丹參多酚酸B通過NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路抑制OGD誘導海馬神經元焦亡的分子機制研究

[關鍵詞]血管性癡呆;丹參多酚酸B;氧糖剝奪;細胞焦亡;NLRP3/Caspase-1/GSDMD信號通路；網絡藥理學[中圖分類號]R285.5 [文獻標志碼]A [文章編號]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.04.008

[Abstract]Objective To explore thepotential molecular mechanisms of salvianolicacidB （Sal B）in treating vascular dementia（VD）throughnetworkpharmacologyandexperimentalverification.MethodsNetworkpharmacologywasusedto identifythepotentialargetsofalBinterventioninVD.Aprotein-proteininteraction（PP）networkwasonstructed，folloed by GO and KEGG pathwayenrichmentanalyses todetermine biologicallrelevant target pathways.Moleculardocking wasperfored toevaluate theinteractionbetweenSalBanditstargets.TheoptimalconcentrationofSalBwasdeterminedvia CCK-8assay thecellorphologywasobservedunderamicroscope，andthereleaserateoflactatedehydrogenase（LDH）inthecellsupeatant wasmeasuredusingamicroplatereader.The levelsof inflammatoryfactorsweremeasuredbyELISA，theproteinexpresionof NLRP3wasexaminedbyimmunofluorescence，andtheproteinexpresion levelsofNOD-likereceptorprotein3（NLRP3）， apoptosis-assiatedspck-likeproteinontainingaD（ASC）cysteinylaspartatespecifcproteinase1（Caspase-1），ndD werecheckedbyWesternblot.ResultsAtotalof37targetsforSalBinterventioninVDwereobtainedbybioinformatics analysis.CoretargetgenessuchasCaspase-1，NLRP3，andTNFR1werescreenedbynetwork pharmacologyandthepathways including theNOD-likereceptors（NLRs）signaling pathwaythatmayinvolvethesetargetgeneswereidentifiedthrough KEGG andGOanalyses.InvitroexperimentswereperformedusingtheclassicNLRP3/Caspase-1/GSDMDpyroptosispathway.The OGD-inducedpyroptosismodelofhippocampalneuronswasestablished，anditwasfoundthatSalBcouldsignificantly enhance the survival rate of HT22 cells after OGD （ Plt;0.05 ，Plt;0.01），alleviate cell damage，reduce LDH release （ Plt;0.05 or Plt;0.01 ） decrease the levels of IL- 1β and IL-18 in OGD-damaged HT22 cells （Plt;0.01），inhibit theactivation of NLRP3 inflammasome，and reduce the protein expression levels of NLRP3， GSDMD-N， cleaved Caspase-1，and ASC（ P lt;0.05，P

[Keywords]vascular dementia;salvianolicacid B; oxygen-glucose deprivation； pyroptosis;NLRP3/Caspase-1/GSDMD sig naling pathway; network pharmacology

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是認知功能下降的常見原因，是第二大常見的癡呆類型，約占全球癡呆病例的 20%^[2] ，世界衛生組織已將VD的防治列為21世紀重點科研項目之一[3-4]。然而，目前VD缺乏特異性治療藥物，臨床多用改善認知功能藥物，但療效欠佳。因此，探究VD發病機制，尋找新的治療策略迫在眉睫。VD發病過程中涉及炎癥反應和神經元損傷，中醫理論認為VD發病與濕熱和血瘀相互搏結為濁毒損傷腦絡，這一病機演變和VD發病焦亡機制不謀而合。已有研究表明，細胞焦亡（pyroptosis）[5作為一種炎癥性的程序性死亡方式與VD發生發展密切相關，特征為NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體的形成半胱氨酸蛋白酶-1（cys-teinyl aspartate specificproteinase 1，Caspase-1） [7]和消皮素D（gasderminD，GSDMD）[8的激活以及促炎細胞因子的釋放。炎癥介質的激活與中醫學“火旺\"所致炎癥反應相似，“火旺\"進一步化毒并耗氣傷陰，氣滯血瘀，日久火熱瘀毒交織進一步加重血管損傷促進VD進展，因此，細胞焦亡可能成為VD潛在的治療靶點，靶向與焦亡相關的信號通路可能有助于減緩疾病進展。

