中等強度耐力運動對老年性骨質(zhì)疏松癥小鼠NLRP3/Caspase-1/GSDMD焦亡通路的影響

[關(guān)鍵詞]老年性骨質(zhì)疏松癥；耐力運動；炎癥；焦亡;NLRP3;Caspase-1;GSDMD [中圖分類號]R68;R274 [文獻標(biāo)志碼]A [文章編號]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.04.005

[Abstract]ObjectiveToinvestigatetheefectsof moderate-intensityenduranceexerciseonsenileosteoporosis （SOP） throughtheNOD-likereceptor family pyrindomaincontainingprotein3 （NLRP3）/cysteineprotease-1 （Caspase-1）gasdermin D （GSDMD）signaling pathway.Methods Twenty-one18-month-old maleC57mice wererandomlydivided into three groups：the18- month-oldgroup，the2O-month-oldgroup，andtheexercisegroup，with seven mice ineach group.The SOPanimal model was replicatedusing naturallaged malemice，andanadditional seven six-month-old maleC57mice wereselectedas theyounggroup. Afteroneweek ofadaptivefeding，miceintheyoung groupand18-month-oldgroupwereeuthanized forsamplecolection.Mice intheexercisegroupunderwentmoderate-intensityendurancetraining，whilethoseinthe2O-month-oldgroupreceivedno intervention.Samples werecoletedaftereightweeksof intervention.Bone mineral density（BMD）of theleftfemur ineachgroup of micewasmeasuredusing micro-computedtomography（Micro-CT.ELISAwasused todeterminetheserum levelsof bone metabolismmarkers，ncludingC-terminaltelopeptideoftypeIcollgen（CTX-1），tartrateresistantacidphosphatase（AC） terminal propeptdeoftyeIprocollgen（INP），andbospcificalalinephospatase（B-APInditin，levelsofitein 1β（IL-1β）andinterleukin-18（IL-18）intherightfemurwereasessedWesternblotanalysiswasconductedtodeteminethe proteinexpresionlevelsofNRP3，Caspase-1，andtheN-terminalfragmentofGSDMD-Nintherightfemurofeachgroup. Results Compared with theyoung group，the18-month-oldand2O-month-old groups showed increased serum levelsof CTX-1and TRACP，as well as elevated expression levels of NLRP3，Caspase-1，GSDMD-N， IL- 1β ，andIL-18intherightfemur（ P lt;0.05， Plt; 0.01）.Meanwhile，serum levels of PINP and B-ALP，along with BMDof the left femur，decreased （ P lt;0.05， P?0.01 1）.Compared with the18-month-oldgroup，the2O-month-old group exhibited increases inserum CTX-1andTRACPlevels，aswellasinNLRP3， Caspase-1， GSDMD-N， IL-1β，and IL-18 expression levels in the right femur （ P?0.05 P?0.01 ），along with decreases in serum PINP and B-ALP levels and left femur BMD （ P lt;0.05， P lt;0.01）.Compared with the 2O-month-old group， the exercise group showed reductions inerumCTX-1andRACPlevels，aswellasinrightfemoralexpresionlevelsofLRP3，Caspase-1，GD-N，IL 1β，and IL-18 （ P lt;0.05， P

老年性骨質(zhì)疏松癥（senileosteoporosis，SOP）是一種與增齡相關(guān)的代謝性骨病，主要表現(xiàn)為骨量低下、骨組織微結(jié)構(gòu)損壞而導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折2。最新流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國65歲以上人群骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）女性患病率為51.6% ，男性為 10.7%^[3] 。SOP是造成老年患者骨質(zhì)疏松性骨折的重要原因，極大影響了老年人的生活質(zhì)量，嚴重增加了社會的醫(yī)療負擔(dān)。

破骨細胞骨吸收和成骨細胞骨形成偶聯(lián)失衡導(dǎo)致骨丟失是OP的關(guān)鍵。研究表明，內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、腸道微生物組、細胞衰老和焦亡等在骨穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用4。當(dāng)免疫系統(tǒng)失衡時，引起炎癥反應(yīng)，骨穩(wěn)態(tài)失衡，最終導(dǎo)致骨量丟失和OP的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，增齡可使免疫系統(tǒng)持續(xù)低度活化，處于促炎癥反應(yīng)狀態(tài)。炎癥介質(zhì)可以直接或間接作用于骨細胞，在OP的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。研究表明，在SOP患者中，血清中的促炎細胞因子如白細胞介素-1β（interleukin-1beta，IL- ?1β ）腫瘤壞死因子- σ?α?α?α?α （tumor necrosis factor-alpha， TNF- ??αα?αα ）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平顯著升高，這些細胞因子通過促進破骨細胞的活化，影響骨代謝。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者類

