基于 JAK-STAT/NF- ??κB 通路探究黃精“生熟異治\"治療缺血性腦卒中大鼠的保護(hù)作用及分子機(jī)制研究

[摘要]目的基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)探究生、熟黃精及其有效成分治療缺血性腦卒中（IS）大鼠的保護(hù)作用及分子機(jī)制。方法 運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建生、熟黃精治療IS的“關(guān)鍵成分-核心靶點(diǎn)-通路\"網(wǎng)絡(luò)圖。將56只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組 （20mg/kg ）、生黃精多糖低劑量組 （0.1g/kg） 、生黃精多糖高劑量組（ [0.4g/kg] ）、熟黃精多糖低劑量組（ （0.1g/kg） ）、熟黃精多糖高劑量組 （0.4g/kg） 。除手術(shù)組外，其余組采用線栓法建立大鼠IS模型。造模成功后，灌胃給藥，每日1次，連續(xù) 7d_o 按照 Zea Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組大鼠給藥前及給藥后0.5、1、3、5、7d的Longa神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分;給藥7d后，取腦組織，計(jì)算腦含水量;ELISA法檢測(cè)大鼠血清中白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6和腫瘤壞死因子 -α（TNF-α- ）、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）、泛素羧基端酯酶 L1（UCH-L1）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）和神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）含量;Western blot檢測(cè)腦組織中磷酸化Janus激酶2/Janus激酶2（p-JAK2/JAK2）、磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（ p -STAT3/STAT3）和磷酸化核因子 κB/ 核因子 κB（p-NF-κB/NF-κB） B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）和半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的蛋白表達(dá)水平;RT-qPCR法檢測(cè) Bcl-2、Bax和Caspase-3的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明，蛋白激酶B ∝ 、細(xì)胞色素P450家族2亞家族D成員6和STAT3等為生、熟黃精治療IS的共同潛在靶點(diǎn);雌激素受體 ∝ 、二肽基肽酶-4和雄激素受體等為生黃精治療IS的特有靶點(diǎn);Caspase-3、代謝型谷氨酸受體1和溶質(zhì)載體家族1成員2等為熟黃精治療IS 的潛在靶點(diǎn);氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等為生、熟黃精治療IS的共同信號(hào)通路。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦含水量、神經(jīng)功能評(píng)分均升高中 Plt;0.01 ）;血清IL-1β、IL-6、TNF- ??αα 、MDA、UCH-L1、NSE和GFAP水平均升高 （Plt;0.05，Plt;0.01 ），血清CAT和SOD水平顯著降低（ Plt; 0.01）;腦組織中 p -JAK2/JAK2 ??p -STAT3/STAT3和 p-NF-κB/NF-κB 蛋白表達(dá)水平升高（ Plt;0.05 ），Bax和Caspase-3的mRNA和蛋白表達(dá)水平升高 Plt;0.05 ），Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低 （Plt;0.05） 。與模型組相比，生黃精多糖低、高劑量組和熟黃精多糖低、高劑量組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分在給藥治療5d后降低 （Plt;0.01） ）;生黃精多糖組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF- σ_-α 水平降低（ Plt;0.05 Plt;0.01 ），熟黃精多糖組大鼠血清MDA、UCH-L1水平降低（ Plt;0.05，Plt;0.01 ），生黃精多糖高劑量組及熟黃精多糖組血清SOD水平升高 ;熟黃精多糖高劑量組腦組織中p-JAK2/JAK2 ??p -STAT3/STAT3 和 p-NF-κB/NF-κB 蛋白表達(dá)水平降低 ′Plt;0.05，Plt;0.01 ）Bax和Caspase-3mRNA表達(dá)水平降低 Plt;0.05，Plt;0.01 ;生、熟黃精多糖高劑量組腦組織中Bcl-2mRNA表達(dá)水平升高 （Plt;0.05） 。結(jié)論生、熟黃精多糖可改善IS大鼠的神經(jīng)損傷，其機(jī)制可能通過減少炎癥因子表達(dá)、改善氧化應(yīng)激、降低神經(jīng)損害標(biāo)志物表達(dá)水平，并調(diào)控JAK-STAT/NF- 信號(hào)通路，從而減輕腦組織炎癥反應(yīng)。

本文引用：.基于JAK-STAT/NF- ??κB 通路探究黃精“生熟異治\"治療缺血性腦卒大鼠的保護(hù)作用及分子機(jī)制研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2025，45（4）：598-607.

