去甲烏藥堿配伍6-姜酚前后對衰竭心肌細胞影響的研究

[關鍵詞]去甲烏藥堿；6-姜酚；H9c2心肌細胞；能量代謝；線粒體 [中圖分類號]R285.5 [文獻標志碼]A [文章編號]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.04.009

[Abstract]ObjectiveTocomparetheefectsofhigenamine beforeandaftercombinationwith6-gingerolon failing cardiomyocytes.Methods A failing H9c2 cell model was established using hydrogen peroxide （ H₂（ρ）₂） .The cells were divided into nine groups： blank group，model group， 6-gingerol group，higenamine single-use groups （5，10，20 μmol/l ），and higenamine combined with 6-gingerol （20 μmol/L ）groups.The mitochondrial morphology of the cellswas observed，and the mitochondrial membrane potential， Ca²⁺ concentration，ATP content，and mitochondrial membrane-associated active transport enzyme activity were measured. Results The replication conditions for inducing failing H9c2 cells were determined as 1000 μ mol/L H₂O₂ for2 hours.Comparedwiththemodelgroup，bothhigenaminemonotherapyanditscombinationwith6-gingerolsignificantly aleviatedmitochondrialulrastructuraldamage.Comparedwiththeuseof higenaminealone，thecombinationwith6-gingerol hadasynergisticprotectiveefectonthemodelcells，asevidencedbyamoreintactmitochondrialmembrane，clearer boundaries，andrestoredcristaestructure.Additionall，mitochondrialmembranepotentialwassignificantlyhigher，cytoplasmic and mitochondrial Ca2+concentrations were markedly lower，andATP content，along withtheactivities of Na+- K⁺. -ATPase， Ca ²⁺， -ATPase，and Ca ²⁺， -Mg2+-ATPase， significantly enhanced （ Plt;0.05 ， Plt;0.01 ）. Conclusion The combination of higenamine and 6- gingerolcansignificantlyenhancetheprotectiveefectonfaiing H9c2cardiomyocytes.Thisefectmayberelatedtotheir synergisticactioninalleviatingmitochondrialcalciumoverload，increasingmitochondrialATPaseactivity，promotingATP production，and restoring mitochondrial function.

[Keywords] higenamine;6-gingerol; H9c2 cardiomyocytes；energy metabolism；mitochondria

附子-干姜為經典藥對，兩者相須配伍具有增效作用，素有“附子無干姜不熱之說\"。研究證實，附子-干姜藥對可改善心力衰竭大鼠心功能，作用機制可能與調節氧化應激、增高線粒體呼吸鏈復合物和線粒體鈣單向轉運體的蛋白表達水平有關[2-3]。去甲烏藥堿、6-姜酚分別是附子中的主要強心成分和干姜中改善心血管功能的重要成分，且均具有抗氧化應激、增加心臟能量代謝和改善心功能等作用[47。也有研究者發現，去甲烏藥堿配伍6-姜酚可改善阿霉素誘導的H9c2細胞線粒體功能損傷8。但兩者配伍協同作用的具體機制尚未明確。

線粒體功能障礙、氧化應激、鈣超載均為心力衰竭的重要病理生理機制，且三者相互關聯，形成惡性循環，加重病情[9-12]。檢索已有文獻發現，鮮有以 H₂O₂ 誘導的衰竭心肌細胞模型探索去甲烏藥堿配伍6-姜酚影響細胞線粒體的報道。課題組前期通過成分配伍在H9c2細胞上證實甘草緩和附子心肌毒性，與調節線粒體功能、緩解氧化應激和鈣超載相關，且似乎對于衰竭心肌細胞模型具有協同保護作用[13-14]為進一步闡明附子干姜藥對配伍的科學內涵，本研究擬通過 H₂O₂ 誘導H9c2心肌細胞氧化損傷，觀察去甲烏藥堿配伍6-姜酚前后對模型細胞線粒體的影響，為附子“須\"干姜的藥理學基礎提供實驗依據。

