清心寧神湯對心不藏神不寐模型大鼠的藥效實驗研究

【摘要]目的探討清心寧神湯對于咖啡因聯合4-氯-DL-苯基丙氨酸（PCPA）所致心不藏神不寐模型大鼠的治療作用。方法將36只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、唑吡坦組、清心寧神湯低劑量組、清心寧神湯高劑量組、通路抑制劑組，每組6只。利用咖啡因聯合PCPA 制備心不藏神不寐模型大鼠，正常組予等量生理鹽水腹腔注射，1次/d，連續 10d ;其余組于第1～7天予 60mg/kg 咖啡因水溶液腹腔注射，1次/d，第8～10天予 300mg/kg PCPA皮下注射。造模結束后，唑吡坦組予以 1.05mg/（kg?d） 酒石酸唑吡坦溶液灌胃，清心寧神湯低、高劑量組予 14.7，29.4g/（kg?d） 清心寧神湯灌胃，通路抑制劑組予 0.3mg/（kg?d） 三磷酸酰肌醇蛋白激酶抑制劑腹腔注射，正常組、模型組均以等體積生理鹽水灌胃，各組均連續給藥 14d 干預結束后通過曠場實驗評估大鼠的自發活動和焦慮水平，評價清心寧神湯對于心不藏神不寐大鼠的睡眠和焦慮障礙的改善作用；采用ELISA法檢測大鼠血清中白細胞介素-1β（IL-1β）、C反應蛋白（CRP）的含量;免疫組織化學化染色法檢測大鼠腦組織中IL-Iβ水平;采用HE染色、尼氏染色法、勞克堅牢藍染色法觀察大鼠腦組織的病理形態變化。結果與正常組相比，模型組大鼠，總睡眠時間（TST）、慢波睡眠（SWS）時間、快速眼動睡眠（REM）時間、移動總路程、活動總時間、中央活動時間、爬壁站立時間減少 （Plt;0.01） ，糞便數量、血清中IL-1β及CRP含量、腦組織中IL- 1β 表達增加（ Plt;0.01? ，神經組織見一定程度的結構紊亂，可見炎性細胞浸潤。與模型組比，清心寧神湯低劑量組、清心寧神湯高劑量組大鼠TST、SWS時間、REM時間、移動總路程、活動總時間、中央活動時間、爬壁站立時間均增加 Plt;0.01 ），糞便數量、血清中IL-1β及CRP含量、腦組織中 IL-1β 表達降低 （Plt;0.01 。綜合HE染色、尼氏染色法、勞克堅牢藍染色法結果示清心寧神湯低、高劑量組腦組織神經元排列基本整齊，細胞核大小、形態及位置基本正常，有少量胞核區域深染，可見少量膠質細胞增生，中央尼氏小體溶解較模型組均有所緩解，未見明顯脫髓鞘灶，淺染區域有不同程度的改善。結論 清心寧神湯對于心不藏神不寐大鼠具有良好的治療作用，能有效緩解失眠及焦慮障礙，降低血清中相關炎癥因子的含量，改善失眠造成的腦組織中神經細胞的病理變化。

[關鍵詞]清心寧神湯；心不藏神不寐；炎癥反應；白細胞介素-1β；藥效學實驗；神經組織病理變化；中醫不寐五神分型 [中圖分類號]R285.5 [文獻標志碼]A [文章編號]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.04.002

