基于有氧糖酵解探究補骨生髓方含藥血清通過介導HIF-1α促進MC3T3-E1細胞成骨分化的作用

[摘要]目的探討補骨生髓方（BGSSD）含藥血清通過缺氧誘導因子- -1α（HIF-1α） 介導MC3T3-E1細胞有氧糖酵解過程對成骨分化的影響。方法 選取18只SD大鼠隨機分為含藥血清組和空白血清組，各9只。含藥血清組按生藥量 5.87g/（kg?d） 給予BGSSD藥液灌胃，空白血清組給予 20mL/（kg?d） 蒸餾水灌胃，連續灌胃9次后收集腹主動脈血液，獲取BGSSD含藥血清和空白血清。將MC3T3-E1細胞分為空白血清組、含藥血清組和有氧糖酵解抑制劑組，并將HIF- ??1α∝ 慢病毒轉染穩定的MC3T3-E1細胞作為SiRNAHIF- ?1α 組。空白血清組加入含 20% 空白血清的 α? -MEM培養基，含藥血清組和SiRNA HIF- ?1α 組均加入含 20% BGSSD含藥血清的 α? -MEM培養基，有氧糖酵解抑制劑組加入含 20% BGSSD含藥血清和 8mmol/L 抑制劑2-脫氧葡萄糖的 ∝ -MEM培養基。采用堿性磷酸酶（ALP）染色法觀察4組培養7d后的黑色沉淀物情況;ELISA檢測培養 ^48h 后細胞上清液中ALP和丙酮酸（PA）乳酸（LA）的含量;qRT-PCR和Westernblot檢測培養 ^48h 后細胞HIF-1α、Runt相關轉錄因子2（RUNX2）、丙酮酸脫氫酶激酶1（PDK1）mRNA相對表達水平和蛋白表達量。結果與空白血清組比較，含藥血清組的黑色沉淀物明顯增加、顏色加深，ALP，LA、PA含量均升高（ Plt;0.05） ，PDK1、RUNX2、HIF- ??1αα mRNA相對表達水平和蛋白表達量均升高（ Plt;0.05 。與含藥血清組比較，SiRNAHIF- 組和有氧糖酵解抑制劑組的黑色沉淀物減少、顏色變淺，ALP、LA及PA含量均降低（ ，PDK1RUNX2的mRNA相對表達水平和蛋白表達量均降低 （Plt;0.05） ;SiRNA HIF- ??1α∝ 組HIF- ??1α∝ 的mRNA相對表達水平和蛋白表達量降低 Plt;0.05， 。結論BGSSD可能通過HIF- 1α 介導有氧糖酵解促進MC3T3-E1細胞成骨分化，其作用機制可能與調控HIF-1α/PDK1通路相關。

本文引用：.基于有氧糖酵解探究補骨生髓方含藥血清通過介導HIF-1α促進MC3T3-E1細胞成骨分化的作用[J].湖南中醫藥大學學報，2025，45（5）：818-824.

[關鍵詞]骨質疏松癥；補骨生髓方；有氧糖酵解；MC3T3-E1細胞；骨形成 [中圖分類號]R285.5 [文獻標志碼]A [文章編號]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.05.006