牛血清（FBS，批號：124210-500）均購自武漢普諾賽公司； 3% H₂O₂ 溶液（批號：A007-1-1，美國Milli-Pore公司）；線粒體膜電位試劑盒（批號：M8650，北京索萊寶）；ATP測試盒（貨號：E-BC-FO02，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）； Ca²⁺-ATP 酶、 Na⁺- K⁺-ATP 酶 Δ.Ca²⁺-Mg²⁺-ATP 酶試劑盒（批號：A070-3-2，南京建成生物工程研究所）。

1.2 主要儀器

CO₂ 細胞培養箱（型號：3111）、全波長酶標儀（型號：1510）、立式壓力蒸汽滅菌鍋（型號：LMQ.C）均購自美國Thermo公司;多功能酶標儀（型號：Syn-ergyhTX，美國biotek公司）;Milli-QPlus超純水儀（型號：Milli-QPlus-Q，美國MilliPore公司）;倒置熒光顯微鏡（型號：BX51，日本OLYMUS公司）；電子分析天平（型號：LE204E/02，日本AND公司）；-80 C 超低溫冰箱（型號：F570-86）、高速離心機（型號：5180R）均購自德國EPPENDORF公司；制冰機（型號：HZB-50/AB，寧波惠康國際工業有限公司）；潔凈工作臺（型號：SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術有限公司）;超聲波清潔儀（型號：KM-500DE，昆山市超聲儀器有限公司）；電熱鼓風干燥箱（型號：GZX-9070MEB）、電熱恒溫水浴鍋（型號：SSW-420-2S）均購自上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1材料與方法

1.1 細胞及主要試劑

大鼠心肌細胞（H9c2）（批號：CL-0089，武漢普諾賽生物科技有限公司）；去甲烏藥堿標準品（ 98% ））（批號：AFCL2152）6-姜酚標準品（ ≈98% ）（批號：AFCE1803）均購自成都艾博克生物科技有限公司；DMEM高糖培養基（批號：PM150210）、PBS緩沖液（批號：PB180327）、胰蛋白酶-EDTA消化液（批號：PB1800226）、青鏈霉素混合液（批號：PB180120）胎

2實驗方法

2.1細胞培養與造模

在 37% （ CO₂ 條件下，用含 10% FBS和 1% 青鏈霉素的DMEM高糖培養H9c2細胞，待細胞密度達 90% 左右后，以 0.25% 胰酶消化傳代，取對數生長期細胞進行實驗。細胞消化計數后，將H9c2細胞接種于96孔板中，每孔 5×10³ 個細胞，分別加入不同濃度 處理細胞，空白組加入不含 H₂O₂ 的培養基，每個濃度

6個復孔， ^2，3，4h 后棄培養基，各孔加入 100μL 的 0.5μmol/L MTT溶液 37°C 孵育 ⁴h ，于 490nm 處酶標儀測定吸光度（OD值）。計算細胞存活率，確定最佳造模條件。細胞存活率 [A空白組-A空白組 ]×100% 。

2.2藥物濃度篩選

取對數生長期的H9c2細胞接種于96孔板中，每孔 5×10³ 個細胞，用不同濃度（5、10、20、40、80、 ）去甲烏藥堿、不同濃度（5、10、20、40、80、160μmol/L）6? -姜酚和不同濃度 （5，10，20，40μmol/L） 去甲烏藥堿配伍不同濃度 （5，10，20，40μmol/L）6- 姜酚處理細胞，每個濃度6個復孔， 24h 后各孔加入 100μL 的MTT溶液， 37°C 孵育 ⁴h ，于 490nm 處酶標儀測定吸光度（OD值），計算細胞存活率，確定最適藥物濃度。

2.3 分組及給藥

取對數生長期的 H9c2 細胞接種于6孔板中，1×10⁶ 個/孔，將細胞分為空白組，模型組，6-姜酚組， 5，10，20μmol/L 去甲烏藥堿單用組以及分別與20μmol/L 6-姜酚配伍組，每組5個復孔。除空白組外，其余各組用 H₂O₂ 造模 ^2h 后，各給藥組加入相應藥物處理 2h ，空白組用正常培養基培養。