[Abstract]Objective To explore thetherapeutic efectsof Qingxin Ningshen Decoction （QXNSD）onaratmodelwith insomniaduetoheartnotstoringspirit，inducdbycafenecombinedwith4hloro-DLphenylalanine（CPA）.Methodsityix SDrats were randomlydivided intoa normal group，a model group，a zolpidemgroup，low-dose and high-doseQXNSD groups，and a pathwayinhibitorgroup，withsixratsineachgroup.Theratmodelwithinsomiaduetoheartnotstoringspirit wasestablished usingcafeineandPCPA.Thenomalgroupreceivedanequalvolumeofsalineviaintraperitoneal injectiononcedailyfor10 consecutivedays;theremaininggroupseceivedanitraperitonealinjectionof6mg/kgcaeinesolutionfromdays1to7folloed by a subcutaneous injection of 300mg/kg PCPA from days 8 to 10. After modeling， the zolpidem group was administered 1.05mg/ （204 （kg·d） zolpidemtarrate solutionbygavage;thelow-andhigh-dose QXNSDgroups were given14.7and 29.4g/（kg·d）QXNSDby gavage; and the pathway inhibitor group was given 0.3mg/（kg?d） phosphatidylinositol kinase inhibitor by intraperitoneal injection. Thenormalandthemodel groups weregavagedwithanequalvolumeof normal saline.Allinterventionswereadministeredfor14 consecutivedays.Aftertheintervention，theopenfieldtestwasconductedtoasessthespontaneousactivityandanxietylevelof therats，evaluatingtheameliorativeefectsof QXNSDonsleepandanxietydisordersofratswithinsomnia duetoheartnot storing spirit.ELISA was used to measure the levels of interleukin- 1β （IL-1β） and C-reactive protein （CRP） in the serum of rats; the immunohistochemical staining was applied to assess the IL- 1β levels.HE staining， Nissl staining，and Luxol fast blue staining were employedtoobservepathologicalchangesinbraintisue.ResultsComparedwiththenormal group，themodel groupshowed significantreductionsintotalsleeptime（TSTslow-waveslep（SWS）time，rapideyemovement （REM）sleptime，totalmoveent distance， total activity time，central activity time，and rearing time （ P lt;0.01）.Meanwhile， fecal pellet count， serum IL- ?1β and CRP levels，and IL- ?1β expression in brain tissue were significantly higher （ P lt;0.01）.Neurological tissue exhibited a certain degreeof structuraldisorganizationwithinflammatoycellifltration.Comparedwiththemodelgroup，boththelowandighdoseQXND groupsshowedsignificantincreassinTT，SWStie，EMtie，totalmovementdistance，totalactivitytiecentralctiityi and rearing time（ P lt;0.01），while fecal pellet count，serum IL- ?1β and CRP levels，and IL- ^?1β expression in brain tissue were significantly lower （ Plt;0.01 ）.The results of HE staining，Nisl staining，and Luxol fast blue staining indicated thatin both the lowandhigh-doseQXNSDgroups，neuronalarrangementwaslargelyintactwithbasicallnormalnuclearsize，shape，andposition. Mildhyperchromaticnucleiandlmitedglialcellproliferationwereobseedandentralislbodydisolutionaallviated comparedtothemodelgroup.Nosignificantdemyelinationwasnoted，andlighter-stainedareasshowedvaryingdegresof improvement.ConclusionQXNSDexibitssignficanttherapeuticefctsonratswithinsomniaduetoheartnotstoringspiritItcan effectivelyallviateinsomniaandanxietydisorders，reducethelevelsofrelevantiflammatoryfactorsinesrumandiprove pathological changes in neuronal cels caused by insomnia.

[Keywords]QingxinNingshenDecoction;insomniaduetoheartnotstoringspirit;inflammatoryreaction;interleukin-1β; pharmacodynamics experiment;neuropathological changes;fivespirit clasificationof insomnia in Chinesemedicine

