利格列汀片的制備及體內外評價

本文引用：龍世玉，劉，秀，秦杰峰，王玲蘭，任超，劉文龍。利格列汀片的制備及體內外評價[JI.湖南中醫藥大學學報，2025，45（5）：856-861.

[關鍵詞]利格列汀片；溶出曲線；原研制劑；生物等效；高效液相色譜法 [中圖分類號]R927 [文獻標志碼]A [文章編號]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.05.010

[Abstract]Objective To developa generic linagliptintablet with consistentin vitro dissolutionandinvivo bioequivalence tothereferencepreparationMethodsLinagliptintabletswereprepared.Ahighperformanceliquidchromatography（HPLC）-based invitrodisslution testingmethodwasestablishedtodeterminethecumulativedisolutionofboththetestandthereference preparationsinfourmedia：pH1Ohydrochloricacidsolution，pH4.5sodiumacetatebufer，pH6.8potassiumdihydrogen phosphatebuffr，andwater.Thedissolutionsimilaritybetweenthepreparationswasassessedusingthemodel-independent approach （ I₂ similarity factor）.Concurrentlyasingle-dose，two-preparation，two-sequence，two-periodcrossverpharmacokinetic studywasconductedinhealthyadultsubjects，withbloodconcentrationsoflinagliptinmeasuredunderfastingandhighfatpostmeal conditions.Pharmacokineticparameters werecalculatedResultsThecumulativedisolutionprofilesofthetestandreference preparationsweresimilarinallfourdissolutionmediaPharmacokineticanalysisrevealedthatunderbothfastingandfed conditions，the geometric mean ratios （GMRs） and 90% confidence intervals （CIs） for C_max and AUC ¹⁰⁺ of the test preparation relative to the reference preparation fell entirely within the acceptance range of 80.00% 1 .125.00% .Conclusion The test preparation of linagliptin tablets exhibited similar in vitro dissolutionand pharmacokinetic bioequivalence to thereference preparation.

[Keywords]nagliptintablets;diolutonprofileferencepreparatio;boeqilene;hghpformanceliquidhomtoga

利格列汀作為二肽基肽酶-4（dipeptidyl pepti-dase-4，DPP-4）抑制劑，最初由勃林格殷格翰公司開發，并于2011年首次在美國批準上市，適應證為2型糖尿病。腸促胰素是人體小腸和結腸的細胞分泌的一種短肽，主要包括高血糖素樣肽-1（glucagon-likepeptide-1，GLP-1）以及葡萄糖依賴性促胰島素多肽（glucose-dependent insulinotropic polypeptide，GIP）[2，通過促使胰島β細胞合成和分泌胰島素調節血糖。然而，DPP-4作為一種絲氨酸蛋白酶，在人體內廣泛分布，尤其是在腸道中，它能夠滅活多種生物活性肽，包括GIP和GLP-1，使其快速降解，導致半衰期顯著縮短[4]。利格列汀通過抑制DPP-4活性，使腸促胰島素激素濃度增加，并依賴血糖水平來調控胰島素釋放，達到降低胰高血糖素水平的目的5。此外，利格列汀是首個主要通過非腎臟消除的DPP-4抑制劑，在臨床上，即使輕度、中度和重度肝功能不全的情況下，也無須調整劑量6-，這一特性使其特別適用于治療有肝腎功能障礙的2型糖尿病患者。開發與原研生物等效的利格列汀片仿制藥，對臨床需求、社會經濟具有積極作用。

口服固體制劑在人體的消化道內溶出釋放藥物后，才能被吸收進入血液循環系統，發揮藥效。因此，藥物在人體消化道不同生理條件下的溶出速度及溶出程度，是影響藥物生物利用度的關鍵指標。通過檢測制劑在不同pH介質中的體外溶出行為，可以預測體內藥代動力學，從而降低研發風險和成本[8-91，是評價制劑質量十分有效的手段。本研究選擇持證商為勃林格殷格翰國際公司（BoehringerIngelheimInternational GmbH），商品名歐唐寧@，規格為 5mg 的利格列汀片作為參比制劑，通過體外溶出試驗和健康受試者體內藥代動力學研究，綜合評價自制利格列汀片與原研制劑的生物等效性。