丹參，作為一種傳統活血中藥，在《神農本草經》中列為上品藥材，具有活血化、涼血解毒等功效[0]。現代研究表明，丹參具有抗炎抑菌、抗氧化、免疫調節、改善血液循環等功效[]。丹參多酚酸B（salviano-licacidB）作為丹參的主要活性成分，已被證實可以通過抗炎、抗氧化等多種生物活性在神經系統疾病中具有顯著的保護作用]，然而其對VD和神經元損傷的研究多集中于動物模型，而丹參多酚酸B可能通過涼血解毒減少驗證反應抑制火毒的產生，并通過活血化瘀促進火熱瘀毒排出來減輕VD神經元損傷。MA等3發現，丹參多酚酸B可能通過IGF-1/Akt途徑顯著改善VD模型大鼠的認知缺陷。對丹參多酚酸B在體外氧糖剝奪（oxygen-glucose depriva-tion，OGD）模型中的作用機制探索相對較少，尤其對丹參多酚酸B如何通過細胞焦亡途徑調控OGD誘導的海馬神經元損傷模型中的分子機制尚不明確，而OGD模型可用于模擬VD中腦血管損傷和海馬神經元損傷的病理機制[14]。網絡藥理學作為一種新興且有前景的算法程序，整合了豐富的生物信息學資源，有助于多層次、多維度揭示藥物的多途徑多靶點效應[15]。因此，本研究旨在利用網絡藥理學、分子對接及體外實驗驗證，結合中醫學“火熱瘀毒”理論來研究丹參多酚酸B在VD中的多靶點效應和潛在作用機制，以期為丹參多酚酸B作為VD治療新藥物提供理論依據和實驗支持。

1材料

1.1藥物

丹參多酚酸B（純度 gt;98% ，購自上海源葉生物科技有限公司， 20mg ，批號：B20261），將其粉未溶于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（批號：

D5879，德國Merck公司）中，配制成 的儲存液， -20^°C 避光保存，現配現用。

1.2 細胞與試劑

小鼠海馬神經元HT22細胞（批號：CL-0697）、HT22完全培養基（批號：CM-0697）；DMEM/F12無糖培養基（批號：PM150322） .0.25% 胰蛋白酶（批號：PB180226）磷酸緩沖鹽液（phosphatebuffered salin，PBS）（批號：PB180327）胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（批號：164210）均購自武漢Procell公司；增強型cell counting kit-8（CCK-8）（批號：E-CK-A362）、LDH乳酸脫氫酶活性試劑盒（批號：E-BC-K046-S）、白細胞介素（interleukin，IL）-18ELISA試劑盒（批號：E-EL-M0730）、IL-1βELISA試劑盒（批號：E-MSEL-MO003）均購自武漢Elabscience公司;BCA蛋白濃度檢測試劑盒（批號：23229，美國Thermo公司）;cleaved-Caspase1（批號：3866S，美國 Cell SignalingTechnology公司）;GSDMD-N抗體（批號：ab215203，美國Abcam公司）；NLRP3抗體（批號：20536-1-AP）、Caspase-1抗體（批號：22915-1-AP）ASC抗體（批號：10500-1-AP）、GSDMD（批號：20770-1-AP）HRP-山羊抗兔IgG（批號：SA00001-2）HRP-羊抗小鼠二抗（批號：HRP-67762）均購自武漢Pro-teintech公司。

1.3 儀器

Steri-CycleTMi160 CO₂ 型細胞培養箱、3140CO₂ Incubator型三氣培養箱、PIKOREAL96型熒光酶標儀、SorvallST8R型低溫高速離心機均產自美國ThermoFisher公司;Axiovert200倒置熒光顯微鏡（德國蔡司公司）;GelDocXR + 型凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）;CKX53倒置顯微鏡（日本Olym-pus公司）。

2網絡藥理學分析及分子對接

2.1丹參多酚酸B藥物靶點預測

以“SalvianolicacidB\"為關鍵詞，在PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中，檢索獲得丹參多酚酸B藥物結構，下載丹參多酚酸B的SMILES或3D化學結構式（SDF）（藥物靶點從3個數據源收集 ：SwissTarget （http：//www.swisstargetprediction.ch/）、Genecards （https：//www.genecards.org/） Chem-BL（https：//www.ebi.ac.uk/chembl/）3個數據庫篩選出571個藥物作用靶點，刪除重復項后，UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）將所有靶標轉換為基因名稱

2.2 疾病靶點搜集

以“Vasculardementia\"為關鍵詞，檢索GEO數據庫，根據數據集提供的相關信息，獲得所需芯片GSE122063。采用R語言“limma\"包對GSE122063進行差異分析，獲取VD差異基因。