不寐，亦稱“不得臥”“不得眠”，指經常不能獲得正常睡眠為特征的一類病癥↓。隨著社會發展進程的加快，不寐的發病率逐年升高[2]。相關研究表明，不寐是其他精神疾病的高危因素之一，并且對患者日間功能造成不良影響，如警覺性及記憶力降低等3]。因此，不寐的治療十分必要。《中國失眠癥診斷與治療指南》中不寐的治療方案包括心理治療、藥物治療、物理治療和中醫治療等。目前，失眠認知行為療法是國際上多個睡眠障礙診療指南中推薦的一線治療方案。但由于專業人員的缺乏、時空限制、成本高昂，以及患者對該治療方法的了解嚴重不足等諸多因素的影響，現階段仍以藥物治療為主。藥物治療中鎮靜催眠類藥占重要地位，包括苯二氮罩類、非苯二氮罩類等，這類鎮靜催眠藥雖然可以改善總睡眠時間，但長期使用可改變睡眠結構，導致患者耐受性和依賴性增加，并出現停藥反跳、日間殘留效應、認知功能損害等不良反應。中醫治療不寐方式多且毒副作用少[7-9。清心寧神湯是全國名老中醫藥專家傳承工作室指導老師張星平教授治療心不藏神不寐的經驗方和有效方，方中黃連為君藥，黃芩為臣藥，佐以夏枯草、郁金、醋柴胡、白芍、赤芍、炒白術、茯苓、陳皮、法半夏，全方共奏清心寧神之效，臨床療效顯著[10-]。課題組前期通過網絡藥理學及分子對接研究發現，該方能通過作用于多個靶點和多條信號通路，對人體的氧化應激反應產生影響，從而改善谷胱甘肽過氧化物酶（glutathioneperoxidase，GSH-Px ）、超氧化物歧化酶（super oxidedismutase，SOD）及核因子E2 相關因子（nuclear factor erythroid 2-relatedfactor2，NRF2）的表達水平，并調節磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidynositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（proteinkinaseB，Akt）/叉頭狀轉錄因子O（forkhead boxtranscription factor，FOXO）信號通路中關鍵蛋白的表達，達到治療心不藏神而不寐的效果[2，但并未深入研究其藥效學。心不藏神不寐是“中醫不寐五神分型\"中的常見臨床分型之一，以“入寐維艱，甚則徹夜不寐\"為主要特征表現[13，本研究對清心寧神湯治療心不藏神不寐大鼠的相關指標進行觀察和檢測，為課題組后續深人研究提供相關實驗依據。

1材料

1.1 實驗動物與分組

36只 SPF級SD 雄性大鼠，體質量 170～220g 周齡10＼～12周，實驗動物生產許可證號：SCXK（新）2023-0001。于新疆醫科大學SPF級實驗室中進行喂養，實驗室條件設置：室溫（ 25±2 ） C ，相對濕度45%～55% ，光照與黑暗交替各 ^12h ，自由攝取食物及水。本實驗操作過程中嚴格按照實驗動物倫理標準，新疆醫科大學動物倫理委員會批件號：IACUC-20210301-45。

1.2主要藥物與試劑

清心寧神湯飲片由新疆維吾爾自治區中醫醫院提供，藥物組成：黃連 10g 黃芩 10g 白芍 15g 赤芍 _15g 郁金 10g 陳皮 10g 、法半夏 15g 炒白術 10g 、茯苓 10g 炙甘草 10g （湖北道地藥材科技有限公司，批號：240301、240401、240101、240401、 夏枯草 15g 醋柴胡 10g （亳州市惠康堂中藥科技有限公司，批號：2310032、2311030）。所有藥材經醫院藥學部鑒定為正品，所有飲片煎煮濃縮至含藥量2.8g/mL_?

4-氯-DL-苯基丙氨酸（parachlorophenylala-nine，PCPA）（上海源葉生物科技有限公司，批號：

A12IS208585）；咖啡因（成都德斯特生物技術有限公司，批號：DSTDK004902）；酒石酸唑吡坦片（賽諾菲杭州制藥有限公司，規格： 5mg/ 片，批號：JT1662）;三磷酸酰肌醇蛋白激酶抑制劑（LY294002）（奧默生物技術上海有限公司，批號：M1925-08）;PVDF膜（上海雅酶生物醫藥科技有限公司，批號：02741070）；三色預染蛋白Marker（和元李記上海生物技術有限公司，批號：AP13L062）;大鼠白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）C反應蛋白（C-reactiveprotein，CRP）ELISA檢測試劑盒（上海優選生物科技有限公司，批號：YX-E20958、YX-031816R）;IL-1β 抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體（glyceraldehyde ^-3 -phosphatedehydrogenase，GAPDH）二抗山羊抗兔 IgC（H+L） HRP偶聯抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號：AF5103、AF7021、S0001）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：PC0020、P1200-2）；無水乙醇、二甲苯、冰醋酸（國藥集團化學試劑有限公司，批號：100092683、10023418、10000218）；髓鞘染液套裝、伊紅染液、環保型脫蠟液、通用型組織固定液、尼氏染液（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號：G1030、G1002、G1128、G1101、G1036）。