2.4 指標檢測

2.4.1透射電子顯微鏡觀察線粒體超微結構取對數生長期的H9c2細胞接種于6孔板中， 1×10⁶ 個/孔，按照“2.3\"項處理干預細胞，離心收集細胞沉淀，加入電鏡固定液，進行固定、脫水、包埋、聚合、切片、染色操作，最后透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

2.4.2化學熒光法檢測 ATP含量參照\"2.3\"項處理干預細胞，收集細胞上清液，根據試劑盒說明書進行溶液配制，酶促反應后，應用酶標儀化學熒光法進行檢測，計算ATP含量。

2.4.3JC-1染色法檢測線粒體膜電位參照\"2.3”項處理干預細胞，按照JC-1試劑盒說明書操作，在熒光倒置顯微鏡下觀察、拍照。利用JC-1染料檢測線粒體膜電位，當線粒體膜電位低時，JC-1染料產生綠色熒光，線粒體膜電位高時，JC-1染料產生紅色熒光。

2.4.4熒光探針法檢測細胞鈣濃度 參照“2.3\"項

處理干預細胞，按照Fluo-4胞內 Ca²⁺ 檢測試劑盒及Rhod-2AM線粒體內 Ca²⁺ 檢測試劑說明書進行 Ca²⁺ 檢測試劑配制、裝載Fluo-4及Rhod-2AM探針等步驟，通過熒光倒置顯微鏡觀察、拍照。

2.4.5ELISA法檢測線粒體ATP相關轉運酶活性

參照“2.3\"項處理干預細胞，收集細胞上清液，參照 Na⁺-K⁺-ATP 酶 ?Ca²⁺-ATP 酶 Δ.Ca²⁺-Mg²⁺-ATP 酶試劑盒說明書進行操作，酶標儀波長 660nm 處檢測OD值，利用BCA試劑盒測定細胞蛋白總量，根據OD值與蛋白濃度計算去甲烏藥堿配伍6-姜酚前后衰竭H9c2心肌細胞上述酶活性。

2.5 統計學分析

采用SPSS21.0軟件對數據進行處理分析。計量數據以 $$ ”表示，若服從正態分布且滿足方差齊性，則進行單因素方差分析，各組數據之間采用LSD多重比較；若服從正態分布不滿足方差齊性，則進行單因素方差分析，各組數據之間采用Games-Howel多重比較；若不服從正態分布，則進行非參數檢驗，采用Kruskal-Wallish檢驗法成對比較。以 Plt;0.05 為差異有統計學意義。

3結果

3.1模型細胞復制條件

隨著 H₂O₂ 濃度升高，細胞存活率均較空白組顯著降低 （Plt;0.01） ，且隨著干預時間的延長，細胞存活率越低。其中，當模型組 H₂O₂ 濃度為 1 000μmol/L 、造模時間為 ^2h 時， H9c2 細胞存活率為 50% 左右，故選擇 H₂O₂ 濃度為 1 000μmol/L 干預 ²h 為最佳造模條件。

3.2 藥物濃度確定

與模型組比較，單用去甲烏藥堿濃度為1 0 ～" L、6-姜酚濃度為 20μmol/L 時，細胞存活率顯著升高， 5，10，20μmol/L 去甲烏藥堿配伍 20μmol/L 6-姜酚作用 ^2h 后細胞存活率升高 （Plt;0.05，Plt;0.01 ）其余配伍濃度均不能影響細胞存活率。結果見圖1-3。

3.3去甲烏藥堿配伍6-姜酚前后對模型細胞內線 粒體超微結構的影響

粒體整體呈現水腫、數量減少，超微結構出現膜腫脹、嵴斷裂溶解、間隙增大等病變；與模型組比較，6-姜酚組、去甲烏藥堿單用組，線粒體整體結構情況稍有改善，微觀結構損害情況明顯減輕；與去甲烏藥堿單用組比較， 5，10，20μmol/L 去甲烏藥堿配伍6-姜酚后線粒體膜相對完整、邊界較清晰，嵴結構完整，空泡化情況較少。詳見圖4。

