電針對脊髓損傷大鼠腸道動力及直腸Ca2+/CaM/MLCK 信號通路的影響

本文引用：羅小精，田楚寧，展立芬，李芊，梁柔筠，林志堅，卓越，許明，張泓.電針對脊髓損傷大鼠腸道動力及直腸 Ca/CaM/MLCK信號通路的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2025，45（5）：862-868.

[關鍵詞］脊髓損傷；腸道動力；電針；鈣離子；鈣調蛋白；肌球蛋白輕鏈激酶 [中圖分類號]R245 [文獻標志碼]A [文章編號]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.05.011

[Abstract]ObjectiveTobservetheefectsoflectroacupuncture （EA）oncalciumion（a），calmodulin（CaM），andmyosin light-chain kinase （MLCK）inrectaltisueofratswithspinalcordinjury（SC），soastoexplorethepotentialmechanismofEAin improvingintestinalmotilityofSCIratsMethodsAmong42adultfemaleSDrats，tenwererandomlyselectedastheshamoperatedgroup，whiletheremaining32ratsunderwentcompletetransectionofthespinalcordattheTO spinalsegmentto establishaSCImodelTwentysuccesfullymodeledrats wererandomlydividedintomodel groupandEAgroup，withtenrats in eachgroup.TheEAgroupwasgivenEAinterventionstartingfromday19aftermodeling，2Ominutespersesion，onceadayfor sevenconsecutivedays.Thesham-operatedandmodelgroupsunderwentonlyrestraintwithoutintervention.Thegeneralondition， bodyweightchangefecalwatercontent，andintestinalpropulsionrateofratswerebservedbeforeandaftertreatmentingroups. Thecontractilityofrectalsmothmusclewasobservedbyinvitrorectalsmoothmusclecontractiontest.TheCaconcentrationof rectaltissuewasdeterminedbycolorimetryandtheexpressonlevelsofCaMandMCKproteinsinrectalsmoothmuscletisue werecheckedbyWesternblotResultsAfterintervention，comparedwiththesham-operatedgroup，themodelgroupexhibited lethargy，poormentalstate，reducedfoodandwaterintake，bodyweight，fecalwatercontent，andintestinal propulsionrate（ Plt;0.05 ） Spontaneouscontractionsofisolatedrectalsmothusclestripsshowedreducdmaxima/minimal tensio，amplitude，andfrequency 0 P lt;0.05）.TheCa ²⁺ concentration in rectal tissue （ P： lt;0.05）and the CaM and MLCK protein expression levelsin rectal smooth muscle tissue decreased （ P- lt;0.05）.Compared with the model group，the EA group showed improved mental state，increased food and water intake，and elevated bodyweight， fecal water content，and intestinal propulsion rate （ P lt;0.05）.Spontaneous contractions of rectal smoothmusclestripsdmonstratedhancedmaximalminialtensionmplitde，andfrequency（O5），alongwithinreasdrectal tissue Ca ²⁺ concentration （ P- lt;0.05） and CaM/MLCK protein expression levels （ P- lt;0.05）. Conclusion EA can improve intestinal motility in SCI rats and its mechanism may be related to the regulation of Ca2/CaM/MLCK signaling pathway.

：ywords]spinal cord injury;intestinal motility；electro-acupuncture;calciumion;calmodulin;myosin light-chaink

脊髓損傷（spinalcord injury，SCI）是具有高發病率、高致殘性、高耗費特征的中樞神經系統疾病。腸道功能障礙作為SCI后嚴重的消化道并發癥之一[2]，其發病率高達 80%～97.3%^[3] ，臨床上表現為便秘、大便失禁、排便時間延長以及腹痛等，對患者的生活質量和獨立性具有嚴重的負面影響，是臨床亟須解決的難題。