[Abstract]ObjectiveToinvestigatetheefectsof theBugu ShengsuiDeocoction （BGSSF）containingserumonosteogenic differentiatonofMC3T3-E1cellbymediatingaerobicglyolysisthroughhypoxia-induciblefactor-1α（HIF-1α）MethodsAtotal of18SDrats wererandomlydividedintoa drug-containing serum groupandablank serum group，with ninerats in each group. Thedrug-containingserumgroupwasadministeredBGSSDsolutionbygavageatarawdrugdoseof5.87g/kg·d），whiletheblank serumgroupwasgivendistiledwaterbygavageatavolumeof2Om（kg·d）.Afternineconsecutivegavages，bloodwascolected fromtheabdominalaortatoobtainserumcontaining BGSSDand blankserum.MC3T3-E1cells weredividedintoa blank serum group，adrug-containingserumgroup，andanaerobicglycolysisiibitorgroup.Additionally，MC3T-E1cellsstablytranected with HIF- ??lαα lentivirus were designated as the SiRNA HIF- ??lα group. The blank serum group was cultured in α -MEM medium containing 20% blank serum，while both the drug-containing serum group and the SiRNA HIF- ??l∝ group were cultured in α -MEM medium containing 20% serum containing BGSSD. The aerobic glycolysis inhibitor group was cultured in α -MEM medium containing 20% BGSSFcontaining serum and 8 mmolL of the inhibitor2-deoxyglucose. Alkalinephosphatase （ALP） staining was used toobservetheblack precipitates inthefour groupsaftersevendaysofculture.ELISAwasemployedtodeterminethecontent of ALP，pyruvicacid（PA），andlacticacid（LA）inthecellsupematantafter48hoursofculture.qRT-PCRandWesteblotwere utilized tomeasuretherelativemRNAexpresionlevelsandproteinexpressionamountsofHF-1αRuntrelatedtrascription factor2RUNX2），and pyuvatedehydrogenase kinase1（PDK1）inthecelsafter48hoursofculture.ResultsComparedwitheblank sermgroup，thedrug-containingserumgroupexhibitedanotableincreaseinblack precipitates withdepercoloration，along with elevated levels of ALP， LA，and PA （P lt;0.05）.Additionally，，the relative mRNA expression levels and protein expression amounts of PDK1， RUNX2， and HIF- ??l∝ all increased in the drug-containing serum group （ P- lt;0.05）.Compared with the drug-containing serum group，theSiRNAHIF-lαgroupandtheaerobicglycolysisinhibitorgroupshowedreducedblackprecipitateswithlighter coloration，as well as decreased levels of ALP，LA，and PA（ P lt;0.05）.The relative mRNA expression levels and protein expression amounts of PDK1 and RUNX2 also decreased in these two groups （ P lt;0.05）.The relative mRNA expression levels and protein expression amounts of HIF-1α reduced in the SiRNA HIF-1α group （ P lt;0.05）. Conclusion BGSSD may promote osteogenic diferentiationofMC3T-E1cellbymediatingaerobicglycolysistroughHF-l，anditsmechanismofactionmightbeelatedto the regulation of the HIF-1α/PDK1 pathway.

[Keywords]osteoporosis;Bugu Shengsui Decoction;aerobic glycolysis；MC3T3-E1 cels;bone formation

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是一種代謝性骨科疾病，其微觀表現為單位體積骨量下降、骨強度降低和骨脆性增加，在肌肉含量和力量下降以及跌倒等因素的共同影響下容易發生骨折，對患者生活和經濟造成極大的負擔[1-2]。OP的病理機制主要是成骨細胞介導的骨形成與破骨細胞介導的骨吸收失衡，致使機體骨量丟失。當前，臨床藥物主要通過抑制破骨細胞功能實現OP治療，如雙磷酸鹽類藥物憑借與骨組織的高親和力，在骨重建活躍處接觸結合，抑制破骨作用和骨吸收，但長期使用可增加下頜骨壞死的風險4。臨床上可促進骨形成的生物制劑為特立帕肽，其可緩解患者的癥狀，延緩機體骨量丟失的進程，但存在治療周期長、患者依從性差和治療費用高等不足，一定程度上限制了其在臨床的應用。為獲得更好的OP臨床療效，提高患者的依從性，尋找合適且便捷的治療方法和手段是目前治療OP的重要科學問題。