1.3 主要儀器

脫水機（意大利迪佩斯公司，型號：Donatello）;包埋機（武漢俊杰電子有限公司，型號：JB-P5）；病理切片機（上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2016）；全自動樣品快速研磨儀（上海凈信實業發展有限公司，型號：JXFSTPRP-24）；BIORAD蛋白電泳儀（美國BIORAD公司，型號：041BR319633）；蔡司全自動數字玻片掃描機（德國卡爾蔡司公司，型號：Ax-ioscan7）；全波長酶標儀（賽默飛世爾中國科技公司，型號：Multiskan GO）。

2方法

2.1 模型復制、分組及給藥

將36只大鼠根據隨機數字表法分為正常組、模型組、唑吡坦組、清心寧神湯低劑量組、清心寧神湯高劑量組、通路抑制劑組，每組6只，適應性喂養 3d 經網絡藥理學及分子對接研究發現該方能夠通過調節PI3K/Akt/FOXO信號通路中關鍵蛋白的表達，達到治療心不藏神不寐的作用，該信號通路的阻斷劑為LY294002，作為抑制劑組進行藥效對比。參考本課題組前期研究制備心不藏神不寐大鼠模型[4-15]，正常組予等量生理鹽水腹腔注射，1次/d，連續 10d ：其余組于第1＼～7天予 60mg/kg 咖啡因水溶液腹腔注射，1次/d，第8＼～10天予 300mg/kg PCPA皮下注射。造模結束后，唑吡坦組予 1.05mg/（kg?d） 酒石酸唑吡坦溶液灌胄，清心寧神湯低劑量組予14.7g/（kg?d） 清心寧神湯灌胃，清心寧神湯高劑量組予 29.4g/（kg?d） 清心寧神湯灌胄，大鼠給藥量按照人的6.3倍換算，其中清心寧神湯高劑量組的給藥量是低劑量的2倍量[1，抑制劑組給予LY294002行腹腔注射 ，正常組與模型組均以同等體積生理鹽水灌胃，各組均連續給藥 14d

2.2腦電、肌電睡眠檢測大鼠睡眠情況

大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（ 35mg/kg′ 進行麻醉，并使用大鼠腦立體定位儀來安裝腦電和肌電睡眠監測的電極。首先剃除大鼠頭頂 1.3cm×1.3 cm區域的毛發以暴露皮膚，并在顱頂正中線上切開約2cm ，鈍性分離皮下組織以露出顱骨，利用動物微型顱骨鉆在特定的交點處鉆4個孔，然后將4枚腦電圖螺釘旋人上述孔中，將腦電電極的引線與顱骨上的螺釘焊接，并剪掉多余的引線。肌電電極的引線則直接插入大鼠頸部后側的肌肉中，用牙科水泥將頭盔固定在顱骨表面，最后縫合切口。利用Sire-nia^⊕ SleepPro（v1.8.2）軟件對大鼠進行 24h 的腦電和肌電監測。大鼠腦電、肌電圖出現與心不藏神不寐患者多導睡眠圖相似的特征：總睡眠時間（to-talsleep.time，TST）減少、睡眠潛伏期明顯延長、慢波睡眠（slow wave sleep，SWS）時間明顯減少、快速眼動睡眠（rapid eye movement sleep，REM）時間減少，表明心不藏神不寐大鼠模型構建成功，此與心不藏神主要癥狀“人寐維艱，甚則徹夜不寐\"相吻合[19]TST、SWS時間越短，REM時間越長則表明入睡時間延長，總睡眠時間縮短[19]。