SCI后腸道功能障礙的發病機制與腸道動力異常密切相關。研究顯示，腸道動力障礙與鈣離子（ Ca²⁺ /鈣調蛋白（calmodulin，CaM）/肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）信號通路及平滑肌功能密切關聯[6-7]。Ca2+/CaM/MLCK信號通路在調控平滑肌的舒縮活動中起著關鍵作用8。因此， Ca²⁺/CaM/MLCK 信號通路逐漸成為治療腸道動力障礙的重要干預靶點。目前，電針治療SCI后腸道功能障礙的臨床療效確切[9-10]，但其作用機制尚未完全闡明。相關研究證實，針刺干預可提升SCI大鼠腸道傳輸速度，并有效改善其腸道功能障礙]。有文獻指出，電針治療可通過調控細胞內外鈣穩態，維持Ca²⁺ 動態平衡，從而減輕鈣超載引發的組織損傷[12]。此外，有研究證實，針刺通過調節腸道CaM、MLCK等關鍵蛋白表達，影響 Ca²⁺/CaM/MLCK 信號通路，進而增強胃腸道動力和轉運能力[13]。然而，目前尚未見電針通過調控 Ca²⁺/CaM/MLCK 信號通路改善SCI后腸道動力障礙的系統研究報道。

基于以上研究背景，本研究以SCI模型大鼠為研究對象，從腸道動力的角度出發，以 Ca²⁺/CaM/ MLCK信號通路為切入點，探討電針對SCI后大鼠腸道動力障礙的作用及效應機制，為SCI后腸道動力障礙的治療提供新的思路及實驗依據。

1材料與方法

1.1 實驗動物與分組

本研究選取42只SPF級雌性SD大鼠，周齡10＼～12周，體質量 210～250g ，由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供并飼養[許可證號：SYXK（湘）2019-0004]。大鼠在溫度 24～26^°C 、濕度 50%～70% 、12 h明暗交替的條件下適應性喂養1周。隨機抽取10只作為假手術組，其余32只進行手術造模。其中，術中死亡3只（失血過多），護理過程中死亡5只（3只死于腹脹、2只死于傷口感染）。將評估造模成功的20只模型大鼠分為模型組和電針組，每組10只。本實驗嚴格遵循《實驗動物管理條例》和《善待實驗動物指導意見》，并獲湖南中醫藥大學倫理委員會批準（編號：LL2021091504）。

1.2 主要試劑

異氟烷（批號：2024071201，山東安特牧業科技有限公司）；乳酸鈉林格注射液（批號：M24040902，四川科倫白健安科技有限公司）；青霉素鉀（批號：140051248，江西省科達動物藥業有限公司）；CaM、MLCK（批號：AWA44808、NO5JU08，成都正能生物技術有限公司）；辣根酶標記的羊抗兔GAPDH（批號：SA00001-2，武漢三鷹生物科技有限公司）；鈣測試盒（批號：C004-2-1，南京建成生物工程研究所有限公司）。

1.3 主要儀器

離體組織浴槽系統、恒溫灌流器（型號：TOBS2000型、TP21型，北京金工鴻泰科技有限公司）；電針治療儀（型號：SDZ-V型，蘇州醫療用品廠有限公司）；轉膜儀、電泳儀（型號：041BR318885、041BR318885，美國Biorad公司）。

1.4造模方法及術后管理

結合前期研究基礎[4]和文獻研究[15-1]，采用改良HassanShaker技術建立T10椎體下（大致對應L1脊髓節段）脊髓完全橫斷模型。具體實驗步驟如下：首先，通過吸入異氟烷麻醉大鼠，隨后依次進行備皮，筋膜肌肉分離，暴露椎板、棘突、脊髓，并使用眼科剪完全橫斷脊髓，術中進行止血及抗感染處理，術后逐層縫合肌肉筋膜和皮膚，造模后將大鼠置于電熱毯上復溫。若術后 24h 內大鼠下肢無法參與行走，且移動時呈現拖曳狀態，則認為是符合本實驗要求的脊髓完全橫斷模型。

術后密切觀察大鼠生命體征，并采取以下護理措施以確保其恢復：進行抗感染處理（肌內注射青霉素鉀，劑量為 20×10⁴ U/只），維持電解質平衡（皮下注射乳酸鈉林格注射液，劑量為 20mL/kg ，分階段供水并予以大小便管理（每日8：00、12：00、16：00進行手法輔助排便及排尿）。除此之外，每日更換墊料，確保大鼠生存環境良好。