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[關(guān)鍵詞]生黃精；熟黃精；缺血性腦卒中；JAK-STAT/NF- 通路；生熟異治 [中圖分類號(hào)]R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.04.003

[Abstract] Objective To investigate the protectiveefects and molecular mechanisms of rawand processed Huangjing （PolygonatiRhizoma）andtheiractivecomponentsintreatingischemicstroke（S）ratsthroughetworkphrmacologyandexperiental studies.MethodsAnetwork pharmacologyapproachwasused toconstructa\"keycomponent-coretarget-pathway\"network diagram forrawandprocessdHuangjing（PolygonatiRhizoma）inIStreatment.Fiftysixratswererandomlydividedintoshamoperated， model，nimodipine（2g/kg），lowoseawHuangingplysaharide（.1g/kg）igdoserawuangjingolaccaride（.4kg） low-dose proessedHuangingpolysaccharide（O.1g/kg）andhigdoseprocessedHuangjingolysaccharide（.4g/kggroupsExept forthesham-operatedgroup，IS modelswereestablishedviathesuture-ocluded method.Aftersuccesful modelingdrugs were administeredbygavageoncedailyforsevendays.LonganeurologicalfunctionwasscoredusingtheZeaLongascalebefore administrationandatO.5，1，3，5，nd7daysafteradministrationAftersevendays，braintissewascolectedtocalculatebrain water content. Serum levels of interleukin （IL）-1β， IL-6， tumor necrosis factor- α （TNF- α_α∝ ），malondialdehyde （MDA），catalase （CAT）， superoxidedismutase（SOD），ubiqutin-erminalhydrolaseL1（UCH-Ll），neuro-specificenolase（NSE），andglialfblarciic protein（GFAP）weremeasuredbyELISA.WestemblotwasusedtodetemineproteinexpresionlevelsofphosphorylatedJanus kinase 2/Janus kinase 2（ p -JAK2/JAK2）， phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3/signal transducer and activator of transcription3 p -STAT3/STAT3），phosphorylated nuclear factor- ??K B/nuclear factor-kB（ p -NF-KB/NF-KB），B-cell lymphoma-2（Bcl-2），Bcl-associatedXprotein（Bax）andcaspase-3inrainisue.RTPCRwasusedtomeasureelatie mRNA expresion levels of Bcl-2，Bax，and caspase-3.Results Network pharmacology identified protein kinase B α ，cytochrome P450family2subfamilyDmember6，andSTAT3ascommonpotentialtargetsofrawandprocessedHuangjing （Polygonati Rhizoma） for IS treatment. Estrogen receptor α ，dipeptidyl peptidase ^-4 ，and androgen receptor were unique targets for raw Huangjing （PolygonatiRhizoma），whilecaspase-3，metabotropicglutamatereceptorl，andsolutecarrierfamily1member2were potentialtargetsforprocessd Huangjing（PolygonatiRhizoma）.Oxidativestresresponseandinflammatorysignalingtrasduction werecommonpathways forboth.Comparedwiththesham-operated group，themodelgroupshowedincreasedbrainwatercontent and neurological function scores （ Plt; 0.01）;elevated serum IL- ?1β ，IL- ⁶ ，TNF- α ，MDA，UCH-L1， NSE，and GFAP levels（ P^′ lt;0.05）; and significantly decreased CAT and SOD levels Plt;0.01 ）.The protein expression levels of p-JAK2/JAK2， p -STAT3/STAT3，and p-NFKB/NF-kBinbraintisseincreased（P0.05），andthemRNAandproteinexpressionlevelsofBaxandCaspase-3elevated（ Plt; lt;0.05）， while the mRNA and protein expression level of Bcl-2 decreased （ P- lt;0.05）.Compared with the model group，both low- and high-dose rawandprocessd Huangingpolysaccaridegroupsshowedreducedneurological functionscoresafterfivedaysofdrug treatment C Pe lt;0.01）.Raw Huangjing polysaccharide groups had lower serum levels of IL-1β， IL-6，and TNF- α_αα_αα_αα_αα_αα_αα_αα_αα_αα_αα_αα_αα_αα_α （ Plt; 0.05， Plt;0.01 1），while processed Huangjing polysaccharide groups showed reduced serum levels of MDA and UCH-L1 （ P lt;0.05， P lt;0.01）. High-dose raw Huangjing polysaccharide group and processed Huangjing polysaccharide groups showed increases in serum SOD level （ P lt;0.05）.High-dose processed Huangjing polysaccharide group showed decreases in p -JAK2/JAK2， p -STAT3/STAT3， and p-NF-kB/NF-kB protein expression levels （ P lt;0.05， Plt;0.01 ）， as well as mRNA expression levels of Bax and caspase-3 in brain tissue （ P lt;0.05， Plt;0.01 ）. Highdose raw and processed Huangjing polysaccharide groups exhibited elevated Bcl-2 mRNA expression level （ P lt;0.05）. Conclusion Bothrawandprocesed Huangjing polysacharidescanaleviateneuralinjuryinISrats，ndthemechanismmayinvolverducing inflammatorycytokines，improvingoxidativestres，lowering neuraldamagebiomarkersexpresion，andmodulatingtheJK-A NF-kB signaling pathway， thereby attenuating cerebral inflammatory reaction.