3.4去甲烏藥堿配伍6-姜酚前后對模型細胞ATP含量的影響

與空白組比較，模型組ATP含量顯著降低 （Plt;0.01） ：與模型組比較，去甲烏藥堿組可升高模型細胞ATP含量 （Plt;0.01） ；與對應濃度去甲烏藥堿單用組比較，去甲烏藥堿配伍6-姜酚組ATP含量明顯增加（ Plt; 0.01）。詳見圖5。

注：紅色箭頭代表線粒體嵴形態，線粒體腫脹變形，嵴斷裂且缺失；黃色箭頭代表空泡化現象；綠色箭頭代表線粒體膜腫脹情況，線粒體腫脹變形、呈空泡狀，線粒體膜被破壞。

注：與空白組比較， ^*Plt;0.05 ;與模型組比較， ^*Plt;0.05 ，^**Plt;0.01 ；與對應濃度去甲烏藥堿單用組比較， ^?Plt;0.05.

3.5去甲烏藥堿配伍6-姜酚前后對模型細胞內線 粒體膜電位的影響

與空白組比較，模型組線粒體膜電位降低（ Plt; 0.01）；與模型組比較，去甲烏藥堿組可升高模型細胞線粒體膜電位 （Plt;0.01） ；與對應濃度去甲烏藥堿單用組比較，去甲烏藥堿配伍6-姜酚組線粒體膜電位可進一步升高 （Plt;0.01） 。詳見圖 6

3.6去甲烏藥堿配伍6-姜酚前后對模型細胞細胞質內及線粒體內鈣濃度的影響

與空白組比較，模型組細胞質內及線粒體內鈣濃度均升高 （Plt;0.01） ；與模型組比較，去甲烏藥堿組可降低模型細胞細胞質內及線粒體鈣濃度 （Plt;0.01） ，與對應濃度去甲烏藥堿單用組比較，去甲烏藥堿配伍6-姜酚組細胞質內及線粒體內鈣濃度明顯降低 （Plt;0.01 ）。詳見圖7。

3.7去甲烏藥堿配伍6-姜酚前后對模型細胞線粒體內 Na⁺-K⁺-ATP Ca²⁺. -ATP、 Ca²⁺-Mg²⁺. -ATP酶活性的作用的影響

與空白組比較，模型組內 Na⁺-K⁺-ATP，Ca²⁺-ATP Ca²⁺-Mg²⁺. -ATP酶活性均降低 （Plt;0.01） ；與模型組比較，去甲烏藥堿組可升高模型細胞 Na⁺-K⁺-ATP 、酶活性 Plt;0.01 ；與對應濃度去甲烏藥堿單用組比較，去甲烏藥堿配伍6-姜酚組 酶活性明顯升高 （Plt;0.01 ）。詳見表1。

4討論

附子辛甘大熱，為純陽之品，入心、腎、脾經，走而不守，能通行十二經，為回陽救逆第一藥；干姜辛而大熱，歸脾、腎、心、肺經，純陽之味，守而不走，長于溫中散寒。附子與干姜合用，具有協同作用，可使回陽救逆、溫中散寒的功效大為增強[15-1。現代研究表明，附子-干姜配伍通過增強心肌收縮力、擴張冠脈、增加心肌血流量、改善微循環等，發揮抗心力衰竭作用[17-18]

