基于PINK1/Parkin通路探討溫陽解毒化瘀方含藥血漿對肝細(xì)胞損傷的影響

[摘要]目的 基于PTEN誘導(dǎo)激酶1（PINK1）/E3泛素連接酶（Parkin）通路探討溫陽解毒化瘀方含藥血漿對肝細(xì)胞損傷的影響。方法采用D-氨基半乳糖 （D-GalN）+ 脂多糖（LPS）構(gòu)建肝細(xì)胞損傷模型，實驗設(shè)置對照組、模型組、空白血漿組、中藥血漿組、3-MA組、中藥 +3-MA 組。CCK-8法篩選含藥血漿最佳干預(yù)濃度及時間;AnnexinV-APC/PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡情況;JC-1染色檢測線粒體膜電位；MitoSOXRed染色檢測活性氧（ROS）水平;生物化學(xué)法檢測超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平;透射電鏡觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu);RT-qPCR法檢測PINK1、Parkin、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）、螯合體 1（SQSTM1/P62）mRNA 水平;Westernblot法檢測PINK1、Parkin、LC3、P62、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（ （Bax） 、裂解的胱天蛋白酶-3（cleaved-Cas-pase-3）和胱天蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白表達(dá)水平。結(jié)果CCK-8結(jié)果顯示， 15% 含藥血漿干預(yù) ^12h 為實驗的最佳干預(yù)濃度及時間。與對照組相比，模型組細(xì)胞各期凋亡率升高（ （Plt;0.01） ；線粒體膜電位下降（ Plt;0.01 ；細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA水平上升（ Plt;0.01 ）;SOD水平下降 Plt;0.01 ；線粒體結(jié)構(gòu)明顯紊亂、自噬溶酶體數(shù)量較少；PINK1、Parkin、LC3mRNA表達(dá)下降（ Plt;0.01 ），P62mRNA表達(dá)上升0 Plt;0.01 ）；PINK1、Parkin、Bcl-2蛋白及 LC3I/I 比值下降（ Plt;0.01 ），P62、Bax蛋白表達(dá)及cleaved-Caspase-3/Caspase-3比值上升0 ）。與模型組比較，中藥血漿組細(xì)胞各期凋亡程度減輕 （Plt;0.01） ；線粒體膜電位升高 （Plt;0.01） ；細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA水平下降（ Plt; 0.01）;SOD水平上升 （Plt;0.01） ）;與模型組比較，中藥血漿組線粒體結(jié)構(gòu)紊亂程度減輕、自噬溶酶體增加；PINK1、Parkin、LC3mRNA表達(dá)升高 ），P62mRNA表達(dá)下降（ ；PINK1、Parkin、Bcl-2蛋白及 LC3I/I 比值升高 （Plt;0.01，Plt;0.05），P62，Bax 蛋白表達(dá)及cleaved-Caspase-3/Caspase-3比值下降 （Plt;0.01，Plt;0.05 。與中藥血漿組比較，中藥 +3-MA 組細(xì)胞凋亡率均明顯上升（ Plt; 0.01）；線粒體膜電位下降（ Plt;0.01 ；ROS、MDA水平顯著升高 Plt;0.01 ，SOD水平顯著下降 （Plt;0.01） ；電鏡顯示線粒體結(jié)構(gòu)紊亂加重，自噬溶酶體數(shù)量減少;PINK1、Parkin、LC3mRNA表達(dá)下降（ ），P62mRNA表達(dá)升高（ ）;PINK1、Parkin、Bcl-2蛋白及LC3II/I比值下降（ Plt;0.01 ），P62、Bax蛋白表達(dá)及cleaved-Caspase-3/Caspase-3比值升高 （Plt;0.01，Plt;0.05） 。結(jié)論溫陽解毒化方含藥血漿可減輕ROS蓄積和氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制線粒體內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡在D-GaIN/LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其促進(jìn)PINK1/Parkin通路介導(dǎo)的線粒體自噬、改善線粒體功能有關(guān)。

本文引用：.基于PINK1/Parkin通路探討溫陽解毒化瘀方含藥血漿對肝細(xì)胞損傷的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2025，45（5）：845-855.