[Keywords]rawHuangjing（PolygonatiRhizoma）；processd Huangjing（Polygonati Rhizoma）；ischemicstroke;JAK-STAT/ NF-kB pathway;differential treatments of the raw and processed

腦卒中是由多種原因?qū)е履X血管受損，產(chǎn)生局灶性或整體腦組織損害的疾病，主要分為缺血性和出血性兩種，其中 86% 為缺血性腦卒中（ischaemicstroke，IS），臨床表現(xiàn)為失語、半身不遂等癥狀。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)采用溶栓、抗凝等方法治療，但易引發(fā)缺血再灌注損傷。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為IS屬于“中風(fēng)“范疇，病因在于陰陽失調(diào)、氣血逆亂，導(dǎo)致炎癥、氧化應(yīng)激等反應(yīng)，加劇腦損傷。中藥通過扶正祛邪、調(diào)和陰陽、益氣活血等作用，維持血腦屏障穩(wěn)定，抑制炎癥，改善微循環(huán)。目前，研究多聚焦于單味中藥活性成分（如黃芩苷、人參皂苷）對(duì)腦卒中的防治作用及其機(jī)制[4]。

黃精為百合科植物滇黃精PolygonatumkingianumColl.etHemsl、黃精PolygonatumsibiricumRed.或多花黃精PolygonatumcyrtonemaHua的干燥根莖，是臨床常用的“生熟異治\"中藥。生黃精偏潤(rùn)肺，熟黃精偏滋補(bǔ)，炮制過程導(dǎo)致其化學(xué)成分及含量發(fā)生顯著變化，形成“一潤(rùn)一補(bǔ)\"功效差異的物質(zhì)基礎(chǔ)。黃精主要活性成分包括黃精多糖、黃精皂昔及黃酮類成分，具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)等藥理作用。研究表明，黃精多糖可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞缺氧性凋亡，并顯著改善阿爾茨海默病模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。此外，黃精不同炮制品可調(diào)節(jié)氣陰兩虛模型大鼠的糖脂代謝、供氧能力及免疫功能，增加血清免疫球蛋白A和免疫球蛋白M水平。以上研究提示，黃精及其活性成分對(duì)IS誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷具有潛在治療作用。

研究表明，腦卒中后缺血再灌注損傷與炎癥、氧化應(yīng)激及神經(jīng)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。腦卒中后，細(xì)胞因子與受體結(jié)合激活Janus激酶2（januskinase 2，JAK2），進(jìn)而磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signaltransducer and activator of transcription 3， STAT3），促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位及下游基因轉(zhuǎn)錄[]。核因子 κB （nuclearfactorkappa-B，NF- ??κB 信號(hào)通路是炎癥和免疫反應(yīng)的核心調(diào)控途徑，其活化可誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)，加劇神經(jīng)細(xì)胞凋亡[。研究表明，抑制 NF-κB 通路可減輕脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎癥反應(yīng)，而STAT3在調(diào)節(jié) NF-κB 活化中起重要作用[12]。基于此，本研究以“生熟異治\"理論為指導(dǎo)，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建生、熟黃精治療IS的“成分-靶點(diǎn)-通路\"網(wǎng)絡(luò)，并通過線栓法建立IS大鼠模型，探討生、熟黃精多糖通過JAK-STAT/NF- ??κB 信號(hào)通路改善IS的作用機(jī)制差異，為中藥炮制理論的現(xiàn)代研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料