1儀器與材料

1.1 儀器

HLSG-300P型高效混合制粒機（浙江明天機械有限公司）：FL-120型沸騰制粒機（常州一步干燥設備廠）；ZL450型門式整粒機（浙江迦南科技股份有限公司）；HD300型三維混合機（江西宜康機械科技有限公司）；GZP40型高速旋轉式壓片機（北京新龍立科技有限公司）；BGB-150D型高效包衣機（溫州市小倫制藥設備廠）：DPH-280CS型全伺服高速泡罩包裝機（浙江明天機械有限公司）；FAVD-25真空脫氣儀、FADT-1200RC智能溶出儀（上海富科思分析儀器有限公司）;Hanson ResearchVersion Elite8藥物溶出儀（美國 Teledyne Hanson Research 公司）;1260 Agilent 高效液相色譜儀 6460 Triple QuadrupoleLC/MS高效液相色譜-串聯質譜[安捷倫科技（中國）有限公司];WatersAcQuityArc高效液相色譜儀（沃特世公司）;Centrifuge 5810R離心機[艾本德（上海）國際貿易有限公司]；MS105DU電子天平、ME1002/02電子天平、S220多參數測試儀梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2試藥

利格列汀對照品（質量分數： 98.9% ，浙江華海藥業）；利格列汀片原研制劑（商品名：歐唐寧？，規格：5mg ，批號：AB9082A，生產商勃林格殷格翰國際公司）；利格列汀片（規格： 5mg ，批號：LLTO1、LLT02、LLT03，生產商湖南千金協力藥業有限公司）。

色譜純試劑為磷酸（天津市科密歐化學試劑有限公司）乙晴[斯百全化學（上海）有限公司]；分析純試劑為鹽酸、磷酸二氫鉀、冰醋酸、無水乙酸鈉和磷酸氫二銨（均為國藥集團化學試劑有限公司）氫氧化鈉（西隴科學股份有限公司）；水為脫氣純化水（自制）。

2方法與結果

2.1 自制制劑制備

（1）預處理：將甘露醇100SD過60目篩。（2）預混合：依次將甘露醇、預膠化淀粉、利格列汀、玉米淀粉加入高效混合制粒機內，設置槳葉轉速 飛刀低速，混合 360s （3）制粒：將共聚維酮水溶液加入，保持槳葉轉速和飛刀轉速不變繼續攪切180s后，出料；用整粒機安裝 5mm×5mm 方孔篩網對軟材進行濕制粒。（4）干燥：將濕顆粒加入沸騰制粒機，控制進風溫度（ 60±10 ） C ，干燥至顆粒水分 ?4.0% 。（5）混合：依次將干顆粒、硬脂酸鎂加入到三維混合機內，設置轉速 10Δr/min ，混合360s。（6壓片：采用高速旋轉式壓片機 8.0mm 圓形沖模，控制40＼～80N硬度范圍壓片。（7）包衣：將素片加入包衣機，用12% 固含量薄膜包衣預混劑（胃溶型）溶液進行包衣，控制薄膜衣增重 2%～4% 。（8）鋁包：采用泡罩包裝機進行包裝，14片/板，得利格列汀片自制制劑（批號LLT01）。

2.2 溶出曲線測定

2.2.1 溶出方法參照《中華人民共和國藥典》（2020年版，以下簡稱《中國藥典》）通則0931溶出度與釋放度測定法第一法溶：采用籃法， 50r/min 轉速， 900mL 介質體積，高效液相色譜法進行溶出檢測，按外標法計算利格列汀的標示溶出量。在試驗 10，15，30，45min 分別取樣，取樣 5mL （不補液），采用 0.45μm×13mm 尼龍材質濾膜，續濾液作為供試品溶液。

對照品溶液：取利格列汀對照品約 22mg ，精密稱定，置 200mL 量瓶中，加溶劑使利格列汀溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液，精密量取 5mL 置 100mL 量瓶中，用 0.1mol/L 鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻。

參照《中國藥典》高效液相色譜法，選擇用辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（ 4.6mm×250mm 5μm ）的色譜柱;流動相為 pH3.0 磷酸鹽緩沖液-乙腈（78：22）;柱溫 流速 1.0mL/min ;檢測波長為 295nm ：進樣體積 50μL