2.3曠場實驗檢測大鼠焦慮程度

實驗前讓大鼠適應實驗環境，隨后將動物從一側放入曠場箱的中心并讓動物自由探索 5min ，其間記錄其行為。最后使用大鼠開放活動實驗系統（版本：JLBehw-coFG-1）分析動物的活動軌跡和行為參數。注意事項：實驗過程中保持環境安靜，避免干擾；每次實驗后用 70% 乙醇清潔箱體，避免氣味殘留影響后續實驗；確保每次實驗的條件一致，如實驗時間、動物放置位置等。測試指標：移動總距離、活動總時間、中心活動時間、垂直活動時間和糞便數量等，其中移動總距離、活動總時間、中心活動時間垂直活動時間越長，糞便越少提示大鼠焦慮程度越低，反之提示代表其越焦慮[20]。

2.4ELISA 法檢測血清 IL- ?1β 、CRP含量

取出板條，放置室溫中，在規定好的標孔中加入梯度標品 50μL ，將 10μL 樣本以及 40μL 樣本稀釋液加入規定的樣本孔中，各孔中加入 100μL HRP，恒溫箱溫育 60min ，重復洗板5次，底物A和底物B各取 50μL 加入孔中，避光恒溫箱孵育 15min ，終止反應為加終止液 50μL ，在 15min 內于 450nm 波長處測OD值。對血清樣本中的 IL-1β 及CRP含量進行計算。

2.5免疫組織化學染色法檢測大鼠腦組織中IL-1β 水平

烤片條件： 64‰ 脫蠟條件：二甲苯I、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ各 30min ，無水乙醇、 85% 乙醇 .75% 乙醇各 15min_? ?？乖迯蜅l件：微波爐高火 7.5min 。內源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育 10min_? 一抗配比：IL-1β（1：200），4 C 孵育過夜，滴加酶標山羊抗兔 IgG 聚合物，室溫孵育 30min ，DAB 顯色 1min 蘇木素復染 10s ，鹽酸乙醇分化1s，自來水返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。采集圖像，ImageJ軟件分析結果。

2.6HE染色觀察腦組織病理變化

石蠟切片依次放入二甲苯I、二甲苯Ⅱ中各 15min 無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ中各 5min 95% 乙醇、 85% 乙醇 .70% 乙醇中各脫蠟 5min ，自來水沖洗 2min 蘇木素染液 5min，1% 鹽酸乙醇分化 2s，1% 氨水溶液返藍2s，自來水沖洗 2min ，切片依次放入 70% 乙醇 85% 乙醇 95% 乙醇中脫水，放入伊紅染液 2min 切片依次放入無水乙醇I、無水乙醇Ⅱ、無水乙醇Ⅲ中各 5min ，切片依次放入二甲苯I、二甲苯Ⅱ中各透明 5min ，中性樹膠封片。

2.7 尼氏染色法觀察腦組織中尼氏小體的病理變化

石蠟切片脫蠟至水，依次將切片放入環保型脫蠟液I、環保型脫蠟液Ⅱ各 20min ，無水乙醇I、無水乙醇Ⅱ各 5min 新 75% 乙醇 5min ，自來水洗。組織切片入尼氏染液 2～5min ，水洗， 0.1% 冰醋酸稍分化，自來水洗終止反應，顯微鏡下控制分化程度，自來水洗后，將切片置于烤箱烤干。切片放入干凈的二甲苯中透明 10min ，中性樹膠封片。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。神經元內的尼氏小體呈深藍色顆粒，細胞核呈淡藍色，背景淡藍色。

2.8勞克堅牢藍染色觀察腦組織中神經髓鞘的病理變化

石蠟切片經二甲苯及梯度乙醇復水，依次將切片放入環保型脫蠟液I、環保型脫蠟液Ⅱ各 20min ，無水乙醇I、無水乙醇Ⅱ各 5min 75% 乙醇 5min 自來水洗。髓鞘染液A置于 60^°C 烤箱預熱 30min 切片入髓鞘染液A加膜加蓋浸染 ¹h ，取出切片快速自來水洗。切片浸入髓鞘染液B中稍分化2s（趁熱），直接浸入髓鞘染液C分化15s，水洗終止分化，鏡檢，反復分化水洗和鏡檢，至髓鞘呈藍色背景近無色即可。切片入 65°C 烤箱烤干（約 30min 至玻片干燥）拿出，冷卻后進入 95% 乙醇后復染伊紅。切片依次放入無水乙醇I、無水乙醇Ⅱ、無水乙醇Ⅲ中各 5min ，切片依次放入二甲苯I、二甲苯Ⅱ中各5min 透明，中性樹膠封片。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