1.1動(dòng)物

SD大鼠[斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司]，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代購(gòu)，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010，SPF級(jí)，雄性，7周齡，體質(zhì)量1 260±5 ） g 。大鼠自由飲水?dāng)z食，于溫度（ 25±2 ） C 、相對(duì)濕度（ 55%±5% ）、12h光照 /12h 暗循環(huán)的條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)：HNUCM21-2312-16。

1.2 主要藥物、試劑、儀器

生黃精、熟黃精（山西元和堂中藥有限公司，批號(hào)：230704、230622），經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院王竹鑫老藥工鑒定為正品系百合科植物黃精PolygonatumsibiricumRed.的干燥根莖，符合《中華人民共和國(guó)藥典》（2020版）規(guī)定。

白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子 -α （tumor necrosis factor-α，TNF- ??α∝ ）過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）泛素羧基端酯酶L1（ubiquitin car-boxyl-terminal esteraseL1，UCH-L1）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillaryacidicprotein，GFAP）ELISA試劑盒（武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號(hào) ：RA20020、RA20607、RA20035、BTK076、BTK032、RA21277RA20076RA20774）;丙二醛（malondialde-hyde，MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A003-1-2）;B淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（B-cell lym-phoma-2，Bcl-2）Bcl-2同源的水溶性相關(guān)蛋白（Bcl-2-associatedX protein，Bax）半胱氨酸蛋白酶-3（cys-teinyl aspartate specific proteinase ^-3 ，Caspase ^-3 ）、JAK2、STAT3、NF- ??κB 抗體（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：A00183、A00040-1、BA2142、BM4165、BM4052、BA0610）。

RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）； DE-100g 型萬能高速粉碎機(jī)（浙江紅景天工貿(mào)有限公司）；U3000型高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）;GGNOME-XRQ-NPC型GeneG-nome成像系統(tǒng)（Syngene公司）。

2方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

課題組前期采用超高效液相色譜高分辨率質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)生、熟黃精中的化學(xué)成分進(jìn)行檢測(cè)，篩選其中的糖類等活性成分[13]，詳見表1。通過SwissTar-getPrediction 數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/ ），收集每個(gè)活性成分的作用靶點(diǎn)，獲得成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。以\"IS\"為關(guān)鍵詞，通過GeneCards數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org/）和 OMIM數(shù)據(jù)庫（http：//www.omim.org/），搜索IS相關(guān)的基因和蛋白靶點(diǎn)，獲得疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。通過UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）統(tǒng)一基因名稱。對(duì)活性成分潛在作用靶點(diǎn)與疾病靶標(biāo)取交集，得到生、熟黃精活性成分治療IS疾病的潛在作用靶點(diǎn)。通過繪制韋恩圖，基于GeneDegree中位數(shù)進(jìn)行篩選，納人大于中位數(shù)的靶點(diǎn)，以獲得更具有相關(guān)性的疾病靶點(diǎn)作為關(guān)鍵靶點(diǎn)。將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)人STRING數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/）獲取蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，并對(duì)成分-靶點(diǎn)-疾病進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，通過NetworkX軟件包（networkx-2.8.2，https：//networkx.org/documen-tation/stable/release/release_2.8.2.html）繪制相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖。通過GO數(shù)據(jù)庫（geneontology.org）和KEGG數(shù)據(jù)庫（https：//www.kegg.jp/）進(jìn)行GO 分析和KEGG分析，并通過R語言對(duì)通路富集分析的結(jié)果進(jìn)行可視化處理，對(duì)比推測(cè)分析生、熟黃精活性成分參與IS的治療網(wǎng)絡(luò)及生物效應(yīng)通路差異。

2.2生黃精和熟黃精水提物的制備及含量測(cè)定

2.2.1生黃精和熟黃精水提物的制備生、熟黃精藥材適量，分別加入蒸餾水浸泡 30min 后，加8倍量體積蒸餾水，加熱回流提取 40min ，過濾，收集提取液;藥渣再加入6倍量體積蒸餾水，加熱回流 40min 過濾；合并2次提取液，于 50°C 減壓濃縮，得含藥量為 1g/mL 的生、熟黃精水提物，4 C 儲(chǔ)存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[14]