氧化應激是心力衰竭的重要生理病理機制之一，主要是由于ROS蓄積導致機體或組織的氧化/抗氧化系統平衡破壞，通過多種途徑介導細胞發生凋亡、自噬以及炎癥的損傷，從而造成不可逆的心肌細胞損傷和心肌功能障礙[]。與此同時，氧化應激損害線粒體呼吸鏈，降低ATP生成；ROS直接損傷線粒體DNA和蛋白質，進一步加劇細胞能量代謝障礙]。本實驗結果顯示，單用去甲烏藥堿及配伍6-姜酚后，模型細胞線粒體膜相對完整、邊界較清晰，嵴結構完整，空泡化情況較少，線粒體膜電位升高，且ATP含量上升，提示去甲烏藥堿及配伍6-姜酚均可緩解氧化應激，改善線粒體產能功能。

鈣超載是指各種原因所致的鈣濃度異常升高現象，正常情況下，線粒體通過鈣單向轉運體鈣單向轉運體（mitochondrial calcium uniporter， MCU）攝取鈣離子，并通過鈉鈣交換體鈉鈣交換體（sodiumcalci-umexchanger，NCX）排出鈣離子，維持鈣穩態。氧化應激所致的線粒體膜損傷，由于過度激活MCU和抑制NCX，最終導致線粒體內鈣超載。實驗結果顯示，去甲烏藥堿配伍降低衰竭心肌細胞細胞質及線粒體內鈣濃度，上述結果與之前報道一致；配伍6-姜酚，則可進一步增強去甲烏藥堿緩解鈣超載的作用。鈣超載的發生與生物膜ATP相關轉運酶活性降低、線粒體鈣離子轉運通道變化等有關。 Na⁺- K⁺-ATP 酶位于細胞膜，維持質膜的電化學梯度，當細胞內鈉濃度升高，激活 Na⁺/Ca²⁺ 交換器，將細胞內鈣轉運出胞外； Ca²⁺-Mg²⁺. -ATP酶位于肌漿網，使肌漿網釋放 Ca²⁺ ，泵出細胞外； Ca²⁺-ATP 酶位于細胞膜和線粒體膜上，負責將細胞內游離的 Ca²⁺ 轉運至胞外或者攝入肌漿網內，二者均可維持細胞內低鈣環境[20-21]。實驗顯示，去甲烏藥堿及與6-姜酚合用均使模型細胞 Na⁺-K⁺-ATP 酶 ?Ca²⁺-ATP 酶、 Ca²⁺- Mg²⁺. -ATP酶活性顯著提高。去甲烏藥堿可緩解鈣超載，維持鈣穩態，與增加ATP酶活性，促進細胞內Ca²⁺ 轉入肌漿網或轉出至細胞外有關，配伍6-姜酚可進一步緩解鈣超載。

有學者指出，去甲烏藥堿通過上調核轉示因子紅系2相關因子2的表達，激活抗氧化酶，進而保護心肌細胞免受氧化應激的損傷[22；去甲烏藥堿與6-姜酚配伍通過上調過氧化物酶體增殖劑激活受體 γ 共激活劑 ∝ 的表達，來增強線粒體能量代謝。但兩者配伍使用的協同作用及其具體機制不明。本實驗研究結果證實，去甲烏藥堿和6-姜酚配伍后可增加線粒體膜電位和ATP的生成，提高 Na⁺-K⁺-ATP，Ca²⁺-

ATP及 Ca²⁺-Mg²⁺. -ATP酶活性，降低細胞質內及線粒體內鈣濃度，即通過增強抗氧化應激能力、恢復鈣穩態改善衰竭心肌細胞功能；并首次在 H₂O₂ 誘導的衰竭心肌細胞上發現，6-姜酚與去甲烏藥堿在促進保護線粒體和促進線粒體能量代謝上具有協同增效作用。

本研究以中藥附子和干姜中的活性成分去甲烏藥堿與6-姜酚配伍為對象，在細胞模型上闡釋了附子“須\"干姜，這一發現為附子-干姜藥對的配伍提供了新的實驗依據。去甲烏藥堿與6-姜酚作為中藥的活性成分具有來源廣泛的優點，本研究也為心力衰竭的治療提供了新的藥物組合策略。未來，可進一步研究該藥對改善心力衰竭的具體機制，通過動物實驗等驗證其安全性和療效。

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（本文編輯蘇維）