2.9 統計學分析

運用SPSS26.0統計軟件進行統計分析，分析數據以‘ ”表示，若結果滿足正態性和方差齊性，多組間比較用單因素方差分析：組間兩兩比較，若方差齊則采用最小顯著性差異法，若方差不齊采用Dunnett'sT3檢驗，以 Plt;0.05 表示差異有統計學意義。

3結果

3.1各組大鼠腦電、肌電睡眠檢測情況

與正常組相比，模型組TST、SWS時間、REM時間顯著減少 （Plt;0.01 ）;與模型組相比，唑吡坦組、通路抑制劑組及清心寧神湯低、高劑量組TST、SWS時間、REM時間顯著增加 （Plt;0.01） ，提示心不藏神不寐大鼠模型構建成功。與唑吡坦組相比，清心寧神湯低劑量組TST、REM時間明顯減少 （Plt;0.05） ，清心寧神湯高劑量組TST、SWS時間、REM時間明顯增加（Plt;0.01） ，通路抑制劑組TST、SWS時間、REM時間明顯減少 （Plt;0.01） ；與清心寧神湯低劑量組相比，清心寧神湯高劑量組TST、SWS時間、REM時間顯著增加 （Plt;0.01） ，通路抑制劑組TST、SWS時間、REM時間減少 （Plt;0.05，Plt;0.01） ；與清心寧神湯高劑量組相比，通路抑制劑組TST、SWS時間、REM時間顯著減少 （Plt;0.01） 。詳見表1。

3.2各組大鼠曠場實驗情況

與正常組相比，模型組大鼠移動總路程、活動總時間、中央活動時間、爬壁站立時間均顯著減少（ Plt; 0.01），糞便數量顯著增多（ （Plt;0.01） ；與模型組相比，唑吡坦組、通路抑制劑組及清心寧神湯低、高劑量組大鼠移動總路程、活動總時間、中央活動時間、爬壁站立時間增加 （Plt;0.05，Plt;0.01） ，糞便數量顯著減少（Plt;0.01） 。與唑吡坦組、清心寧神湯低劑量組相比，清心寧神湯高劑量組大鼠移動總路程、活動總時間、中央活動時間、爬壁站立時間增加 （Plt;0.05，Plt;0.01） ，糞便數量減少 （Plt;0.05，Plt;0.01） ;通路抑制劑組大鼠移動總路程、活動總時間、中央活動時間、爬壁站立時間減少 （Plt;0.05，Plt;0.01） ，糞便數量顯著增多（ Plt; 0.01）。與清心寧神湯高劑量組相比，通路抑制劑組移動總路程、活動總時間、中央活動時間、爬壁站立時間顯著減少 （Plt;0.01） ，糞便數量顯著增多 （Plt;0.01） 。詳見圖1、表2。

3.3 各組大鼠血清 IL-1β 及CRP的水平

與正常組相比，模型組大鼠血清中 IL-1β 及CRP

水平顯著升高 （Plt;0.01） ；與模型組相比，唑吡坦組、通路抑制劑組及清心寧神湯低、高劑量組大鼠血清中IL-1β及CRP水平顯著降低 （Plt;0.01） ；與唑吡坦組、清心寧神湯低劑量組相比，清心寧神湯高劑量組大鼠血清中 IL-1β 及CRP水平降低 （Plt;0.05，Plt;0.01） ，通路抑制劑組大鼠血清中IL- 1β 及CRP水平顯著升高 （Plt;0.01） ；與清心寧神湯高劑量組相比，通路抑制劑組大鼠血清中 IL-1β 及CRP水平顯著升高（ Plt; 0.01）。詳見表3。