2.2.2色譜條件高效液相色譜儀，Hypersil GOLDaQ C₁₈ 色譜柱（ 4. 6mm×250mm，5μm） ，柱溫 35^°C 流速 0.9mL/min ，進(jìn)樣量 5μL ，檢測(cè)波長(zhǎng) 240nm ！流動(dòng)相為乙晴-水，梯度洗脫。ELSD檢測(cè)條件：漂移管溫度為 105‰ ;載氣流速為 2.5L/min 。

2.2.3溶液制備對(duì)照品溶液的制備：取果糖和葡萄糖對(duì)照品，加水溶解，配制成質(zhì)量濃度為 2mg/mL （果糖） 0.4mg/mL （葡萄糖） .0.2mg/mL（5-HMF） 的對(duì)照品溶液， 0.45μm 微孔濾膜濾過，留續(xù)濾液，即得。供試品溶液的制備：取生、熟黃精粉末各約 ，精密稱定，加水 50mL ，稱定重量，超聲處理 40min 后，放至室溫，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，上清液過0.45μm 微孔濾膜，留續(xù)濾液，即得。

2.2.4生、熟黃精水提物含量測(cè)定校準(zhǔn)曲線方程果糖： Y=1.032X+4.921，r=0.999 8 ；葡萄糖： Y=1.963X+ 2.648，r=0.9991;5-HMF： Y=1.776X+6.533，r=0.9966 計(jì)算得生黃精水提物中果糖、葡萄糖和5-HMF質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 10.73%±1.96%.5.93%±1.43% 和 1.07%± 0.39% ;熟黃精水提物中果糖、葡萄糖和5-HMF質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 17.9%±1.98% 10.53%±0.85% 和 12.2%± 0.70% 。

2.3IS大鼠模型的制備、分組及給藥

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將56只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組 （20mg/kg） ）、生黃精多糖低劑量組 （0.1g/kg） 、生黃精多糖高劑量組 （0.4g/kg） 人熟黃精多糖低劑量組 （0.1g/kg） 、熟黃精多糖高劑量組 （0.4g/kg）^[15] ，每組8只。假手術(shù)組大鼠取頸部正中切口，分離頸部血管，不插入線栓，逐層縫合；其余各組大鼠均采用線栓法建立IS模型。以大鼠在蘇醒后均出現(xiàn)左側(cè)肢體癱瘓、站立不穩(wěn)，且提尾時(shí)向一側(cè)轉(zhuǎn)圈為造模成功標(biāo)準(zhǔn)[。造模成功的大鼠灌胃給藥，每日1次，連續(xù) 7d_c （20號(hào)

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)按照 ZeaLonga評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組大鼠給藥前及給藥后0.5、1、3、5、7d的Longa神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分0分：無神經(jīng)功能損傷；1分：對(duì)側(cè)前爪不能完全伸展；2分：行走時(shí)向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時(shí)向外側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失；5分：死亡。剔除評(píng)分為0分和5分的大鼠。2.4.2腦含水量測(cè)定末次給藥后，取腦組織，作厚約 3mm 的冠狀切片，立刻用電子天平稱質(zhì)量，得腦濕重。將腦片于 102‰ 烘干 ^12h ，稱質(zhì)量，得腦干重，計(jì)算腦含水量[腦含水量 （濕重-干重）/濕重 Φ_×100%] 。2.4.3ELISA法按照試劑盒說明書，檢測(cè)大鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF- σ?α?α?α?α ，氧化應(yīng)激因子MDA、CAT和SOD，神經(jīng)損害標(biāo)志物UCH-L1、NSE和GFAP的水平。

2.4.4Westernblot檢測(cè)將組織浸泡在蛋白裂解液中超聲破碎，每5分鐘渦旋一次以充分溶解，以12 500r/min 離心 15min ，收集蛋白上清液測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)分離蛋白的分子量制備不同濃度的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，電泳條件為 120V 90min 。PVDF膜用甲醇活化，轉(zhuǎn)膜條件為 280mA ，90min 。 5% 脫脂牛奶室溫下封閉 ¹h ，孵育JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、NF-kB（p65）、p-NF-κB（p-p65）Bcl-2、Bax 和Caspase ^-3 一抗， 4°C 過夜。次日取出 PVDF膜，用 1× TBST搖床洗滌3次，每次 8min 。將膜洗滌后與二抗室溫孵育 ¹h ，用 1×TBST 搖床洗滌3次，按1：1比例配制ECL超敏發(fā)光液。GeneG-nome成像系統(tǒng)捕捉圖像，ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析，GAPDH對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行歸一化。