1.5 干預方法

本實驗選取次體作為電針穴位，根據課題組前期研究及《實驗針灸學》進行定位及測量。具體腧穴定位；次謬位于第2、第3骶骨棘突間隙正中稍上方，旁開 5～10mm 處。造模后第19天，SCI大鼠度過休克期，將其俯臥固定于鼠架上，予以電針治療。電針治療方法如下：（1）用30號1寸針，直刺次謬約 15mm ;（2）雙側次髎施以電針，使用疏密波（疏波 10Hz ，密波 50Hz ），強度以大鼠骶部輕微顫動為宜;（3） 20min/ 次，1次 /d ，連續干預 7d_o 假手術組和模型組僅捆綁，不干預。

1.6 觀察指標及方法

1.6.1一般情況觀察各組大鼠精神狀態、皮毛色澤、活動、進食、飲水、排尿、排便、自殘肢體和死亡等一般情況。

1.6.2大鼠體質量測量造模前、干預前后，分別對各組大鼠稱重并記錄大鼠體質量，每次測量時間為上午 8：00 。

1.6.3大鼠糞便含水量測定干預前后，分別于$8 { ： 0 0 } ＼ 、 1 2 { ： 0 0 } ＼ 、 1 6 { ： 0 0 }$ 收集大鼠糞便并測量濕重（M1）。將糞便樣本置于烘干箱干燥，干燥后稱量干重（M2）。糞便含水量 τ=（M1-M2）/M1×100%.

1.6.4大鼠腸道推進率測定末次電針治療后，大鼠禁食 24h ，但不禁水，根據大鼠體質量（ （1mL/100g） 的標準，每只大鼠灌胃半流質食物20。配方如下： 糖， .5g 羧甲基纖維素鈉， 奶粉， 3g 活性炭， 淀粉，約 150mL 蒸餾水。灌胃 2h 后，脫頸處死大鼠，取幽門至直腸末端的腸管，在自然松弛狀態下測量腸道推進長度（L1）及腸道全長（L2）。腸道推進率 =L1/L2×100% 。

1.6.5大鼠離體直腸平滑肌收縮試驗末次電針治療后，采用脫頸處死大鼠，迅速剪取一段直腸，制備成約 3mm×8mm 的肌條。將肌條浸沒于 37^°C Krebs生理溶液（ pH7.2～7.4） 中，一端固定，另一端與離體組織器官實驗系統的張力傳感器相連，持續供給 95% 0₂，5%CO_2o 每根肌條給予 預張力，平衡 30min ！再給予 1g 張力，待肌條穩定，通過計算機記錄分析肌條自發性收縮張力的最大值、最小值、幅度及頻率。1.6.6比色法檢測大鼠直腸組織 Ca²⁺ 濃度末次電針治療后，采用脫頸處死大鼠，每組隨機選取5只大鼠，采集 30mg 直腸組織，加入 0.3mL 去離子水制成勻漿， 離心 10min 取上清液，按照BCA測定試劑盒和鈣含量測定試劑盒的操作說明，計算蛋白濃度并根據標準曲線，得出直腸組織 Ca²⁺ 濃度。

1.6.7Westernblot檢測大鼠直腸組織CaM、MLCK蛋白表達末次電針治療后，采用脫頸處死大鼠，每組隨機選取5只大鼠，采集 50mg 直腸平滑肌組織，根據說明書，采用PMSF蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和RIPA裂解液提取樣本總蛋白，并通過BCA法測定蛋白濃度，隨后將樣本存放于 -20^°C 以備后續使用。電泳采用 10% 的SDS-PAGE，電壓為100V，當溴酚藍至分離膠底部時結束；轉膜采用電流 200mA ，時間 90min ，快速封閉液封閉 30min ;TBST 沖洗1次，一抗孵育 CaM 和 MLCK（1：1 000），GAPDH（1：50 000），4 C 過夜。次日，TBST洗滌3次，每次 10min ，室溫下二抗孵育 1.5h 二抗孵育后，再次用TBST洗滌3次，每次 10min_oECL 顯影后，用ImageJ軟件分析蛋白相對表達量。

1.7 統計學分析

采用SPSS26.0軟件進行統計分析，計量資料以“ \"表示，均符合正態性及方差齊性，多組間差異比較采用One-wayANOVA分析，進一步兩兩比較用 LSD 檢驗。均以 Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組大鼠一般情況結果

假手術組大鼠精神良好，毛發光澤，活動自如，且進食和飲水正常；與假手術組相比，模型組和電針組大鼠雙下肢拖曳，行動受限，需輔助排尿排便；模型組大鼠反應遲鈍，精神狀態和皮毛狀況差，進食和飲水量減少；而電針組大鼠精神狀態稍好，毛發光澤尚可，進食量有所增多。