[關(guān)鍵詞]慢加急性肝衰竭；肝損傷；溫陽解毒化瘀方；PINK1/Parkin通路；線粒體自噬 [中圖分類號]R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.05.009

[Abstract]Objective To investigate the efectsof plasma containing Wenyang Jiedu Huayu Formula （WYJDHYF）on hepatocyteinjurybasedonthePTEN-inducedkinase1（PINK1）E3ubiquitinligase（Parkin）pathway.MethodsAhepatocelular injury model was established using D-galactosamine （D-GalN） combined with lipopolysaccharide （LPS） .Experimental groups included control group，model group， blank plasma group， WYJDHYF plasma group， 3-MA group，and WYJDHYF ⁺³ -MA group. The optimal concentrationand interventiondurationof plasma wasdeterminedvia CCK-8assy.CellapoptosiswasasssedusingAnnexinVAPCPIdoublestaining.Mitochondrialmembranepotential was measured byJC-1staining，andreactiveoxygenspecies （ROS）levels werechecked using MitoSOX Red staining.Biochemical methods wereemployed to evaluatesuperoxide dismutase （SOD）and malondialdehyde （MDA）levels.Hepatocyteultrastructure wasobserved bytransmision electron microscopy （TEM）.RT-qPCR was usedtoquantifyRAlevelsofK1，Parkin，crotubuleasoiatedproten1ligthain3（C3）ndquestose/ P62）.TheprotinexprsionvelsofK1，arkin，C3，p6SQ-cellpo-2（cl-），c-ssciatedoe （Bax），cleaved-Caspase-3，andCaspase-3wereanalyzedbyWesterblotResultsTeCCK-8assayindicatedthatinterventiowith （2號 15% drug-containingplasma for12hourswastheoptimalconcentrationanddurationfortheexperimentComparedwiththecontrol group，the model group showed increased apoptosis rate of cells at all stages （ P： -3/ （20 Caspase-3 ratio decreased （ Plt;0.01 or Plt;0.05 ）. Compared to the WYJDHYF plasma group，the WYJDHYF+3-MA group exhibited markedly increased apoptosis rate （P

[KeyWords]acute-on-chronic liver failure; liver injury; Wenyang Jiedu Huayu Formula; PINKl/Parkin pathway; mitophagy

慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver fail-ure，ACLF）是在多種慢性肝病基礎(chǔ)上出現(xiàn)的肝功能急性失代償，臨床出現(xiàn)黃疸急性加深、凝血功能異常等表現(xiàn)的一種危及生命的綜合征。在我國，病毒性肝炎尤其是乙型肝炎病毒引起的ACLF最為常見[2]。ACLF短期病死率高，肝移植是目前ACLF治療最有效的方法，但由于供體短缺、移植手術(shù)費(fèi)用高昂、移植后排異反應(yīng)等問題，部分患者無法獲得有效治療4。因此，迫切需要更合理有效的治療方法降低ACLF病死率，解決目前治療的困境。

線粒體是細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)器，參與活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）生成與代謝、細(xì)胞死亡、氧化還原反應(yīng)、離子穩(wěn)態(tài)等多項生物代謝活動。研究顯示，ACLF患者在全身性炎癥狀態(tài)下，代謝產(chǎn)物和代謝途徑的改變引起線粒體功能障礙，導(dǎo)致器官衰竭的發(fā)生。線粒體功能障礙可導(dǎo)致線粒體自噬失調(diào)、ROS生成與代謝紊亂、線粒體內(nèi)源性凋亡途徑的激活，從多方面影響ACLF疾病進(jìn)展。

結(jié)合ACLF的臨床表現(xiàn)，中醫(yī)學(xué)多將其歸屬于“急黃\"“瘟黃”“肝瘟\"等范疇，傳統(tǒng)治療多從陰黃、陽黃辨治。近年來，團(tuán)隊通過對肝衰竭患者長期觀察發(fā)現(xiàn)，ACLF患者臨證之時，部分患者臨床證型介于陰黃、陽黃之間，由此提出“陰陽黃\"的病證名，創(chuàng)新性提出“陽黃-陰陽黃-陰黃\"的辨證論治新模式，并以溫陽健脾、解毒化為治法創(chuàng)制溫陽解毒化瘀方，臨床療效顯著[7-9]。機(jī)制研究顯示，溫陽解毒化瘀方可降低肝衰竭炎癥因子表達(dá)，抑制肝細(xì)胞凋亡，改善肝衰竭[]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究顯示，ROS代謝可能是溫陽解毒化癡方作用于ACLF的潛在靶點，但具體調(diào)控機(jī)制尚未明確。ROS代謝與線粒體自噬及線粒體內(nèi)源性凋亡途徑密切相關(guān)，基于此，本研究以線粒體功能障礙為切入點，通過使用D-氨基半乳糖（d-galactosamine， D-GalN）+ 脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）建立肝細(xì)胞損傷模型，深入探討溫陽解毒化方改善肝衰竭細(xì)胞損傷的具體作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1 動物與細(xì)胞系