2.4.5RT-qPCR 檢測(cè)取大鼠腦組織，提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用 2^-ΔΔCT 法計(jì)算Bcl-2、Bax 和Caspase ^-3 的mRNA相對(duì)表達(dá)水平，以 β -actin作為內(nèi)參，引物序列如下。Bcl-2：正向 CAGACATGCACCTACCCAGC-3'，反向 5^′ -GTCGCTACCGTCGTGACTTC- ?3^′ ，長(zhǎng)度 284bp ;Bax：正向 5^°- CAGACATGCACCTACCCAGC- ?3^′ ，反向 5^′ -GTCGC-TACCGTCGTGACTTC- ?3^′ ，長(zhǎng)度 229bp;Caspase ^-3 ：正向 5^′. -CGACCCGTCCTTTGAATTTCT- .3^′ ，反向 5^°- CTGACTGGAAAGCCGAAACTC- -3^′ ，長(zhǎng)度189bp; β- actin：正向 5^′ -AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA -3^′ ，反向 5^′ -TCAGGTCATCACTATCGGCAAT -3^′ ，長(zhǎng)度150bp 。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPadPrism8進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有計(jì)量資料數(shù)據(jù)均以“ \"表示。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，組間多重比較采用 LSD 法。以 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1生、熟黃精治療IS\"關(guān)鍵成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得到57個(gè)生黃精治療IS可能的潛在靶點(diǎn)、57個(gè)熟黃精治療IS可能的潛在靶點(diǎn)（圖1A）。根據(jù)成分-靶點(diǎn)-疾病做拓?fù)浞治?，取?0個(gè)作為核心靶點(diǎn)（交集不足50的選取全部），根據(jù)成分-核心靶點(diǎn)數(shù)據(jù)及GO通路分析前20的結(jié)果，繪制\"關(guān)鍵成分-核心靶點(diǎn)-通路\"網(wǎng)絡(luò)圖，可知：蛋白激酶B ∝ （protein kinase B ∝ ，AKT1）多巴胺受體D2（dopamine receptor D2，DRD2）、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreductase，HMGCR）、細(xì)胞色素P450 2D6（cytochromeP450 2D6，CYP2D6）、STAT3、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase， G6PD）和早老素1（presenilin1，PSEN1）為生、熟黃精治療IS 的共同潛在靶點(diǎn);雌激素受體 ∝ （estrogen recep-tor ∝ ，ESR1）、多巴胺受體 D2（dopamine receptor D2，DRD2）、核受體亞家族1H組第 4成員（nuclear recep-tor subfamily1 group H member 4，NR1H4）、二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase ^-4 ，DPP4）和雄激素受體（androgenreceptor，AR）為生黃精治療IS的潛在靶點(diǎn);代謝型谷氨酸受體（metabotropic glutamate re-ceptor，GRM）2、5-羥色胺受體 2A（5-hydroxytrypta-mine receptor2A，HTR2A）、GRM3、Caspase-3、GRM1、溶質(zhì)載體家族1成員2（solute carrier family1 mem-ber2，SLC1A2）和5-羥色胺受體 2C（5-hydroxyt-ryptaminereceptor2C，HTR2C）為熟黃精治療IS的潛在靶點(diǎn)。

通過GO數(shù)據(jù)庫對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行通路功能注釋及通路富集分析，結(jié)果表明氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等為生、熟黃精治療IS的共同信號(hào)通路（圖1B）。通過KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行通路功能注釋及通路富集分析，可知癌癥通路、化學(xué)致癌-受體活化、催乳素信號(hào)通路和內(nèi)分泌的阻力為生黃精治療IS的潛在通路（圖1C）。神經(jīng)活性配體-受體相互作用、含血清素的神經(jīng)突觸、磷脂酶D信號(hào)通路、谷氨酸能突觸、間隙連接、弓形體病、麻疹、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人類乳頭瘤病毒感染、人類巨細(xì)胞病毒感染、丙型肝炎、乙型肝炎、EB病毒感染、可卡因成癮、鈣信號(hào)通路、阿爾茨海默病和晚期糖基化終末產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體信號(hào)通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用為熟黃精治療IS的潛在通路（圖1D、圖1E）。以上結(jié)果提示生、熟黃精治療IS的潛在分子機(jī)制存在差異