NOD樣受體家族含吡啶結(jié)構(gòu)域蛋白3（NOD-likereceptor family pyrin do main containing 3，NL-RP3）炎性水平顯著升高，且在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動物模型中，通過CH6修飾的脂質(zhì)納米顆粒遞送NLRP3靶向小干擾RNA 進行干預(yù)，可降低 NLRP3、IL-1β和白細胞介素-18（interleukin-18，IL-18）的表達，從而促進骨形成，改善骨微結(jié)構(gòu)[7]。因此，抑制炎癥反應(yīng)可作為治療OP的重要靶點。細胞焦亡作為一種由炎癥小體引發(fā)的細胞程序性死亡，可引起炎癥反應(yīng)，由半胱氨酸蛋白酶-1（cysteine protease-1，Caspase-1）介導(dǎo)的焦亡經(jīng)典通路，依賴NLRP3炎癥小體激活。活化的Caspase-1切割氣孔蛋白D（gas-derminD，GSDMD）蛋白，形成N端、C端結(jié)構(gòu)域，同時切割I(lǐng)L-1β和IL-18前體促進其成熟和釋放，以招募更多炎癥細胞聚集，擴大炎癥反應(yīng)，調(diào)控破骨細胞活化，調(diào)節(jié) OP^[8-9] 。因此，NLRP3/Caspase-1/GSDMD信號通路可作為干預(yù)SOP的潛在靶點。

已有臨床和實驗證明，運動能夠有效防止骨質(zhì)流失。一項關(guān)于運動對OP和骨質(zhì)減少患者骨密度的系統(tǒng)評價和網(wǎng)絡(luò)Meta分析顯示，聯(lián)合運動、阻力運動、有氧運動和身心運動對提高腰椎骨密度有顯著效果，世界衛(wèi)生組織也推薦運動可以作為防治

OP的非藥物治療手段。另有研究證實，運動可以調(diào)節(jié)SOP的骨穩(wěn)態(tài)，緩解骨質(zhì)流失，抑制相關(guān)細胞因子的表達，從而減輕炎癥反應(yīng)[1I-2]。此外，慢性中等強度的耐力運動訓(xùn)練可抑制NLRP3炎癥小體的激活，以響應(yīng)各種病理因素[13]。因此，本研究選用自然老化形成的增齡性骨質(zhì)疏松小鼠作為SOP模型，采用中等強度耐力運動，從調(diào)節(jié)NLRP3/Caspase-1/GSDMD信號通路、抑制炎癥和焦亡反應(yīng)、調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)的角度，探討中等強度耐力運動對SOP的影響，為運動防治SOP提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1 實驗動物

21只18月齡雄性C57小鼠，體質(zhì)量（ 30±2 ）g，7只6月齡雄性C57小鼠，體質(zhì)量（ 29±2 ） g ，均由杭州子源實驗動物科技有限公司提供動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙） 12019-0004] 飼養(yǎng)于中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，溫度 20～25°C ，相對濕度 50%～ 60% ，自然晝夜節(jié)律，自由飲水?dāng)z食。本實驗經(jīng)中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審批（批準號：HNUCM21-2403-38）。

1.2主要試劑和儀器

異氟烷（批號：R510-22-10，深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司）；I型膠原C端肽（typeIcollagencarboxy-terminal peptide，CTX-1）抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRACP）、I型前膠原氨基端前肽（typeIprocollagenamino-terminalpeptide，PINP）特異性堿性磷酸酶B（bonealkaline phosphatase，B-ALP）、IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒（貨號：JL20123、JL11586、JL20174、JL20367、JL18442、JL20253，上海江萊生物科技有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、Rabbit二抗（貨號：E-BC-K318-M、E-AB-1003，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）； β -actin抗體（貨號：20536-1-AP，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；NLRP3、Caspase-1抗體（貨號：ET1610-93、SU40-07，杭州華安生物技術(shù)有限公司）;GSDMD-N抗體（貨號：ab219800，英國Abcam公司）。