健康 SPF雄性大鼠12只，體質(zhì)量（ 250±20 ）g，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司購入，動物質(zhì)量合格證：430727241102593956，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實驗中心。本實驗通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查，倫理審查編號：202404030。大鼠正常肝實質(zhì)細(xì)胞BRL-3A（Abiowell公司，批號：AW-CNR428）。

1.2 藥物與試劑

白術(shù)、丹參、黑順片、赤芍、薏苡仁、茵陳（批號：240602、XZ24072904、2409230162、NG24092701、CK24090301SX24101401），購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部鄧桂明研究員鑒定均為正品

CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所，批號：NU679）;PTEN誘導(dǎo)激酶1（PTEN induced putativekinase1，PINK1）E3泛素連接酶（ParkinRBRE3ubiquitin-proteinligase，Parkin）微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein1 light chain 3， LC3）、螯合體1（sequestosome 1，SQSTM1/P62）胱天蛋白酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Cas-pase-3）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X，Bax）抗體（中國Abiowell公司，批號：AWA54820、AWA41194、AWA10125、AWA0000、AWA45562、AW-A5806、AWA43352）；超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）丙二醛（malondialdehyde，MDA）乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanineaminotransferase，ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartatetransaminase，AST）試劑盒（中國南京建成生物工程研究所，批號：A001-3-2，AO03-1-1.AO20-2-2.CO09-2-1.CO10-2-1） LPS、D-GalN（美國Sigma公司，批號：L2630、G1639-100MG）;MitoSOXRed染色液、JC-1試劑（中國碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：S0061M、C2006）；3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3-MA）（美國MedChem-Express公司，批號：A8353）；戊二醛、酸（中國Abiowell 公司，批號：AWI007、AWI0136）;Epon-812、DDSA、NMP、檸檬酸鉛、無碳芳華膜銅網(wǎng)（中國中鏡科儀技術(shù)有限公司，批號：GS02659GS02827、GS02828、GA10701-1、BZ11262a）。

1.3 主要儀器

超凈工作臺（北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司，型號：YT-CJ-2NB）：流式儀（美國Beckman公司，型號：A00-1-1102）；多功能酶標(biāo)分析儀（深圳匯松科技發(fā)展有限公司，型號：MB-530）；倒置生物顯微鏡（北京中顯恒業(yè)儀器儀表有限公司，型號：DSZ2000X）；低速離心機(jī)（上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司，型號：SL02）;熒光定量PCR儀（美國AppliedBiosystems公司，型號：QuantStudiol）;熒光PCR板（美國Thermo公司，型號：SPL0960）；電泳儀、水平瓊脂糖電泳槽（北京六一生物科技有限公司，型號：DYY-2CDYCP-31DN）；透射電子顯微鏡（日本電子株式會社，型號：JEM-1400FLASH）；超薄切片機(jī)、組織脫水機(jī)（德國徠卡LEICA公司，型號：leicaUC-7、EMTP）;搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號：TS-92）。

2方法

2.1 含藥血漿制備

稱取白術(shù) 30g 黑順片 10g 、茵陳 30g 、丹參30g 赤芍 60g 薏苡仁 30g ，先將黑順片置于燒杯中，加人10倍純凈水浸泡 0.5h 后，先煎 ^1h，1h 后加入10倍水浸泡 0.5h 的其他藥物再煎 ¹h 后倒出藥液，第二次加入8倍水煎煮 ¹h ，將兩次藥液混合，雙層紗布過濾后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將藥液濃縮至 178mL （藥液生藥質(zhì)量濃度 3.2g?mL^-1 ，滅菌后放置于 4‰ 冰箱保存。將12只SD大鼠隨機(jī)分為空白血漿組和中藥血漿組，每組6只。中藥血漿組大鼠灌胃溫陽解毒化瘀方水煎劑7d，給藥量計算方法參照《藥理實驗方法學(xué)》，按人臨床等效劑量的3倍換算出大鼠每天劑量為 51.3g?kg^-1 ，空白血漿組大鼠每天灌胃等劑量生理鹽水，每天灌胄2次。末次給藥 2h 后，腹腔注射 3% 戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，離心，水浴鍋加熱滅活（ ），0.22μm 濾網(wǎng)過濾，分裝后 -80^°C 儲存。

