines， 2021，9 （3）： 297.

[19] PISTRITTO G，TRISCIUOGLIO D， CECI C， et al. Apoptosis as anticancer mechanism：Function and dysfunction of its modulators and targeted therapeutic strategies[J]. Aging，2O16，8（4）： 603-619.

[20]HAFEZI S，RAHMANI M. Targeting BCL-2 in cancer： Advances， challenges，and perspectives[J]. Cancers，2021，13（6）： 1292.

[21] QUINTERO-FABIAN S， ARREOLA R， BECERRIL-VILLANUEVAE，et al.Role of matrix metalloproteinases in angiogenesis and cancer[J]. Frontiersin Oncology，2019，9：1370-1391.

[22] SCHMIDTD R，PATEL R，KIRSCH D G，et al.Metabolomics in cancer research and emerging applications in clinical oncology[J].CA Cancer Journal for Clinicians，2021，71（4）：333-358.

[23] KIM K A，LEE J S，PARK HJ，et al. Inhibition of cytochrome P45O activitiesby oleanolic acid and ursolic acidin human liver microsomes[J]. Life Sciences，2004，74（22）：2769- 2779.

[24] GATAREK P， KALUZNA-CZAPLINSKA J. Trimethylamine Noxide（TMAO） inhuman health[J]. EXCLI Journal，2021，2O：301- 319.

[25] SELDIN M M， MENG Y H，QI H X， et al. Trimethylamine Noxidepromotes vascular inflammation through signaling of mitogen-activated protein kinase and nuclear factor-kB[J]. Journal of the American Heart Association，2016，5（2）：e002767.

[26] OELLGAARD J，WINTHER S A，HANSEN T S， et al. Trimethylamine N-oxide （TMAO） as a new potential therapeutic target forinsulin resistance and cancer[J].Current Pharmaceutical Design，2017，23（25）：3699-3712.

[27]KHODABAKHSHI A， MONFARED V，ARABPOUR Z， et al.Association between levels of trimethylamine N-oxide and cancer： Asystematic review and meta-analysis[J].Nutrition and Cancer， 2023，75（2）： 402-414.

[28] CHHIBBER-GOEL J，GAUR A，SINGHAL V，et al. The complexmetabolism of trimethylamine in humans：Endogenous and exogenous sources[J]. Expert Reviews in Molecular Medicine， 2016，18：e8.

[29] OBEID R，AWWAD HM，KIRSCHSH， etal.Plasma trimethylamine-N-oxide following supplementation with vitamin D orD plusBvitamins[J].Molecular Nutrition amp; Food Research，2017， 61（2）： 1600358-1600382.

[30] WANG X P，LIN H P，GU Y. Multiple roles of dihomo-γ- linolenic acid against proliferation diseases[J].Lipids in Health and Disease，2012，11：25-34.

[31]陳思宇，王毅剛.新型受體酪氨酸激酶ROR1及其靶向腫瘤治 療的研究進(jìn)展[J].中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報，2025，47（1）：111-122.

[32] 李雪瀅，王覓柱.脾酪氨酸激酶在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用的研究 進(jìn)展[J].癌癥進(jìn)展，2022，20（17）：1737-1741，1746.

[33] LIU SH，PAN I H， CHU I M. Inhibitory effect of p-hydroxybenzyl alcohol on tyrosinase activityand melanogenesis[J].Biologicalamp;Pharmaceutical Bulletin，2007，30（6）：1135-1139.

（本文編輯 周旦）