小動物跑步機（型號：ZS-PT型，北京眾實科技有限公司）;Micro-CT（型號：QuantumFX，美國PerkinElmer公司）；電泳儀、GloMax酶標(biāo)儀（型號：041BR126545GM3030，美國Bio-rad公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1動物造模為避免骨質(zhì)流失因雌激素缺乏而復(fù)雜化，本研究采用自然衰老的雄性小鼠復(fù)制SOP動物模型，采用青年雄性小鼠作為對照。復(fù)制SOP動物模型一般選擇18＼～24月齡的動物[14-15]，18月齡小鼠相當(dāng)于人類的65＼～70歲[，完成自然衰老造模，是用于研究SOP的廣泛選擇。根據(jù)已有研究，18月齡C57小鼠在骨代謝上表現(xiàn)出顯著的骨質(zhì)喪失、骨密度降低和骨微結(jié)構(gòu)改變，這些變化與人類SOP特征相似[17。小鼠在5＼～6月齡時達到骨量峰值[18]，故青年組采用6月齡雄性小鼠，相當(dāng)于人類的25＼～30歲[，作為對照。

1.3.2動物分組將21只18月齡雄性C57小鼠按隨機數(shù)字表法平均分為3組：18月齡組、20月齡組、運動組，每組7只。7只6月齡雄性C57小鼠作為青年組。

1.3.3實驗干預(yù)青年組和18 月齡組小鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后處死并取材。20月齡組和運動組小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，置于鼠籠內(nèi)自由活動。同時，運動組給予運動干預(yù)，正式運動前，給予3d適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練，跑速固定為 次/d，跑臺坡度為 0^° 。適應(yīng)性訓(xùn)練結(jié)束后，運動組給予中等強度耐力運動訓(xùn)練，即運動強度相當(dāng)于最大攝氧量的 55%^[19-20] 。具體運動訓(xùn)練方案如下：跑臺坡度始終為 0^° ，小鼠在以 的速度熱身 10min 后，以12m/min 的速度運動 20min ，再以 的速度冷卻 5min 。運動時長每3d增加 5min ，直至達到45min ，熱身和冷卻時長始終不變。共運動訓(xùn)練8周， 周，1次/d，根據(jù)小鼠和人類之間的壽命比較，小鼠的8周大約相當(dāng)于人類的6年2，因此，8周的運動訓(xùn)練被認為是長期耐力訓(xùn)練。

1.3.4實驗樣本采集各組小鼠給予 1% 戊巴比妥鈉麻醉，眼眶取血用于ELISA檢測血清骨代謝水平。采血后，快速分離小鼠雙側(cè)股骨，剔除多余的結(jié)締組織和肌肉。將左側(cè)股骨置于 4% 多聚甲醛溶液中固定，用于Micro-CT檢測骨密度；將右側(cè)股骨錫紙包裹后保存于 -80^°C 冰箱，用于Westernblot、ELISA檢測。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1Micro-CT掃描檢測骨密度隨機選取各組小鼠部分左側(cè)股骨進行Micro-CT掃描，分辨度為10μm ，掃描時電壓設(shè)定為 90kV ，電流設(shè)定為 88μA 得到樣本的骨密度（bone mineral density，BMD）值22]。1.4.2ELISA檢測血清骨代謝檢測指標(biāo)各組小鼠眼眶采血 1.2mL ，在 4°C 下以 半徑為7cm 離心 20min ，取上清液。ELISA試劑盒測定

CTX-1、TRACP、PINP、B-ALP水平。

1.4.3ELISA檢測IL-1β、IL-18水平 -80^°C 冰箱取冰凍的右側(cè)股骨，稱重后加人PBS（質(zhì)量：PBS 1mg：7μL： ，混勻研磨， 4°C ，以 、半徑7cm 離心 20min ，取上清液。按照ELISA試劑盒說明書測定IL- ?1β IL-18 水平。

1.4.4Western blot 檢測 NLRP3、Caspase ^-1 、GSD -MD-N蛋白表達取 50mg 小鼠右側(cè)股骨，放置于研缽中進行研磨，加入 350μL 裂解液促使其充分裂解，并加入蛋白酶抑制劑防止蛋白降解，混合均勻，使用組織研磨儀研磨后離心，取上清液于離心管中，BCA法測定蛋白濃度后，配制上樣液。取上清液點樣，經(jīng)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，得到與蛋白結(jié)合完全的PVDF膜，加入對應(yīng)一抗NLRP3（1：50O）、Caspase-1（1：1000）、GSDMD（1：1 000），4 C 孵育過夜，TBST充分洗滌，加入Rabbit二抗（1：8000）室溫孵育 1.5h TBST充分洗滌PVDF膜后置于避光孵育盒中滴加顯影液，經(jīng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光、顯影，使用Im-ageJ軟件對各組蛋白相對含量進行定量分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphpadPrism10軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析及圖像制作。計量資料以 \"表示：若各組都滿足正態(tài)性和方差齊性，則采用單因素方差分析及多重比較；若不滿足正態(tài)性，則采用秩和檢驗進行比較。均以 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組小鼠左側(cè)股骨骨微結(jié)構(gòu)和骨密度比較