2.2含藥血漿最佳濃度篩選

取對數(shù)期生長的BRL-3A細(xì)胞，以每孔 5×10³ 個細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔 100μL ，每組設(shè)置6個復(fù)孔。將細(xì)胞分組為空白組、對照組、模型組，5%.10%.15%.20%.25% 中藥血漿組及對應(yīng)濃度的空白血漿組，空白組不含細(xì)胞、只含CCK-8與培養(yǎng)基，對照組BRL-3A細(xì)胞正常培養(yǎng)，模型組細(xì)胞加人 1μg?mL^-1 LPS和 5mg?mL^-1 D-GalN培養(yǎng) 中藥血漿組及空白血漿組在模型組干預(yù)基礎(chǔ)上分別予以相應(yīng)濃度的血漿干預(yù)。分別作用于BRL-3A細(xì)胞 12，24，48h 后，每孔中加入 10μL 的CCK-8，完培配制CCK-8溶液，去除含藥培養(yǎng)基每孔加入 100μL 含CCK-8的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱孵育 ⁴h 后，使用酶標(biāo)儀在 450nm 波長處測定各孔的吸光度（OD）值，計算各組細(xì)胞增殖抑制率。增殖抑制率 （%）=（1- 實驗組OD值/對照組OD值） ×100% 。

2.3 細(xì)胞分組與給藥

取對數(shù)生長的BRL-3A細(xì)胞進(jìn)行分組，分為對照組、模型組、中藥血漿組、空白血漿組、3-MA組及中藥 +3-MA 組，對照組BRL-3A細(xì)胞正常培養(yǎng)，模型組細(xì)胞加入 1μg?mL^-1 LPS 和 GalN培養(yǎng) 24h ，中藥血漿組及空白血漿組在模型組基礎(chǔ)上根據(jù)篩選的最佳干預(yù)濃度及時間分別進(jìn)行含藥血漿及空白血漿干預(yù)處理，3-MA組先予以 3-MA預(yù)處理 2h^[13-14] 后加入 1μg?mL^-1 LPS和 5mg?mL^-1 D-GalN培養(yǎng) 24h ，中藥 +3 -MA組在3-MA組基礎(chǔ)上加用中藥血漿處理。

2.4 模型驗證

取對照組和模型組細(xì)胞進(jìn)行處理給藥后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液至離心管中， 離心10min （離心半徑為 10cm ），去除細(xì)胞碎片，取上清液，按照試劑盒操作步驟檢測細(xì)胞ALT、AST及LDH水平[5]。

2.5 AnnexinV-APC/PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期的BRL-3A細(xì)胞按照“2.3\"項分組處理給藥后，用不含EDTA的胰酶消化各組細(xì)胞，PBS洗滌2次， 1000r/min 離心 5min （離心半徑為10cm^? ，收集約 4.7×10⁵ 細(xì)胞，PBS洗滌后依次加入

500μL Bindingbuffer懸浮細(xì)胞 、5μL AnnexinV-APC及 5μL Propidiumlodide，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，實驗重復(fù)3次。

2.6JC-1染色檢測線粒體膜電位

取對數(shù)生長期的BRL-3A細(xì)胞按照“2.3\"項分組處理給藥后，重懸于 0.5mL 細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入1mL JC-1染色工作液，顛倒數(shù)次充分混勻，細(xì)胞培養(yǎng)箱中 37°C 孵育 20min 。按照每 1mLJC-1 染色緩沖液加入 4mL 蒸餾水的比例配制JC-1緩沖液，待孵育結(jié)束后，吸除上清，加入JC-1染色緩沖液洗滌2次，流式細(xì)胞儀檢測。