2.2各組大鼠體質量結果

造模前，假手術組、模型組和電針組大鼠體質量比較，差異無統計學意義 （P50.05） 。干預前，模型組和電針組大鼠體質量較假手術組下降 （Plt;0.05） ，但模型組與電針組之間差異無統計學意義 （Pgt;0.05） 。干預后，模型組大鼠體質量低于假手術組 （Plt;0.05） ：與模型組相比，電針組大鼠體質量增加 （Plt;0.05） 。與干預前相比，干預后電針組大鼠體質量增加，模型組大鼠體質量緩慢增長，但差異均無統計學意義（ Pgt; 0.05）。詳見圖1。

2.3各組大鼠糞便含水量測定結果

干預前，與假手術組相比，模型組和電針組的糞便含水量降低 （Plt;0.05） ，但模型組與電針組之間差異無統計學意義（ Pgt;0.05） ，糞便顆粒較小。干預后，模型組糞便含水量仍低于假手術組（ _{（Plt;0.05）} ，但電針組糞便含水量高于模型組 （Plt;0.05） ，糞便顆粒較小但外觀正常，可連續排出。與干預前相比，干預后電針組大鼠糞便含水量增加 （Plt;0.05） ，模型組大鼠糞便含水量無明顯變化，差異無統計學意義 （P50.05） 0詳見圖2。

注：與假手術組比較， ；與模型組比較， ^?Plt;0.05

2.4各組大鼠腸道推進率測定結果

與假手術相比，模型組的大鼠腸道推進率降低中 Plt;0.05） ;與模型組相比，電針組腸道推進率增加（Plt;0.05） 。詳見圖3。

2.5 各組大鼠離體直腸平滑肌收縮試驗結果

與假手術相比，模型組大鼠直腸平滑肌自發性收縮張力的最大值、最小值、幅度及收縮頻率均降低（Plt;0.05） ；與模型組相比，電針組較模型組大鼠直腸平滑肌張力的最大值、最小值、幅度及收縮頻率均升高 （Plt;0.05） 。詳見圖4。

2.6各組大鼠直腸組織 Ca²⁺ 濃度測定及CaM、ML-CK蛋白表達結果

與假手術比較，模型組大鼠直腸組織 Ca²⁺ 濃度注：與假手術組比較， ;與模型組比較， ^*Plt;0.05_o （204號降低 （Plt;0.05） ，直腸平滑肌組織中CaM和MLCK蛋白表達水平降低 （Plt;0.05） ；與模型組比較，電針組大鼠直腸組織 Ca²⁺ 濃度升高（ Plt;0.05） ，直腸平滑肌組織中CaM和MLCK蛋白表達水平升高 （Plt;0.05） 。詳見圖5。

3討論

臨床中，SCI后腸道功能障礙患者主要病理表現為腸道運動功能障礙及腸道傳輸時間延長[4。目前，SCI后腸道功能障礙主要治療方式包括藥物、灌注：與假手術組比較，""；與模型組比較，"^*Plt;0.05， 0腸、電刺激、腸造瘺術等2，但存在毒副作用大、依賴性強或創傷性大等缺點。而電針是一種簡單、有效、價廉的治療方式，既往臨床研究及系統評價均表明，電針治療腸道功能障礙的安全性及有效性[22-23]

本研究選取次作為刺激穴位，從中醫角度出發，SCI后腸道功能障礙屬“便秘”“泄瀉\"的范疇，病在督脈。督脈總督一身之陽經，與脊柱關系密切，SCI后督脈氣血運行受阻，絡脈瘀滯，從而導致腸道功能失調。因此，調節督脈氣血運行，疏通絡脈瘀阻，對于改善腸道功能具有關鍵作用。足太陽膀胱經與督脈走形一致，氣血相通，共同調節臟腑功能。《千金方·卷三十·針灸下》云：“大小便不解灸八憀。\"次體為八髎穴之一，歸屬于足太陽膀胱經，具有疏通經氣、活血化瘀之效。從神經解剖學視角分析，次位于第二骶后孔，電刺激該穴能夠直接刺激S2神經根的傳出神經及低位腸段，進而調節盆腔神經的興奮性及敏感性，改善局部血液循環及腸周神經調控功能，同時調節直腸運動節律及直腸-肛門的協調性2。相關研究表明，S2神經根的作用優于S1和S3神經根[25]。此外，多項臨床研究證實，骶神經電刺激能夠調節傳人神經和局部反射通路，改善直腸感覺閾值，調節腸道壓力和動力，恢復肛門及盆底肌肉的功能[26-27]