2.2.2自制制劑與原研制劑溶出相似性評價分別取利格列汀片自制制劑（批號：LLTO1），原研制劑（批號：AB9082A）各12片，按照\"2.1.1\"項下方法，分別在pH1.0 鹽酸溶液 Ω?pH 4.5 醋酸鈉鹽緩沖溶液 Ω?pH 6.8 磷酸二氫鉀鹽緩沖溶液、水介質中進行溶出試驗。在規定的溶出條件下，分別于不同時間點取樣，按照“2.2.1\"項下色譜條件測定各時間點的溶出度，繪制溶出曲線，并通過非模型依賴方法（f2相似因子）計算自制制劑與原研制劑的溶出相似性，對累積溶出數據進行分析。依據國家藥品監督管理局發布的溶出度試驗技術指導原則中關于溶出相似性的判定標準：當自制制劑與原研制劑的體外溶出在 15min 內的溶出量 ?85% ，即可判定兩者溶出行為相似[10]。結果顯示，自制制劑和原研制劑在四種溶出介質中，15min 內的平均溶出度均大于 85% ，屬于非常快速溶出。根據指導原則，可判定自制制劑與原研制劑的溶出行為相似。不同 pH 介質中自制制劑與原研制劑溶出曲線對比，見圖1。

2.3 生物等效性試驗

本研究在河南（鄭州）中匯心血管病醫院開展健康成年受試者中生物等效性試驗，經本臨床中心醫學倫理委員會批準（臨床倫理批準號：CTR20242890），并在試驗前與所有受試者簽署書面知情同意書，研究過程對其數據進行匿名化處理。此次試驗采取單中心、隨機、開放、單劑量、兩制劑、兩序列、兩周期交叉試驗設計]，對比自制制劑（批號：LLTO1）與原研制劑（批號：AB9082A）在空腹及高脂餐后兩種狀態下的藥代動力學差異。

2.3.1納入標準（1）受試者充分了解試驗目的、性質、方法以及可能發生的不良反應，自愿作為受試

2.3.2排除標準 （1）對利格列汀片或任意藥物成分有過敏史者；（2）有胰腺炎、低血糖、暈厥、代謝性酸中毒病史者；（3）有臨床表現異常需排除的疾病，包括但不限于神經系統、心血管系統、血液和淋巴系統、免疫系統、腎臟、肝臟、胃腸道、呼吸系統、代謝及骨骼等系統疾病者；（4）篩選前3個月內獻過血或失血 ≥200mL ，或打算在試驗期間或試驗結束后3個月內獻血（包括血液成分）者；（5）妊娠期、哺乳期或育齡期婦女篩選時妊娠檢查結果為陽性者；（6）服藥前1個月內接種過疫苗者；（7）存在藥物濫用史、吸毒史或煙酒嗜好者。

2.3.3給藥與血樣采集根據試驗方案設計共入組健康受試者84例，按空腹組和餐后組分別入組46、38例，并按1：1隨機分為兩個給藥序列（T-R組和R-T組）之一。利格列汀終末半衰期較長 ，確保在第二周期給藥前血藥濃度小于 C_max 的 5% ，洗脫期設為 42d 入組受試者于每周期給藥前1天進入I期臨床研究病房，禁食 ^10h 以上。第2天早晨按照給藥方案在空腹或進食高脂餐后口服受試制劑1片或參比制劑1片，約 240mL 溫開水送服。高脂餐要在進餐開始后 30min 內吃完，試驗藥物要在進餐后且以開始進餐時間計的（ 30.0±0.5 ） min 內服用。每周期在給藥前 0h 和給藥后0.25、0.50、1.00、1.33、1.67，2.00，2.33，2.67，3.00，3.50，4.00，4.50，5.00，6.00， 8.00，12.00，24.00，48.00，72.00h ，共20個點，采集上肢靜脈全血，每次取血約 4mL 至含EDTA-K2抗凝劑的真空采血管中，并于 ^2h 內存放于 -70^°C（-60～ -90^°C ）冰箱中，以供藥代動力學分析。

2.3.4血漿樣品處理采用蛋白沉淀法，在96孔板的孔中加入 50μL 樣品和 50μL 內標工作溶液，加入 400μL 的 100% 甲醇，于室溫下振搖混勻 10min 于 條件下離心 10min （離心半徑9.5cm_. 。轉移 100μL 上清液，并加入 100μL 含5mmol/L乙酸銨的 0.1% 甲酸水溶液，振搖混勻 于 4%，3000r/mim ，半徑 95cm ，離心 5min ，待進樣分析。

2.3.5 液相及質譜條件（1）色譜。色譜柱：XBRIDGEBEH ；流動相：含5mmol/L 乙酸銨的 0.1% 甲酸水溶液-乙腈；柱溫：40‰ ;進樣量： 10.0μL ;流速： 0.40mL/min ;流動相洗脫程序： 0.00～1.00min，30%B;1.00～2.10min 30%95%B ： 2.10～3.00min 95%B， 0