2.3丹參多酚酸B干預VD交集靶點的獲取

整合\"2.1、2.2\"項數據，使用R語言分析數據兩組之間的共有部分，用VennDiagram包對結果進行可視化，獲得丹參多酚酸B干預VD交集靶點。

2.4丹參多酚酸B干預VD靶點蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡構建

通過STRING（https：//cn.string-db.org/）數據庫對丹參多酚酸B干預VD靶點進行PPI分析，數據導出TSV文件，采用Cytoscape 3.9.1繪制及網絡拓撲學分析。

2.5基因本體（gene ontology，GO）富集與京都基因 與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析

采用R語言clusterProfiler、org.Hs.eg.db包，對丹參多酚酸B干預靶點進行GO、KEGG富集分析，了解丹參多酚酸B干預VD靶點的生物進程（biologi-cal process，BP）、細胞組分（cellular component， CC）、分子功能（molecularfunction，MF）及KEGG通路，分析丹參多酚酸B干預VD潛在作用機制。

2.6 實驗驗證

2.6.1細胞培養將HT22 細胞接種于含 5mL 完全培養基（ 10%FBS+1% 青鏈霉素混合液 +89% DMEM培養基）的 T25 細胞培養瓶中，置于 37% ， 5% CO₂ 細胞培養箱中進行培養，取對數生長期細胞進行后續實驗。

2.6.2氧糖剝奪（oxygen and glucose deprivation，OGD）模型的構建及處理待細胞融合度達到 50% 260% 時，將HT22細胞隨機分為對照組、氧糖剝奪模型組（模型組）丹參多酚酸B組（丹參多酚酸B組），對照組在常氧培養箱培養僅做換液處理，模型組于造模前棄去完全培養基，用PBS沖洗2次，更換為DMEM無糖培養液，丹參多酚酸B組用不同濃度處理 24h 與模型組置于無氧環境（ 94%N₂+5%+1% 0₂ 037 C 三氣培養箱中培養 4h^[16]

2.6.3CCK-8檢測細胞活力取對數生長期HT22細胞種于96孔板中（ 1×10⁴ 個/孔）。細胞貼壁良好后，對照組在常氧培養箱培養僅做換液處理，模型組于造模前棄去完全培養基，用PBS沖洗2次，更換為DMEM無糖培養液，丹參多酚酸B組用不同濃度（0，2.5，5，10，20，40，80μmol?L^-1） 處理 24h 與模型組置于無氧環境 （94%N₂+5%CO₂+1%0₂）37 （204 C 三氣培養箱中培養 4h 隨后，去除培養基，每孔加入 10μL 的CCK-8溶液，繼續孵育 30min ，在 450nm 處測量吸光度（A）確定細胞活力。細胞存活率 （A給藥一ΔA_?3，H）/（A_?3，H-A_?3，H）×100% 0

2.6.4LDH釋放檢測收集細胞到離心管中，離心后棄上清，按說明書比例裂解細胞離心后取上清，將樣品和不同濃度標準品分別加入相應試管輕輕搖晃混勻， 37°C 水浴15min。 450nm 處檢測吸光度（A），計算LDH釋放量。

2.6.5ELISA法檢測細胞培養上清中 IL-1β 和IL-18含量離心后收集各組細胞上清，按ELISA試劑盒說明書操作，將樣品和不同濃度標準品（ 100μL/μ ）加入相應孔室溫孵育 ，洗板后加生物素化抗體室溫孵育后洗滌加入過氧化物酶標記顯影，室溫避光孵育 20min ，加終止液搖勻后置酶標儀檢測 450nm 處吸光度（A），計算IL-1β、IL-18含量。

2.6.6免疫熒光法檢測 NLRP3蛋白表達將細胞爬片放入24孔板，每孔加入 1mL 細胞懸液，密度為 2×10⁴ 個/孔放入培養箱培養 24h 。細胞處理同“2.6.2\"項，造模成功后棄去培養上清，PBS潤洗3次后，用 4% 多聚甲醛固定爬片 10min ，PBS洗3次后用 0.5% TritonX-100通透 10min ，山羊血清封閉30min 加入稀釋后的NLRP3（1：200）一抗濕盒孵育4‰ 過夜。加人稀釋的熒光二抗室溫孵育 ¹h 。滴加DAPI避光孵育 5min ，封片后熒光顯微鏡下采集圖像。