3.2生、熟黃精對(duì)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦含水量的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及腦含水量顯著升高 （Plt;0.01） 。與模型組相比，治療1、3d后生黃精多糖高劑量組和熟黃精多糖高劑量組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均下降 （Plt;0.05，Plt;0.01） ；治療5d后尼莫地平組、生黃精多糖低劑量組、生黃精多糖高劑量組、熟黃精多糖低劑量組和熟黃精多糖高劑量組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均下降 （Plt;0.01） ；治療后

7d尼莫地平組、生黃精多糖高劑量組、熟黃精多糖低劑量組和熟黃精多糖高劑量組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均下降（ -Plt;0.01 ）。與模型組相比，尼莫地平組和熟黃精多糖高劑量組腦含水量降低 （Plt;0.05，Plt;0.01） 。詳見圖2。

3.3生、熟黃精對(duì)大鼠血清炎癥、氧化應(yīng)激水平及神經(jīng)損害標(biāo)志物的影響

與假手術(shù)組相比，模型組血清中IL-1β、IL-6、TNF- α，MDA 、UCH-L1、NSE和GFAP水平均升高（Plt;0.05，Plt;0.01） ，CAT和SOD水平均顯著降低（ Plt; 0.01）。與模型組相比，尼莫地平組血清中 IL-1β IL-6，TNF-α，MDA 、UCH-L1、NSE和GFAP水平均降低 （Plt;0.05，Plt;0.01） ，CAT水平升高 （Plt;0.05） ；生黃精多糖低劑量組血清中 IL-1β 、IL-6、TNF- σ?α?α?α?α 均降低（Plt;0.05，Plt;0.01） ；生黃精多糖高劑量組血清中IL-1β?cornerIL?angle6?angleTNF?angleα 均降低 （Plt;0.05，Plt;0.01） ，SOD水平升高 （Plt;0.05） ;熟黃精多糖低劑量組血清中IL-6、MDA、UCH-L1均降低 （Plt;0.05，Plt;0.01） ，SOD水平均升高 （Plt;0.05） ;熟黃精多糖高劑量組血清中IL-6、MDA、UCH-L1、NSE 和GFAP均降低 （P40.05，P40.01） CAT和SOD水平均升高 （Plt;0.05） 。詳見圖3。

3.4生、熟黃精對(duì)大鼠腦組織JAK-STAT/NF- ??κB 通路及凋亡相關(guān)蛋白的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中 -JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 Ω.p-NF-κB/NF-κB. Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高 （Plt;0.05，Plt;0.01 ），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低 （Plt;0.01 ）。與模型組相比，生黃精多糖低劑量組和熟黃精多糖高劑量組p-JAK2/JAK2蛋白表達(dá)水平降低 （Plt;0.05） ；熟黃精多糖低、高劑量組 p -STAT3/STAT3蛋白表達(dá)水平降低（ Plt;0.05 Plt;0.01 ）；尼莫地平組、生黃精多糖高劑量組和熟黃精多糖低、高劑量組 p-NF-κB/NF-κB 蛋白表達(dá)水平顯著降低 （Plt;0.01） ；生黃精多糖低劑量組和熟黃精多糖低、高劑量組Bax蛋白表達(dá)水平降低 （Plt;0.05 Plt;0.01 ）;熟黃精多糖低劑量組大鼠腦組織中Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高 （Plt;0.01） ；熟黃精多糖低劑量組、生黃精多糖高劑量組Caspase ^-3 蛋白表達(dá)水平降低 （Plt;0.05，Plt;0.01） 。詳見圖4。

3.5生、熟黃精對(duì)大鼠腦組織凋亡水平的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中Bax和Caspase ^-3 的mRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高（ Plt; 0.01），Bcl-2mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著降低（ Plt; 0.01）。與模型組相比，尼莫地平組、生黃精多糖高劑量組和熟黃精多糖低、高劑量組BaxmRNA相對(duì)表達(dá)水平均降低 （Plt;0.05，Plt;0.01） ；尼莫地平組、生黃精多糖高劑量組和熟黃精多糖高劑量Bcl-2mRNA相對(duì)表達(dá)水平均升高 （Plt;0.05，Plt;0.01） ；尼莫地平組和熟黃精多糖高劑量組Caspase-3的mRNA相對(duì)表達(dá)水平均降低（ （Plt;0.05） 。詳見圖5。