中藥復方因具有多靶點和多組分的特征，在OP治療中有明顯優勢。中醫學認為OP屬于“骨痿\"范疇，其病機為腎虛髓減、髓虧失養。補骨生髓方（Bugu Shengsui Decoction，BGSSD）具有補益肝腎、健脾益氣活血的功效，臨床試驗表明，其可提高骨密度、抑制骨吸收、防治骨量丟失、改善OP的癥狀[]。研究發現，缺氧誘導因子 -1α （hypoxia-inducible fac-tor-1α， HIF-1α ）是有氧糖酵解的關鍵調節因子，可通過誘導靶向關鍵酶丙酮酸脫氫酶激酶1（pyruvatedehydrogenasekinase1，PDK1）來調控有氧糖酵解途徑。而有氧糖酵解是MC3T3-E1細胞適應內環境變化的一種能量代謝方式，為骨形成提供重要的生物動力[10]。可見有氧糖酵解和 HIF-1α 與骨形成存在緊密聯系，是OP發生的一個重要因素。前期研究發現，BGSSD對MC3T3-E1細胞成骨分化有較好的促進作用，并且可上調小鼠骨組織中 HIF-1α 的蛋白表達，而BGSSD是否通過 HIF-1α 影響成骨細胞的有氧糖酵解進行成骨分化調控有待探究]。因此，本研究擬從 HIF-1α 介導有氧糖酵解的角度，探索BGSSD含藥血清調控MC3T3-E1細胞成骨分化的分子機制。

1材料

1.1 細胞及動物

小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1細胞系，貨號：

06.1187，購自北京中生奧邦生物科技有限公司。18只2月齡SD大鼠，SPF級，體質量（ 300±30 ） g ，購自北京大學醫學部（實驗動物科學部），質量合格證編號為SCXK（京）2022-0009。所有大鼠均飼養于中國中醫科學院中醫基礎理論研究所實驗動物中心（SPF級），飼養溫度為 ，濕度為 55%～65% ，日照時間為8：00至19：00，按照實驗動物中心要求，每周更換2次墊料，保持環境干燥。本實驗已通過中國中醫科學院中醫基礎理論研究所實驗動物中心倫理委員會審查批準，動物倫理批號為IBTCMCACMS21-2403-08。

1.2 實驗藥物

BGSSD由骨碎補、補骨脂、三七、人參、生牡蠣、狗脊、枸杞子、砂仁8味藥組成，由中藥房提供。將藥物加入純凈水中，完全在水面下浸泡 ¹h 。通過中藥熬藥濃縮煎藥機進行煎煮，大火燒開后轉小火煎煮 40min ，然后將藥液全部轉移至清潔容器;再加入適量純凈水進行煎煮，同樣操作 40min 后倒渣取汁。將2次煎煮藥汁混合，紗布過濾，并濃縮至濃度為 0.406g/mL ，該濃度在前期體內動物實驗中干預效果最佳，故選此作為后續含藥血清制備干預濃度。最后倒入三七粉并攪拌均勻，在 4‰ 冰箱中保存[]。

1.3 主要試劑

α -MEM培養基（上海源培生物科技股份有限公司，批號：L571KJ）；胎牛血清（批號：A5669701）、青鏈雙抗（批號：15070063）、胰蛋白酶（批號：15050065）均購自美國Gibco公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（批號：A0208）、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（批號：A0216）、細胞裂解液（批號：P0013）BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：P0010）均購自上海碧云天生物技術有限公司;PDK1（批號：18262-1-AP）Runt相關轉錄因子2（Runtassociated transcription factor 2，RUNX2）（批號：20700-1-AP）、GAPDH（批號： 60004-1-1g 抗體均購自美國Proteintech公司； HIF-1α 抗體（美國CellSignalingTechnology公司，批號：14179s）；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）ELISA 試劑盒（武漢華聯科生物技術有限公司，批號：HL-ALP-48T）；乳酸（lacticacid，LA））含量檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：BC2235）；丙酮酸（pyruvic acid，PA）含量檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號：BC2205）；SYBR熒光定量聚合酶鏈反應預混液（批號：Q331-03）HiScriptⅡ逆轉錄酶第一鏈合成試劑盒（批號：R223）均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司：總RNA提取試劑盒（中國新賽美生物科技有限公司，批號：M5102）；成骨鑒定試劑盒（ALP鈣鈷染色法）（江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號：KGA353）。