與青年組相比，18月齡組和20月齡組小鼠股骨骨小梁明顯斷裂，結(jié)構(gòu)紊亂，連續(xù)中斷，分布稀疏，提示模型制備成功；與20月齡組相比，運動組骨小梁數(shù)量增多，連續(xù)性增加，結(jié)構(gòu)有所改善。Micro-CT檢測結(jié)果顯示，與青年組相比，18月齡組和20月齡組小鼠左側(cè)股骨BMD降低 （Plt;0.05，Plt;0.01） ；與18月齡組相比，20月齡組小鼠左側(cè)股骨BMD降低（ Plt; 0.05）；與20月齡組相比，運動組小鼠左側(cè)股骨BMD升高 （Plt;0.05） 。詳見圖1—2。

2.2各組小鼠血清骨代謝指標(biāo)比較

與青年組相比，18月齡組和20月齡組血清骨吸收標(biāo)志物CTX-1、TRACP均明顯增高（ （Plt;0.01） ！骨形成標(biāo)志物PINP、B-ALP均明顯降低 （Plt;0.01） ，提示模型制備成功；與18月齡組相比，20月齡組CTX-1、TRACP均明顯增高 （Plt;0.01 ），PINP、B-ALP均明顯降低 （Plt;0.01 ）；與20月齡組相比，運動組CTX-1、TRACP均明顯降低（ PINP、B-ALP均明顯增高 （Plt;0.01 ）。詳見圖3。

：ison of serum CTX-1，TRACP，PINP，and B-ALP levels of mice among diffrent groups（ n=4 ）注：與青年組比較， ^??Plt;0.01 ;與18月齡組比較， ⁺⁺Plt;0.01 ；與20月齡組比較， 。

2.3各組小鼠右側(cè)股骨IL-1β、IL-18含量的比較

與青年組相比，18月齡組和20月齡組股骨IL1β?cornerIL-18 含量均明顯增高 （Plt;0.01） ；與18月齡組 相比，20月齡組股骨 IL-1β 、IL-18含量均明顯增高 （Plt;0.01） ;與20月齡組相比，運動組 IL-1β 、IL-18 含量均明顯降低 （Plt;0.01） 。詳見圖4。

2.4各組小鼠右側(cè)股骨NLRP3、Caspase ^-1 、GSD-MD-N蛋白表達水平

與青年組相比，18月齡組和20月齡組股骨NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N蛋白表達水平均增高（Plt;0.05，Plt;0.01） ；與18月齡組相比，20月齡組股骨NLRP3Caspase-1、GSDMD-N蛋白表達水平均增高（Plt;0.05，Plt;0.01） ；與20月齡組相比，運動組NLRP3、Caspase ^-1 、GSDMD-N蛋白表達水平均降低（ Plt; 0.05，Plt;0.01） 。詳見圖5。

3討論

OP是老年人常見的健康問題，其臨床最大危害在于骨質(zhì)疏松性骨折，是老年患者致殘和致死的主要原因之一。目前，雖然SOP的發(fā)病機制尚不完全清楚，但骨穩(wěn)態(tài)失衡是OP的根本原因。骨免疫學(xué)表明，炎癥因子在維持骨穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用[23]。炎癥反應(yīng)引起骨穩(wěn)態(tài)失衡已被確定是SOP重要的病理特征，為當(dāng)前 SOP研究的熱點和治療靶點之一。