4討論

目前，IS的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，可能涉及血栓形成、血管痙攣、腦水腫、細(xì)胞凋亡等多方面，可能導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，引起神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的損傷或死亡[18]。在慢性腦缺血狀態(tài)下，小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞被過度激活而誘發(fā)炎癥反應(yīng)，釋放大量IL-1β、TNF- σ?α?α?α?α?α 等促炎因子，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和神經(jīng)元細(xì)胞死亡[18]中醫(yī)臨床用藥強(qiáng)調(diào)炮制，生、熟藥性各異。開展基于臨床療效的生、熟飲片藥性及其差異作用機(jī)制的評(píng)價(jià)研究，是中藥炮制現(xiàn)代研究亟待突破的關(guān)鍵科學(xué)問題。目前，已有研究表明，生、熟黃精及其有效成分在抑制炎癥因子表達(dá)、改善神經(jīng)損傷、保護(hù)心腦血管等方面有顯著作用[1]。因此，本文基于“生熟異治\"炮制理論，以線栓法建立大鼠腦卒中模型，觀察生、熟黃精及其有效成分對(duì)腦卒中大鼠癥狀的改善作用，結(jié)果表明生、熟黃精及其藥效成分均可不同程度地降低IS大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和腦含水量，改善IS大鼠血清炎癥、氧化應(yīng)激和神經(jīng)損害標(biāo)志物水平。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可從整體視角研究中藥的作用機(jī)制，與中醫(yī)藥的整體觀念一致，充分展現(xiàn)了中藥方劑以“君、臣、佐、使\"配伍為基本原理的優(yōu)勢(shì)。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建生、熟黃精治療IS的“關(guān)鍵

成分-核心靶點(diǎn)-通路\"網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果表明，AKT1、CYP2D6、STAT3和PSEN1等為生、熟黃精治療IS的共同潛在靶點(diǎn)；ESR1、DPP4和AR等為生黃精治療IS的潛在靶點(diǎn)；CASP3、GRM1、SLC1A2和HTR2C等為熟黃精治療IS的潛在靶點(diǎn)；氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)有機(jī)氮化合物的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等為生、熟黃精治療IS的共同信號(hào)通路。

JAK2是一種非受體酪氨酸激酶，參與細(xì)胞周期進(jìn)程、凋亡、有絲分裂重組、遺傳不穩(wěn)定性和組蛋白修飾等過程，可被 IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎癥因子激活；p-JAK2可激活STAT3， p -STAT3易位至細(xì)胞核中，啟動(dòng)炎癥基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，引發(fā)神經(jīng)炎癥和細(xì)胞凋亡；JAK2/STAT3通路是神經(jīng)炎癥的有效治療靶點(diǎn)[19]。 NF-κB 在細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過程中起關(guān)鍵作用，其失調(diào)會(huì)引發(fā)自身免疫病、慢性炎癥等，據(jù)此推測(cè)阻斷炎性因子激活JAK-STAT/NF- σ_?κB 通路可能對(duì)抑制IS大鼠腦組織局部炎癥反應(yīng)具有重要作用。本研究基于JAK-STAT/NF- ??κB 信號(hào)通路，探討了生、熟黃精多糖對(duì)IS大鼠作用機(jī)制的差異性。結(jié)果表明，生黃精多糖在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)方面表現(xiàn)出更顯著的效果，而熟黃精多糖在改善氧化應(yīng)激和抑制細(xì)胞凋亡方面作用更為突出。此外，生、熟黃精多糖均能下調(diào)IS大鼠腦組織中 p -JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、p-NF-kB/NF-κB、Bax及Caspase-3蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，從而有效改善IS大鼠的神經(jīng)功能損傷癥狀。由于生、熟黃精作為中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，其具體藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及潛在作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

綜上，生、熟黃精多糖可改善IS大鼠，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)、改善氧化應(yīng)激、降低神經(jīng)損害標(biāo)志物的表達(dá)水平，通過JAK2-STAT3/NF- ??κB 通路改善腦組織中的炎癥反應(yīng)相關(guān)。

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