2.6.7Westernblot檢測通路和細胞焦亡相關蛋白表達根據實驗分組處理細胞后，胰酶消化后收集細胞，加入裂解液裂解離心后收集上清提取蛋白。BCA法定量后SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF轉膜， 5% 脫脂奶粉封閉 ^2h TBST洗3次， .4^qC 一抗孵育過夜，按說明書抗體稀釋比例為 NLRP3抗體（1：1 000）、Caspase-1/cleaved-Caspase-1抗體（1：1 500）GSDMD/

GSDMD-N抗體（1：1 500）、ASC 抗體（1：1 500） 、β- actin（1：5000）。次日將膜漂洗3次后二抗（1：2000）孵育 2h ，顯影后凝膠成像儀器檢測，通過Image J進行灰度值分析。

2.7 數據分析

使用GraphPadPrism9.3.0進行統計分析。所有數據均使用單向方差分析檢驗進行分析，然后進行Dunnett多重比較檢驗。數據表示\"x±s”。統計顯著性設定為 Plt;0.05 □

3結果

3.1丹參多酚酸B的潛在靶點

整合3個數據庫結果使用SwissTarge、Geneca-rds、ChemBL數據庫，使用UniProt將所有靶標轉換為基因名稱，去除重復項后共預測丹參多酚酸B潛在靶點571個。

3.2 VD的差異基因（differentially expressed genes， DEGs）

采用limma包進行差異分析，以 Plt;0.05 且llog2（fold change） _1gt;1 為條件篩選差異基因。GSE122063中篩選出1342個差異基因（圖1B），其中541個差異基因在VD樣本中表達下調，801個差異基因在VD樣本中表達上調。

3.3 丹參多酚酸B對VD的作用靶點

采用R語言分析丹參多酚酸B和VD共有靶點，VennDiagram包對結果進行可視化（圖1C），獲得丹參多酚酸B干預靶點共37個。

3.4丹參多酚酸B干預VD靶點網絡藥理學

使用Cytoscape3.9.1構建了共表達PPI網絡，其中包括37個交集靶點和198條邊組成的蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡，度值越大，節點越大，蛋白質相互作用越密切，其中，關系最強的為IL-1β、TNFα-1、IGF1R、EDN1、Caspase-1、NLRP3（圖2A）。GO富集分析得到BP條目704條CC相關條目28條，MF相關條目74條，將前10條進行可視化（圖2B）。丹參多酚酸B干預靶點的生物過程主要涉及參與免疫反應的細胞因子、G蛋白偶聯受體信號通路、對活性氧的反應、蛋白磷酸化、細胞分泌的負向調節等，細胞成分包括血小板 ∝ 顆粒、炎癥小體復合物、肥大細胞顆粒、分泌顆粒管腔、細胞質囊腔等，分子功能包括兒茶酚胺結合、氧結合、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性等。KEGG富集24條通路，由52個靶點130條邊組成，關系最強的為NOD樣受體信號通路等（圖2C）。NOD受體信號通路關鍵功能是通過炎癥小體的組裝，NLRP3受體激活后，與凋亡相關斑點樣蛋白（apop-tosis-associated speck -like protein containing card，ASC）和Caspase-1結合形成多蛋白復合物，激活下游Caspase-1，切割并釋放炎癥因子如IL-1β和IL-18，引發炎癥反應，同時激活GSDMD導致細胞焦亡。因此，結合PPI和富集分析結果，細胞焦亡經典注：A.GSE122063差異分析火山圖;B.GSE122063差異分析熱圖;C.GSE122063VD差異基因靶點和丹參多酚酸 B靶點交集韋恩圖。

A.37個丹參多酚酸B干預靶點蛋白質-蛋白質相互作用網絡;B.GO富集分析;C.KEGG通路分析;D.丹參多酚酸B靶點通路途徑NLRP3/Caspase-1/GSDMD信號通路可能為丹參多酚酸B干預VD海馬神經元的關鍵途徑（圖2D）。

3.5丹參多酚酸B對OGD損傷HT22細胞給藥濃度的篩選

與對照組相比，模型組細胞活力降低 （Plt;0.01） 與模型組比較，不同濃度丹參多酚酸B（0、2.5、5、 處理OGD損傷HT22細胞，細胞活力有明顯恢復，其中 隨藥物濃度增加，HT22細胞存活率提高顯著，差異具有統計學意義 （Plt;0.05，Plt;0.01） ，故以這3個濃度為給藥濃度組。詳見圖3。