2.7 MitoSOXRed染色檢測ROS水平

取對數(shù)生長期的BRL-3A細(xì)胞按照“2.3\"項分組處理給藥后， 離心 5min （離心半徑為 10cm ），棄去上清液，PBS洗滌兩次，加入 1mL MitoSOXRed染色工作液懸浮細(xì)胞，使細(xì)胞密度在3×10⁶/mL ，細(xì)胞培養(yǎng)箱中 37°C 孵育 30min ，孵育結(jié)束后， 離心 5min （離心半徑為 10cm ），沉淀細(xì)胞，棄上清液，PBS洗滌兩次后棄上清液，再使用PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測ROS水平。

2.8生物化學(xué)法檢測MDA、SOD水平

取對數(shù)生長期的BRL-3A細(xì)胞按照“2.3\"項分組處理給藥后，收集各組培養(yǎng)上清液及細(xì)胞，按照試劑盒說明書檢測培養(yǎng)上清中MDA水平及上清中SOD 水平。

2.9透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)

PBS洗滌各組細(xì)胞并用胰蛋白酶消化、離心處理，加入戊二醛進(jìn)行固定， 1% 四氧化餓再固定。不同濃度的丙酮溶液進(jìn)行脫水，脫水劑濃度梯度為30%50%70%80%90%95%100% 。脫水劑和Epon-812包埋劑按照3：1、1：1、1：3比例依次滲透，Epon-812純包埋劑包埋。超薄切片機(jī)作 60～ 90nm 超薄切片，加用醋酸鈉染色液對各組細(xì)胞樣品進(jìn)行染色處理 10～15min ，清洗后加人檸檬酸鉛的染色液染色 1～2min 。采用透射電子顯微鏡進(jìn)行圖像采集，先于低倍鏡下觀察整體，后調(diào)整至觀察區(qū)域觀察具體病變。

2.10RT-qPCR檢測相關(guān)基因表達(dá)

Trizol法提取細(xì)胞總RNA，測RNA濃度及OD260/0D280，符合要求后將獲得的RNA置于 -80^°C 儲存。以總mRNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，置于-20 C 儲存。上機(jī)擴(kuò)增， qPCR 反應(yīng)條件：變性（ ，變性 （95°C，15s） ，退火 60^°C ，30s） 進(jìn)行40次循環(huán)，溶解曲線 60～95°C 。以 β- actin為內(nèi)參，采用 2^-ΔΔG 法比較分析各基因表達(dá)。使用Primer5軟件設(shè)計引物，所有引物均由北京擎科生物科技股份有限公司合成引物。詳見表1。

2.11Western blot 檢測 PINK1，Parkin、LC3、P62、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平

取對數(shù)生長的BRL-3A細(xì)胞按照“2.3\"項分組處理給藥后，PBS洗滌1次，加入 200μL RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，電泳、轉(zhuǎn)膜 5% 脫脂蛋白封閉 90min ，PBST稀釋一抗PINK1、Parkin、LC3、P62、Caspase ^-3 、Bax、Bcl-2（1：1000）和 β-actin（1：5000） ，將PVDF膜與一抗4‰ 孵育過夜，PBST洗滌3次后加入二抗（1：5000），在室溫下孵育 90min ，PBST洗3次，每次 15min ，ECL化學(xué)發(fā)光液與PVDF膜反應(yīng) 1min ，凝膠成像系統(tǒng)成像，保存圖片，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值。

2.12 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS26.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料數(shù)據(jù)以‘ ”表示，多組間比較符合正態(tài)性和方差齊性者，采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較選用LSD檢驗，符合正態(tài)分布但不符合方差齊性采用韋爾奇檢驗，不符合正態(tài)性分布者選用非參數(shù)檢驗。以 Plt;0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1 細(xì)胞模型驗證

與對照組相比，模型組ALT、AST及LDH水平

均明顯升高 （Plt;0.01 ），提示肝細(xì)胞存在明顯損傷。詳見表2。

3.2溫陽解毒化瘀方含藥血槳最佳濃度及干預(yù)時間

與 ^24，48h 干預(yù)時間下中藥血漿組的細(xì)胞增殖抑制率比較， 12h 干預(yù)時間下細(xì)胞增殖抑制率最低（Plt;0.05） ，提示 12h 為最佳干預(yù)時間。進(jìn)一步分析12h 干預(yù)時間下不同濃度含藥血漿的作用效果，結(jié)果顯示細(xì)胞增殖抑制率呈現(xiàn)濃度依賴性變化（ Plt; 0.05），其中 15% 含藥血漿組的抑制率最低。綜上，15% 含藥血漿干預(yù) 12h 可作為后續(xù)實驗的最佳干預(yù)濃度及干預(yù)時間。詳見圖1。