3.4各組大鼠腦組織 IL-1β 表達情況

與正常組相比，模型組大鼠腦組織中 IL-1β 表達水平顯著升高（ Plt;0.01） ；與模型組相比，唑吡坦

組、通路抑制劑組及清心寧神湯低、高劑量組大鼠腦組織中 IL-1β 表達水平顯著降低（ Plt;0.01? ；與唑吡坦組、清心寧神湯低劑量組相比，清心寧神湯高劑量組大鼠腦組織中 IL-1β 表達水平顯著降低 （Plt;0.01） L通路抑制劑組大鼠腦組織中 IL-1β 表達水平顯著升高（ Plt;0.01 ）;與清心寧神湯高劑量組相比，通路抑制劑組腦組織中 IL-1β 表達水平顯著升高 （Plt;0.01） 。詳見圖2、表4。

3.5 各組大鼠腦組織HE染色病理變化情況

正常組與清心寧神湯高劑量組神經元排列整齊，形態清晰、完整，細胞核呈圓形或橢圓形，大小正常且位置居中，染色質分布均勻，少突膠質細胞、星形膠質細胞、小膠質細胞未見明顯增生、腫脹、壞死等表現，中央尼氏小體數量及形態正常，細胞間質內未見炎癥細胞浸潤。模型組及通路抑制劑組顯示神經元數量減少，排列松散，細胞胞體腫脹、變形，形態不規則，細胞核位置發生偏移，細胞核區域深染，細胞核腫脹、碎裂，可見小膠質細胞腫脹、增生，中央尼氏小體溶解，細胞間質可見炎癥細胞浸潤，以淋巴細胞為主。唑吡坦組及清心寧神湯低劑量組神經元數量、組織形態及結構損傷較模型組減輕，未見空泡樣變性，神經元排列基本整齊，細胞核大小、形態及位置基本正常，有少量細胞核區域深染，可見少量膠質細胞增生，中央尼氏小體溶解較模型組有所緩解，細胞間質可見少量炎癥細胞浸潤。詳見圖3。

3.6各組大鼠腦組織中尼氏染色尼氏小體病理變化情況

正常組與清心寧神湯高劑量組大腦皮質和海馬區域中尼氏小體數量豐富，細胞排列規則且緊密，結構清晰且完整，尼氏小體染色均勻，呈深藍色。模型組及通路抑制劑組大腦皮質和海馬區域中尼氏小體數量明顯減少，細胞排列紊亂且間隙增寬，結構模糊且不完整，尼氏小體染色變淺且不均勻，部分出現空泡變性。唑吡坦組及清心寧神湯低劑量組大腦皮質和海馬區域中尼氏小體數量較模型組均增加，細胞排列較為規則，結構較為完整，尼氏小體染色及形態較模型組均改善。詳見圖4。

3.7各組大鼠腦組織中勞克堅牢藍染色神經髓鞘 病理變化情況

正常組染色未見脫髓鞘灶，染色均勻，髓鞘呈亮藍色，分界清晰，層次清楚，髓鞘及組織結構易于觀察，神經元及尼氏小體數量豐富，排列整齊。模型組染色未見明顯脫髓鞘灶，但出現一定面積的淺染區域，染色不均勻，炎性細胞浸潤，藍紫色細胞核與牢固藍的亮藍色界限不明顯，髓鞘與神經纖維和髓鞘排列紊亂。唑吡坦組和清心寧神湯低、高劑量組染色未見明顯脫髓鞘灶，淺染區域有不同程度的改善，染色稍均勻，神經元及尼氏小體數量較模型組增加，排列較整齊。詳見圖5。

4討論

持續睡眠障礙是發生精神障礙和物質使用障礙的危險因素[21]。本團隊根據大量臨床不寐的癥狀表現特征，提出“中醫不寐五神分型診斷法\"22]。該法是依據單一癥狀從而確立不寐五臟病位診斷的辨證分型方法，以“入寐維艱，甚則徹夜不寐”為主要表現的心不藏神不寐是臨床最常見的不寐類型之一。清心寧神湯是全國名老中醫藥專家傳承工作室指導老師張星平教授治療本病的有效方，本研究主要探討清心寧神湯對于心不藏神不寐模型大鼠的治療作用。