3.6丹參多酚酸B對OGD損傷的HT22細胞LDH 釋放量及炎癥因子 IL-1β 和IL-18水平的影響

細胞缺氧后，焦亡發生，膜完整性破壞，LDH和炎癥因子 IL-1β 和IL-18被釋放到細胞外，水平升高。與對照組相比，OGD 模型組HT22 細胞上清LDH、IL-1β 和IL-18水平顯著升高 （Plt;0.01） ;與模型組相比，丹參多酚酸B組 （2.5，5，10μmol?L^-1 上清中LDH、IL-1β和IL-18水平顯著降低 （Plt;0.05，Plt;0.01） 。詳見圖4。

3.7丹參多酚酸B對OGD損傷HT22細胞NLRP3蛋白表達的影響

免疫熒光染色結果顯示，和對照組比較，OGD模型組細胞中NLRP3熒光強度顯著增高 （Plt;0.01） ；與模型組比較，各濃度丹參多酚酸B給藥組細胞NLRP3熒光強度明顯降低 降丹參多酚酸B組低最明顯 （Plt;0.01） 。詳見圖5。

3.8丹參多酚酸B調控NLRP3/Caspase-1/GSDMD 通路介導OGD損傷HT22細胞焦亡

與對照組比較，模型組NLRP3、Caspase-1、GS-DMD、ASC蛋白表達升高 （Plt;0.01） ；與模型組比較，丹參多酚酸B顯著抑制了這些焦亡相關蛋白的表達 （Plt;0.05，Plt;0.01 ）。詳見圖6。

4討論

本研究基于前期課題組研究成果，進一步探討了丹參主要活性成分丹參多酚酸B在VD中的潛在作用機制。此前我們發現，滋腎活血方可通過抑制NLRP3炎癥小體介導的細胞焦亡，保護VD模型大鼠神經血管單元，減少神經元損傷。丹參作為方中核心藥物，其主要成分丹參多酚酸B是否也能通過相同通路發揮作用，尚缺乏機制層面的驗證。VD發病率逐年升高，國內患病率約為 0.96%^[18] ，雖是目前唯一可防治的癡呆類型，但缺乏特異性治療藥物，臨床療效有限[19]。中醫藥以其多靶點、多通路的特點在VD早期防治中展現出獨特優勢[20]。丹參多酚酸B具有清熱涼血、活血化瘀等藥理作用，研究表明其在抗氧化、抗炎及抑制神經元凋亡方面表現出良好潛能[]

本研究通過生物信息學與網絡藥理學方法，篩選出丹參多酚酸B干預VD的關鍵靶點。GSE122063數據分析鑒定出1342個差異基因，與丹參多酚酸B作用靶點交集后獲得37個共同靶點，PPI分析進一步鎖定Caspase-1、NLRP3、TNFR1等核心節點。GO和KEGG富集分析提示，丹參多酚酸B可能通過參與免疫炎癥反應、NOD樣受體信號通路等機制發揮調控作用，尤其NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路在調控細胞焦亡和神經炎癥中發揮關鍵作用[22-23]。

體外實驗證實，丹參多酚酸B濃度為2.5、5、10μmol?L^-1 時，能顯著提高OGD模型細胞存活率。但是否與焦亡途徑相關需要進一步驗證，焦亡與細胞壞死、凋亡途徑不同，主要通過激活NLRP3炎癥小體及其相關蛋白（ASC、Caspase-1）實現[24-25]。激活的NLRP3與ASC、Caspase-1組裝成大分子炎癥復合體，啟動Caspase-1切割并活化，釋放促炎因子如IL-1β、IL-18，并激活GSDMD引起細胞膜孔化，最終導致細胞焦亡[26-28]。Westernblot與免疫熒光檢測顯示，丹參多酚酸B顯著下調NLRP3、ASC、Caspase-1及其下游分子GSDMD的表達，抑制炎癥小體激活，減少IL-1β、IL-18等促炎因子的釋放，減輕細胞焦亡與炎癥反應，從而保護海馬神經元免受損傷。

綜上，丹參多酚酸B可能通過抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路介導的細胞焦亡，減輕OGD誘導的神經元損傷，為VD的防治提供了新的研究方向和理論依據。后續研究將進一步探索其在體內模型中的藥效及代謝特性，為VD的防治和藥物研發提供新視角。

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（本文編輯蘇維）