3.3溫陽解毒化癖方抑制線粒體內(nèi)源性凋亡途徑 激活減輕肝細(xì)胞凋亡

3.3.1溫陽解毒化方含藥血漿對肝細(xì)胞凋亡的影響與對照組相比，模型組的早期、晚期及總凋亡率均明顯上升 （Plt;0.01） ；與模型組相比，中藥血漿組早期、晚期及總凋亡率明顯下降（ Plt;0.01 ），3-MA組早期、晚期及總凋亡率明顯升高 （Plt;0.01） ；與中藥血漿組相比，中藥 +3-MA 組早期、晚期及總凋亡率均明顯上升 （Plt;0.01） 。詳見表3、圖2。

3.3.2 溫陽解毒化方含藥血漿對細(xì)胞線粒體膜電

位水平的影響與對照組比較，模型組JC-1單體率明顯上升（ （Plt;0.01） ，提示線粒體膜電位下降；與模型組比較，中藥血漿組JC-1單體率明顯下降 ，提示線粒體膜電位較前恢復(fù)，3-MA組JC-1單體率明顯上升 （Plt;0.01） ，提示線粒體膜電位下降;與中藥血漿組相比，中藥 +3-MA 組JC-1單體率明顯升高（Plt;0.01） 。詳見圖3。

3.3.3溫陽解毒化方含藥血漿對細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響與對照組相比，模型組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下降 Plt;0.01 ），Bax蛋白表達(dá)及cleaved-Caspase-3/Caspase ^-3 比值明顯升高 （Plt;0.01 ）；與模型組相比，中藥血漿組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高

0 Plt;0.01 ），Bax蛋白表達(dá)及cleaved-Caspase-3/Cas-pase-3比值下降 （Plt;0.05，Plt;0.01），3-MA 組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下降（ ），Bax蛋白表達(dá)及cleaved-Caspase-3/Caspase ^-3 比值升高 ?Plt;0.05，Plt; 0.01）;與中藥血漿組相比，中藥 +3-MA 組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下降 ），Bax蛋白表達(dá)及cleaved-Caspase-3/Caspase-3比值升高 （Plt;0.05，Plt;0.01） 。詳見表4、圖4。

3.4溫陽解毒化瘀方含藥血漿減輕ROS過度積累及氧化應(yīng)激

3.4.1溫陽解毒化瘀方含藥血漿對細(xì)胞ROS水平的影響與對照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高（ （Plt;0.01） ；與模型組比較，中藥血漿組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著下降（ （Plt;0.01） ），3-MA組細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高（ Plt;0.01， ；與中藥血漿組相比，中藥 + 3-MA組細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯上升 （Plt;0.01） 。詳見圖5。

3.4.2溫陽解毒化方含藥血漿對細(xì)胞MDA Ω.SOD 水平的影響與對照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)MDA水平顯著升高（ （Plt;0.01） ），SOD水平顯著下降 （Plt;0.01） ：與模型組比較，中藥血漿組細(xì)胞內(nèi)MDA水平顯著下降（ ，SOD水平顯著升高 （Plt;0.01 ），3-MA組細(xì)胞內(nèi)MDA水平明顯升高（ （Plt;0.01） ，SOD水平明顯下降 （Plt;0.01） ；與中藥血漿組相比，中藥 +3-MA 組

3.5溫陽解毒化方含藥血漿對PINK1/Parkin通路介導(dǎo)的線粒體自噬的調(diào)控作用

3.5.1溫陽解毒化方含藥血漿干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)變化對照組肝細(xì)胞線粒體呈圓形或橢圓形，線粒體嵴清晰可見，基質(zhì)均勻，可見部分自噬溶酶體；模型組線粒體大多呈橢圓形，中度腫脹，嵴減少缺失，基質(zhì)變淡，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量多，中度擴(kuò)張，細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)凝集，可見少量自噬溶酶體：空白血漿組線粒體呈橢圓形或長桿狀，中度腫脹，嵴斷裂減少，密度加深，基質(zhì)變淡，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中度擴(kuò)張，可見少量自噬溶酶體；中藥血漿組線粒體呈圓形或橢圓形，輕度腫脹，嵴少量減少缺失，基質(zhì)變淡，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中度擴(kuò)張，細(xì)胞質(zhì)中可見較多自噬溶酶體；3-MA組線粒體呈圓形或橢圓形，中度腫脹，嵴大部分減少缺失，基質(zhì)變淡，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中度擴(kuò)張；中藥 +3-MA 組線粒體呈長桿狀，輕度腫脹，嵴減少缺失，基質(zhì)變淡，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中度擴(kuò)張，可見少量自噬溶酶體。詳見圖7。