1.4 主要儀器

CO₂ 恒溫細胞培養箱（日本Panasonic公司，型號：MCO-18AC）;恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司，型號：DK-500）;超純水機（美國Millipore公司，型號：MILLI-QB）；水平搖床（美國Scilogex公司，型號：SLK-O3000-S）; pH 計（德國Metter-Toledo公司，型號：LP115）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司，型號：CPA）；磁力攪拌器（江蘇省金壇市中大儀器廠，型號：T8-1）；酶標儀（美國Thermo公司，型號：muLISKANMK3）；全自動化學發光分析儀（上海天能科技有限公司，型號： 5260Mui ；實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司，型號：ABI7500）。

2方法

2.1 血清制備

18只SD大鼠隨機分為含藥血清組和空白血清組，各9只。適應性喂養1周后，按照 60kg 成人與300g 大鼠體表面積換算公式進行換算[12]。含藥血清組按生藥量 5.87g/（kg?d） 給予BGSSD藥液灌胃，空白血清組給予 20mL/（kg?d） 蒸餾水灌胃，每日給藥2次，連續灌胃5d，最后1d僅灌胃1次，共灌胃9次。最后1次灌胃給藥 ¹h 后，使用 5% 異氟醚吸入麻醉，收集大鼠的腹主動脈血液后通過脊柱脫白法處死大鼠， 4% 下放置 ¹h 。 4‰ 下 離心 10min （離心半徑為 8cm ）。將收集到的空白血清和BGSSD含藥血清置于 56°C 水浴加熱 30min 滅活處理， 0.22μm 微孔濾膜過濾，儲存于 -80^°C 冰箱備用。

2.2 細胞培養

將原代MC3T3-E1細胞復蘇并傳代，使用含10% 胎牛血清、 1% 青鏈霉素雙抗的 αα-MEM 完全培養基，在 37% CO₂ 的細胞培養箱中進行培養，將細胞培養至第3＼～5代用于實驗。在實驗進行前均將MC3T3-E1細胞進行去血清培養，饑餓處理 24h 以保證細胞同步化。

2.3 分組及干預

參照前期研究結果，BGSSD含藥血清干預MC3T3-E1細胞的最佳給藥濃度為 20% 、最佳給藥時間為 。將MC3T3-E1細胞分為空白血清組、含藥血清組和有氧糖酵解抑制劑組，并將 HIF-1α 慢病毒轉染穩定的MC3T3-E1細胞作為SiRNAHIF-1α 組。接種鋪板后待細胞生長至 70% 融合面積，使用無血清培養基饑餓處理 24h 后，空白血清組加入含 20% 空白血清的 ∝ -MEM培養基;含藥血清組和SiRNA HIF-1α 組均加入含 20% BGSSD含藥血清的 ∝ -MEM培養基；有氧糖酵解抑制劑組加入含 20% BGSSD含藥血清和8mmol/L2-脫氧葡萄糖的 α- MEM培養基。

2.4ALP染色觀察細胞礦化情況

將細胞接種于6孔板中，培養7d，待生長培養至 80%～90% ，用PBS溶液清洗2遍， 70% 乙醇固定。加入孵育工作液于 37^°C 下孵育 180min 水洗 。染色A液室溫孵育 5min 后水洗 2min ，染色B液室溫孵育 1min 后水洗 5min ，應用顯微鏡觀察細胞礦化情況并拍照。

2.5ELISA 檢測ALP、LA、PA含量

選取第3代生長情況適宜的MC3T3-E1細胞，接種于96孔細胞培養板中，每組設3個復孔，在 5% CO₂，37 （ C 培養箱中孵育 48h 后收集各組細胞上清液，并按照ELISA試劑盒說明書操作檢測ALP、LA、PA含量。

2.6qRT-PCR檢測PDK1、RUNX2、HIF-1α mRNA相對表達水平

將MC3T3-E1細胞接種于6孔細胞培養板，每組設3個復孔，干預結束后經胰蛋白酶消化，離心收集細胞沉淀，Trizol法收集樣本RNA，逆轉錄得到樣本的cDNA。引物序列由上海捷瑞生物有限公司設計與合成，見表 1 PCR擴增條件：95 C，30 s， 95^°C 、10s，60%30s，40 個循環。以GAPDH為內參，采用 2^-ΔΔG 法計算與分析mRNA相對表達量。