本研究結果顯示，模型組大鼠體質量、腸道推進率、糞便含水量均降低，提示模型組大鼠腸道運動功能受損，電針治療后大鼠體質量、腸道推進率、糞便含水量均較模型組升高，提示電針可以改善大鼠的營養狀況，減少糞便在腸道內的滯留時間，調節腸道運動，改善腸道傳輸功能，提高排便效率。離體直腸平滑肌收縮試驗顯示，模型組大鼠直腸平滑肌張力的最大值、最小值、頻率和幅度均下降，經電針治療后大鼠直腸平滑肌張力的最大值、最小值、頻率和幅度均升高，提示電針對SCI大鼠直腸平滑肌舒縮性具有調節作用，能夠恢復直腸動力，進而改善直腸傳輸功能，減輕便秘的癥狀，這與鄭海梅等的研究結果一致。綜上，本研究發現電針“次\"可以有效增加SCI模型大鼠體質量和糞便含水量，促進其腸道推進率，增加腸道收縮性，從而改善腸道功能。

正常的腸道運動是由中樞神經系統、腸神經系統、Cajal間質細胞和血小板衍生因子受體 ∝ 陽性細胞組成的腸神經細胞網絡控制[16-17]。SCI可引發中樞神經系統對腸道運動的調控功能受損，進而誘發復雜的腸道功能障礙。SCI后患者結腸形態學研究揭示，中樞神經系統控制喪失導致結腸內神經結構顯著變化，主要表現為肌間神經叢中神經纖維密度降低、肌間神經元數量減少以及Cajal間質細胞受損28。該研究揭示，SCI后負責腸道運輸的平滑肌發生了神經通路的病理生理重塑，這些變化可能會對腸道動力產生負面影響。

平滑肌作為腸道運動的最終效應器，其與腸道動力障礙之間存在密切關聯。目前認為，平滑肌的收縮是一種鈣依賴的過程，其具體的收縮機制為：細胞質內游離 Ca²⁺ 濃度增高，促進 Ca²⁺/CaM 復合物的形成，該復合物可與MLCK結合引起MLCK構象改變，從而激活MLCK，引起肌球蛋白輕鏈磷酸化，進而促進平滑肌收縮活動8。故外界干預因素如果能夠升高 Ca²⁺ 濃度，或導致MLCK激活與肌球蛋白輕鏈磷酸化，則可促進平滑肌收縮。慢傳輸型便秘是一類腸道傳輸時間延長的慢性便秘，主要癥狀為排便次數減少、排便困難，其相關機制研究較多。SCI后腸道功能障礙在臨床表現及病理生理特征方面與慢傳輸型便秘具有較高的一致性。研究表明，慢傳輸型便秘大鼠腸道平滑肌細胞中 Ca²⁺ 濃度及CaMMLCK蛋白表達水平下降，腸道肌電漫波減慢、頻率變異系數增加[29]

在此基礎上，本研究檢測了各組大鼠直腸平滑肌組織 Ca²⁺ 濃度及CaM、MLCK蛋白的表達。結果顯示，與假手術比較，模型組大鼠直腸平滑肌組織 Ca²⁺ 濃度及CaM、MLCK蛋白表達均明顯降低；與模型組比較，電針組 Ca²⁺ 濃度及CaM、MLCK蛋白表達升高。以上結果提示，電針可能通過激活 Ca²⁺/CaM/ MLCK信號通路，改善SCI后大鼠的直腸動力。

綜上所述，電針能夠調節直腸平滑肌的舒縮功能，提高SCI后大鼠的直腸動力，其作用機制可能與調控 Ca²⁺/CaM/MLCK 信號通路有關。今后，可從以下幾個方面進一步探究：（1）早期電針干預對腸道動力障礙的預防作用；（2）對 Ca²⁺ /CaM/MLCK上下游機制進一步探索

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（本文編輯匡靜之）