3.5.2溫陽解毒化方含藥血漿對線粒體自噬相關(guān)基因表達(dá)水平的影響與對照組相比，模型組PINK1、Parkin、LC3mRNA明顯下降（ Plt;0.01 ），P62mRNA明顯升高 （Plt;0.01） ;與模型組相比，中藥血漿組PINK1、Parkin、LC3 mRNA明顯升高（ Plt;0.01 ），P62mRNA明顯下降 （Plt;0.01） ;與模型組相比，3-MA組PINK1、Parkin、LC3mRNA明顯下降 Plt;0.01 ），P62mRNA明顯上升 （Plt;0.01） ；與中藥血漿組相比，中藥 +3 -MA組PINK1、Parkin、LC3mRNA下降（ ，P62mR-NA明顯升高 （Plt;0.01） 。詳見圖8。

3.5.3溫陽解毒化瘀方含藥血漿對細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響與對照組相比，模型組PINK1、Parkin蛋白表達(dá)水平及LC3II/I比值明顯下降 （Plt;0.01） ，P62明顯升高 （Plt;0.01） ；與模型組相比，中藥血漿組PINK1Parkin蛋白表達(dá)水平及LC3Ⅱ/I比值升高 （Plt;0.05，Plt;0.01） ，P62蛋白表達(dá)下降（ Plt;0.05 ），3-MA組細(xì)胞PINK1、Parkin蛋白表達(dá)水平及LC3ⅡI/I比值下降 （Plt;0.05，Plt;0.01） P62蛋白表達(dá)水平升高 （Plt;0.01） ；與中藥血漿組相比，中藥 +3-MA 組細(xì)胞PINK1、Parkin蛋白表達(dá)水平及LC3Ⅱ/I比值下降（ Plt;0.01 ），P62蛋白表達(dá)水平升高（ （Plt;0.01 ）。詳見表5、圖9。

4討論

ACLF是一種嚴(yán)重的臨床綜合征，具有高短期病死率的特點。中醫(yī)學(xué)多將其歸屬于“急黃\"\"瘟黃\"“肝瘟\"范疇，古代醫(yī)家大多從濕熱、熱毒、血方面辨證論治。本團(tuán)隊在前期觀察研究中發(fā)現(xiàn)，ACLF常發(fā)生于肝硬化等慢性肝病基礎(chǔ)上，多有長期使用苦寒藥物史，苦寒藥物損傷脾胃或病久遷延不愈耗

傷脾胃，故其病機(jī)除了實證外，脾虛證候不容忽視。隨著病程的延長，脾虛逐漸明顯，成為影響預(yù)后的關(guān)鍵因素[17-I8]，由此提出以溫陽健脾、解毒化為治法的溫陽解毒化方。前期研究發(fā)現(xiàn)，溫陽解毒化瘀方可降低ACLF患者病死率、提高黃疸消退率[8，19]，深入探討其改善ACLF的機(jī)制尤為重要線粒體參與人體內(nèi)能量與代謝過程，正常情況下，細(xì)胞從線粒體氧化磷酸化中獲得絕大部分能量，ACLF患者處于炎癥與損傷狀態(tài)時，線粒體功能障礙，線粒體β氧化水平下降、糖酵解增加、ROS產(chǎn)生增加，過量ROS進(jìn)一步加重細(xì)胞凋亡、組織損傷和器官功能障礙[20]。研究顯示，ACLF患者白細(xì)胞和肝衰竭患者肝組織中線粒體的數(shù)量和大小有所變化，并且表現(xiàn)出現(xiàn)線粒體結(jié)構(gòu)紊亂和功能異常[21-22]，提示改善線粒體結(jié)構(gòu)與功能是潛在治療靶點。