2.7 Western blot檢測PDK1、RUNX2、HIF- ?1α 蛋白表達量

使用6孔細胞培養板接種細胞，每組設3個復孔，干預結束后胰蛋白酶消化并離心收集細胞沉淀，細胞裂解液裂解細胞，BCA法檢測蛋白濃度。煮沸5min 使蛋白變性，經SDS-PAGE電泳、轉膜后，使用含 5% 脫脂奶粉的TBST溶液封閉 ^2h ，置于PDK1（1：1 000）RUNX2（1：20O）HIF- 1α （1：1000）一抗中 4°C 孵育過夜，清洗3＼～4次后置于相應二抗（1：1000）中孵育 2h 應用全自動化學發光分析儀系統成像，采用ImageJ軟件進行灰度值分析，統計各組蛋白相對表達量。

2.8 統計學方法

采用SPSS26.0軟件對數據進行分析。計量資料符合正態分布者以‘ x±s \"表示，組間比較采用單因素方差分析。若方差齊，兩兩比較采用LSD-t檢驗；若方差不齊，則采用Games-Howell檢驗。以 Plt;0.05 為差異有統計學意義。

3結果

3.1 各組細胞礦化情況比較

與空白血清組比較，含藥血清組黑色沉淀物明顯增加、顏色加深；與含藥血清組比較，SiRNAHIF-1α 組和有氧糖酵解抑制劑組黑色沉淀物減少、顏色變淺。詳見圖1。

3.2各組細胞ALP、LA、PA含量比較

與空白血清組比較，含藥血清組ALP、LA、PA含

量均升高 （Plt;0.05） ；與含藥血清組比較，SiRNAHIF-1α 組和有氧糖酵解抑制劑組ALP、LA及PA含量均降低（ Plt;0.05） 。詳見圖2。

3.3各組細胞PDK1、RUNX2、HIF-1αmRNA相對表達水平比較

與空白血清組比較，含藥血清組PDK1、RUNX2、HIF-1αmRNA相對表達水平均升高 （Plt;0.05） ；與含藥血清組比較，SiRNA HIF- ??1α∝ 組和有氧糖酵解抑制劑組PDK1、RUNX2的mRNA相對表達水平均降低（ （Plt;0.05） ，SiRNA HIF- ??1α∝ 組 HIF-1α 的mRNA相對表達水平均降低 （Plt;0.05） ）。詳見圖3。

3.4各組細胞PDK1、RUNX2、HIF- ??1αα 蛋白表達量比較

與空白血清組比較，含藥血清組PDK1、RUNX2、HIF-1α 蛋白表達量均升高 （Plt;0.05） 。與含藥血清組比較，SiRNA HIF-1α 組和有氧糖酵解抑制劑組

PDK1、RUNX2蛋白表達量均降低（ _Plt;0.05） ;SiRNAHIF-1α 組 HIF-1α 蛋白表達量降低 （Plt;0.05） 。詳見圖4-5。

4討論

BGSSD是由周文泉主任和謝雁鳴主任、王永炎院士依據臨床OP發病特點聯合創制而成。前期臨床研究表明，BGSSD可改善原發性OP患者腎陽虛癥狀、提高骨密度值。目前，成骨細胞分化研究多聚焦于自分泌、旁分泌及內分泌信號通路介導的分子對成骨細胞特異基因表達與成骨分化的調控，而忽視了其獲得特定生物學功能時的能量代謝調控。研究表明，成熟的成骨細胞雖富含線粒體，但即便在O₂ 充足時，仍優先通過糖酵解將葡萄糖轉化為LA進行細胞供能，而非通過線粒體的三羧酸循環供能，這種現象與瓦氏效應相類似，即有氧糖酵解[13]。因此，注：與空白血清組比較， ^*Plt;0.05 ;與含藥血清組比較， 0進一步探索有氧糖酵解和骨形成的聯系，從有氧糖酵解角度尋找BGSSD治療OP的潛在靶點，對提高其臨床療效具有重要意義。