研究表明，運動對骨代謝有著非常重要的調(diào)節(jié)作用[24-25]，可以很好的防治SOP，其成本低、無不良反應(yīng)的獨特優(yōu)勢，被越來越多人關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，中低強度運動對維持和提升BMD有重要價值，以中等強度作用尤為顯著，然而，高強度運動對骨質(zhì)疏松小鼠骨量和體質(zhì)量有不利影響[2。本實驗采用18月齡雄性C57小鼠復(fù)制SOP動物模型，選擇中等強度耐力運動對SOP小鼠進行為期8周的干預(yù)。結(jié)果顯示，與青年組相比，18月齡組和20月齡組小鼠的骨小梁明顯斷裂，連續(xù)中斷，分布稀疏，BMD明顯降低，血清骨吸收標(biāo)志物CTX-1、TRACP均顯著增高，而骨形成標(biāo)志物PINP和B-ALP顯著降低，提示該模型符合SOP的表現(xiàn)。與20月齡組相比，運動組小鼠在中等強度耐力運動干預(yù)8周后，骨小梁數(shù)量增多，連續(xù)性增加，股骨BMD明顯升高，血清骨代謝物指標(biāo)也發(fā)生明顯變化，初步證實中等強度耐力運動能夠改善骨小梁結(jié)構(gòu)和提升BMD，可有效對抗衰老引起的骨質(zhì)流失，防治 op

運動治療OP可能與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)[27-28]本研究結(jié)果顯示，與青年組相比，18月齡組和20月齡組小鼠骨組織炎癥因子IL-1β、IL-18水平明顯升高；與20月齡組相比，運動組小鼠在中等強度耐力運動干預(yù)8周后，骨組織炎癥因子IL-1β、IL-18水平明顯降低，進一步證實中等強度耐力運動可以抑制IL-1β、IL-18這些促炎因子的表達，從而抑制SOP的進展。這一結(jié)果表明，運動不僅可以改善BMD，還可能通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，尤其是抑制炎癥反應(yīng)來發(fā)揮其療效。

細胞焦亡是機體重要的天然免疫反應(yīng)，是老年免疫系統(tǒng)持續(xù)低度活化導(dǎo)致慢性炎癥主要分子事件，衰老和雌激素缺乏會引起NLRP3炎癥小體焦亡通路活化，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)分泌過多并刺激炎癥反應(yīng)[2]。已有研究證實，在骨代謝疾病中，作為焦亡的關(guān)鍵參與者，NLRP3炎癥小體可觸發(fā)焦亡經(jīng)典通路，激活Caspase-1，活化的Caspase-1可切割 pro-IL-1β和pro-IL-18，促進其成熟，同時可切割GSD-MD蛋白，形成有親脂性的N-端結(jié)構(gòu)域，在細胞膜上形成孔道，調(diào)節(jié)IL-1β、IL-18等內(nèi)容物的釋放，引起炎癥反應(yīng)，加速破骨細胞活化，引起成骨細胞功能障礙，從而促進骨吸收和骨形成受損，引起骨質(zhì)流失[30-31]。本研究結(jié)果顯示，與青年組相比，20月齡組小鼠骨組織細胞焦亡經(jīng)典通路關(guān)鍵分子NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N蛋白表達水平顯著升高，提示老齡狀態(tài)下，NLRP3/Caspase-1/GSDMD焦亡通路處于活化狀態(tài)，老齡小鼠炎癥水平升高、骨質(zhì)流失可能與NLRP3炎癥小體活化有關(guān)。與20月齡組相比，中等強度耐力運動干預(yù)8周后，運動組小鼠骨組織中NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N蛋白表達水平顯著降低，這表明運動可抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD焦亡通路活化，達到降低骨組織炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)骨代謝、減輕骨質(zhì)流失的作用。

運動抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD焦亡通路活化改善SOP，其病理機制可能與運動的抗炎作用有關(guān)。研究表明，運動有助于降低促炎因子的水平，并促進全身的抗炎狀態(tài)32。研究還發(fā)現(xiàn)，運動可以通過NF-kB信號通路，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，抑制NLRP3炎癥小體的活化[33]。WU等[34發(fā)現(xiàn)，8周的大鼠跑臺運動訓(xùn)練，可以減少骨質(zhì)流失，調(diào)節(jié)骨微結(jié)構(gòu)，并下調(diào)骨髓中 NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和 GSDMD-N 的表達。此外，耐力運動可以增強抗氧化能力，減少線粒體ROS的產(chǎn)生，并抑制NLRP3炎癥小體過度激活，減輕炎癥反應(yīng)[35]

綜上所述，中等強度耐力運動可能通過抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD細胞焦亡信號通路，抑制炎癥和焦亡反應(yīng)，維持骨穩(wěn)態(tài)，減緩骨質(zhì)流失，為運動治療SOP提供一定的參考。本研究后續(xù)將在此基礎(chǔ)上，開展進一步實驗，設(shè)置NLRP3/Caspase-1/GS-DMD信號通路上關(guān)鍵蛋白的抑制劑組或激動劑組，深入展開研究。

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（本文編輯 匡靜之）