自噬作為清除受損細(xì)胞器的重要機(jī)制，在A-CLF中顯著受抑制，表現(xiàn)為自噬相關(guān)分子表達(dá)降低及自噬底物P62異常堆積[23]。線粒體自噬是一種選擇性自噬，通過清除受損的線粒體從而維持肝細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。PINK1/Parkin途徑是最經(jīng)典的線粒體自噬途徑：當(dāng)線粒體受損時，穩(wěn)定位于線粒體外膜的PINK1磷酸化，結(jié)合到Parkin的結(jié)構(gòu)域上，促進(jìn)了Parkin被PINK1磷酸化，進(jìn)一步引起結(jié)構(gòu)的重排和Parkin的激活，激活的Parkin將泛素蛋白連接到線粒體外膜蛋白上，為PINK1磷酸化提供更多的底物，放大Parkin的募集和激活，從而啟動線粒體自噬[24-25]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ATP能量耗竭或電子呼吸鏈活性受損時，線粒體自噬調(diào)控障礙，異常線粒體及ROS蓄積，加重細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激損傷、能量不足或細(xì)胞凋亡[26-27]。細(xì)胞受損后，線粒體通過釋放細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子，激活Caspase家族，尤其是Caspase-3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[28]。Caspase-3切割活化后轉(zhuǎn)化為cleaved-Caspase ^-3 ，因此兩者比值是衡量凋亡的重要指標(biāo)，此外促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2共同調(diào)控凋亡進(jìn)程[2]。研究顯示，ACLF患者肝組織內(nèi)PINK1蛋白表達(dá)減少，ROS及細(xì)胞凋亡明顯增加，過表達(dá)PINK1或激活PINK1/Parkin通路介導(dǎo)的線粒體自噬，可有效緩解肝衰竭導(dǎo)致的肝細(xì)胞凋亡和ROS過度蓄積[30-31]。因此，靶向PINK1/Parkin通路介導(dǎo)的線粒體自噬與凋亡可作為治療ACLF的一種新策略。

前期研究發(fā)現(xiàn)，溫陽解毒化瘀方可抑制肝衰竭大鼠的肝細(xì)胞凋亡，但其調(diào)控凋亡的具體途徑尚未完全明確，深入解析該方調(diào)控凋亡的具體分子機(jī)制，對揭示其改善ACLF的分子靶點具有重要價值。本研究通過構(gòu)建D-GaIN/LPS聯(lián)合誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷模型，予以溫陽解毒化瘀方含藥血漿干預(yù)，研究結(jié)果顯示，溫陽解毒化瘀方含藥血漿干預(yù)后可促進(jìn)線粒體膜電位恢復(fù)，抑制Bax蛋白表達(dá)，提高Bcl-2表達(dá)，降低cleaved-Caspase-3/Caspase-3比值，抑制線粒體內(nèi)源性凋亡途徑激活減輕D-GaIN/LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡；同時還可降低細(xì)胞內(nèi)ROS及MDA水平，提高SOD水平，緩解D-GaIN/LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。為進(jìn)一步探究溫陽解毒化瘀方減輕肝細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激損傷具體機(jī)制，本研究使用West-ernblot法和RT-qPCR法檢測PINK1/Parkin信號通路關(guān)鍵蛋白及mRNA的表達(dá)水平，并與自噬抑制劑3-MA對比，研究發(fā)現(xiàn)溫陽解毒化瘀方含藥血漿可提高PINK1、Parkin蛋白表達(dá)及LC3-ⅡI/LC3-I比值，降低P62表達(dá)，透射電鏡示線粒體損傷減輕，自噬溶酶體數(shù)量增加。自噬抑制劑3-MA可逆轉(zhuǎn)溫陽解毒化瘀方的保護(hù)作用，提示其減輕肝細(xì)胞損傷，可能與調(diào)控PINK1/Parkin通路促進(jìn)線粒體自噬有關(guān)。

綜上，本研究表明，溫陽解毒化瘀方可減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制內(nèi)源性凋亡途徑激活減輕D-GaIN/LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與促進(jìn)PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬有關(guān)。本研究未特異性靶向PINK1/Parkin信號軸進(jìn)行干預(yù)，未來可結(jié)合基因敲除或慢病毒轉(zhuǎn)染等手段進(jìn)一步闡明溫陽解毒化瘀方改善ACLF的具體分子機(jī)制。

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（本文編輯蘇維）