MC3T3-E1細胞是成骨前體細胞，該細胞與成骨細胞具有相似的增殖、分化細胞特性，因此較多研究以此作為OP的基礎研究模型[4]。細胞能量代謝失衡會對機體骨穩態的平衡造成破壞，進而引起或加劇OP和骨質疏松性骨折等疾病[15]。臨床上常見糖尿病患者并發骨質疏松或骨折，所以機體糖代謝水平與骨穩態存在重要關聯且相互影響[。PDK1作為MC3T3-E1細胞有氧糖酵解過程的關鍵限速酶，對促進MC3T3-E1細胞的糖酵解代謝過程具有重要影響；PA和LA作為有氧糖酵解的重要產物，可揭示細胞有氧糖酵解的反應程度；在PDK1作用驅動下產生的ATP可使RUNX2、ALP等成骨分化因子增加[17-19]。本研究結果顯示，與空白血清組比較，含藥血清組能有效增強MC3T3-E1細胞礦化能力，促進成骨細胞分化標志物ALP分泌增加、骨形成標志物RUNX2表達上調；有氧糖酵解反應酶PDK1表達上調，PA、LA含量增加，表明BGSSD含藥血清可有效促進MC3T3-E1細胞成骨分化，并且加強有氧糖酵解過程，為MC3T3-E1細胞成骨分化提供充足的糖酵解反應底物和ATP。

HIF-1α 在成骨細胞有氧糖酵解調控中起關鍵作用，作為驅動因子與相關基因啟動子結合，激活糖代謝重編程，促使LA積累，引發有氧糖酵解。此外，有氧糖酵解的通量加速可激活 HIF-1α 通路，減少PA進入線粒體氧化。HIF- 1α 還可誘導PDK1下調線粒體的功能，進一步促進有氧糖酵解[20]。小鼠體內過表達 HIF-1α 可促進骨形成，敲除有氧糖酵解關鍵酶PDK1后，可逆轉HIF- ?1α 導致的骨量增加[2]。此外，骨形態發生蛋白9可誘導 HIF-1α 上調PDK1，加速有氧糖酵解，而HIF- 1α 抑制劑可明顯抑制PDK1的表達22。這表明 HIF-1α 在成骨細胞內可通過有氧糖酵解對骨量的增加起促進作用。本研究結果顯示，含藥血清組可促進 HIF-lα 基因和蛋白的表達，加強MC3T3-E1細胞成骨分化以及有氧糖酵解反應;SiRNA HIF-1α 組未能激活 HIF-1α 信號通路，HIF-1α 水平下降，成骨分化因子ALP水平和RUNX2表達下降，有氧糖酵解關鍵酶PDK1表達以及相應的底物PA、LA的含量均下降；有氧糖酵解抑制劑組則抑制 HIF-1α 下游靶蛋白調控的成骨分化功能以及有氧糖酵解反應水平，不影響 HIF-1α 的相關表達。

這說明有氧糖酵解在BGSSD促進成骨細胞分化過程中具有重要作用，而 HIF-1α 在此過程中扮演關鍵角色，一定程度上闡釋了BGSSD在促成骨分化過程中的調控機制。因此， HIF-1α 可能是中藥復方BGSSD含藥血清介導成骨細胞分化的潛在分子，可通過有氧糖酵解消耗更多的葡萄糖，維持細胞正常生理活動。

綜上所述，BGSSD含藥血清能有效促進骨形成，其機制可能與 HIF-1α 介導的有氧糖酵解有關。后續課題組將對 HIF-1α 介導的有氧糖酵解通路相關分子以及BGSSD促進有氧糖酵解的具體機制展開深入研究，以期為臨床治療OP提供思路。

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（本文編輯 周 旦）