《本草綱目·草部第十三卷》曰：“五臟六腑皆有火，平則治，動則病，故有君火、相火之說，其實一氣而已。黃連入手少陰心經，為治火之主藥。\"清心寧神湯中，黃連為君，其味苦、性寒，無毒，可清熱燥濕、瀉火解毒。臣以黃芩，與黃連配伍，清心安神，黃芩素是黃芩的有效成分，現代藥理學研究表明，其能改善小鼠自身免疫性腦脊髓炎，糾正小膠質細胞失衡及調節炎癥因子，具有神經保護作用2。佐以夏枯草、郁金二藥散氣滯日久之郁熱；醋柴胡、白芍、赤芍、炒白術、茯苓5藥配伍，取“逍遙散\"之意，《靈樞·平人絕谷》言：“神者，水谷之精氣也。\"芍藥與醋柴胡同用，補肝體而助肝用，養血柔肝，5藥合用，使肝郁得疏，血虛得養，脾弱得復，氣血兼顧，體用并調，肝脾同治；同時佐以陳皮配伍法半夏能行氣和胃、清熱化痰，對于不寐患者久病形成的氣滯水停，煉濕成痰具有良好效果[24]

通過曠場實驗結果分析可知，清心寧神湯給藥組大鼠總路程增加，活動總時間、中央活動時間、爬壁站立時間增加，糞便數量減少。說明清心寧神湯能夠改善不寐大鼠的睡眠情況，緩解大鼠的焦慮、抑郁行為，改善不寐帶來的不良影響。課題組前期研究表明[25]，不寐會導致晝夜節律紊亂，導致炎癥通路的激活，炎癥因子在體內的表達升高。PI3K/Akt/FOXO為炎癥通路之一，參與機體的炎癥反應，IL-1β為該通路的下游蛋白，且IL-1β及CRP均屬于炎癥因子， IL-1β 是IL-1的一種亞型，能夠影響神經元的活性和突觸傳遞，參與睡眠調節和炎癥反應[2。因此，機體IL-1β含量升高，可能引起神經炎癥反應，干擾正常睡眠，導致睡眠障礙。CRP對于體內炎癥反應的嚴重程度具有重要的指導意義[2。本研究通過分析ELISA實驗結果可知，模型組大鼠血清中IL-1β及CRP水平顯著升高，與模型組相比，清心寧神湯低、高劑量組大鼠血清中IL-1β及CRP水平顯著降低，Westernblot法、免疫組織化學染色實驗結果同樣證明清心寧神湯能夠有效降低體內炎癥因子IL-1β的含量。

HE染色、尼氏染色法、勞克堅牢藍染色法均能反映神經組織的病理變化。神經元是神經系統的基本結構單位，神經結構的損傷，會導致神經營養物質的合成減少。尼氏體是神經元內蛋白質合成的場所，其數量的多少、體積的大小及分布情況反映神經元合成蛋白的能力及是否受損[28。髓鞘結構的完整性是保證有髓神經纖維結構和功能完整性的重要生理基礎，所以髓鞘的結構改變是神經纖維病理改變的重要標志[29]。本次實驗結果證明，失眠會導致大鼠腦組織神經元數量減少，排列松散，細胞胞體腫脹、變形，形態不規則，細胞核位置發生偏移，細胞核區域深染，部分細胞核腫脹、碎裂，小膠質細胞腫脹、增生，中央尼氏小體數量減少甚至溶解，細胞間質可見炎癥細胞浸潤，而清心寧神湯可以有效改善失眠大鼠腦組織中神經元數量、組織形態及結構，緩解小膠質細胞異常腫脹及增生，有效避免中央尼氏小體溶解，減少細胞間質炎癥細胞浸潤。

綜上，清心寧神湯對于心不藏神不寐大鼠具有良好的治療效果，該方可能是通過降低不寐大鼠血清中相關炎癥因子的含量，改善腦組織中神經細胞的病理變化和炎癥浸潤，恢復神經細胞的功能，從而達到緩解失眠及焦慮障礙的作用。

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（本文編輯 田夢妍）