（2）質譜。離子化模式：電噴霧離子源（ESI）；離子源溫度： 550‰ ;離子源噴射電壓 ：5 000V ;正離子模式，多重反應監測（MRM）。用于檢測的分析物利格列汀和內標離子對利格列汀-d4分別為 m/z= 473.3/420.3與 m/z=477.3/424.3 0

2.3.6方法學考察 （1）專屬性。取6個不同供體的空白樣品，按“血漿樣品處理\"方法處理，進樣。結果表明，利格列汀的保留時間為 1.33min ，利格列汀-d4的保留時間為 1.33min ，空白樣本中的內源性物質未干擾檢測結果。

（2）標準曲線及檢測限。采用空白血漿新鮮制備8個濃度水平的標準曲線樣本：0.10、0.20、0.80、2.00，4.00，8.00，12.00，15.00ng?mL^-1 進行進樣。標準曲線回歸方程為 表明在 0.10～15.00ng?mL^-1 范圍內線性關系良好。

（3）精密度和回收率。配制5個濃度的待測樣品：LLOQ（ ） ，GMQC ）、MQC（ ）、HQC（ ），各濃度平行配制6份，并連續進行3個分析批的測定，考察批內及批間精密度。同時對LOC、MQC、HQC3個濃度水平考察提取回收率。結果表明，各濃度水平質控樣本的批內及批間精密度均不超過 15% ，3個濃度水平的提取回收率均大于70% ，利格列汀在血漿中的精密度和回收率符合要求。詳見表1。

（4）基質效應。考察待測樣品在普通基質、高脂基質及溶血基質中的基質效應，結果表明，各基質配制的 LQC（n=3），HQC（n=3） 的測定濃度變異系數（ % CV）均不超過 15.0% ，測定濃度平均值與其理論濃度的偏差 （% 偏差）均在 ±15.0% 以內，符合要求。

（5）穩定性。分別將待測物低濃度（LQC）和高濃度（HQC）血漿樣品在室溫黃光下放置 ³h ；在 -20^°C 和-80℃至室溫凍融循環，至少重復5次； 8‰ 條件下放置 86h;-20.-80 C 條件下放置 76d ，考察樣品穩定性，結果表明穩定性均符合要求。

2.3.7生物等效性結果 采用PhoenixWinNonlin

8.3、SAS9.4軟件對數據進行處理、分析，空腹與餐后藥代動力學參數統計結果，見表2。根據以藥代動力學為終點生物等效性判斷標準，若 90%CI 在 80.00%～ 125.00% 等效區間內，則判定兩種制劑在人體內生物等效[I5]。結果表明：空腹、餐后試驗藥代動力學參數 C_max，AUC₀₊₁ 的受試制劑與參比制劑的幾何均值比值及其 90% 置信區間均在 80.00%～125.00% 范圍內，證明自制制劑（T）與參比制劑（R）在空腹及餐后均生物等效。空腹及餐后生物等效性判斷結果見表3—4，平均血藥濃度-時間曲線，見圖2。

3討論

本研究經過處方工藝篩選，制備了符合質量標準，能夠產業化生產的利格列汀片。通過高效液相色譜法對利格列汀片的體外溶出進行系統評價，并進一步開展了健康受試者的生物等效性研究。研究結果顯示，所建立的溶出檢測方法能夠有效應用于利格列汀片的溶出度測定，并判斷自制制劑與參比制劑體外溶出的差異。在不同 ΔpH 溶出介質中，自研制劑與原研制劑的溶出曲線相似性良好， 15min 溶出度均大于 85% ，表明兩者在體外溶出行為上具有高度一致性。此外，藥代動力學研究作為生物等效性評價的\"金標準\"，通過檢測受試者體內的血藥濃度，獲得藥代動力學參數（通常為 C_max 和AUC）作為終點指標，以此反映藥物的釋放及吸收進行循環系統的速度和程度7]。在健康受試者的生物等效性研究進一步證實了自研制劑與原研制劑在體內的吸收

速率和程度無顯著差異，具有良好的生物等效性。這些結果不僅為利格列汀片的質量控制提供了科學依據，也為仿制藥的臨床應用提供了有力支持，確保了其在治療效果和安全性上與原研藥相當。

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（本文編輯蘇維）