基于TGF-β1/Smad信號通路探討天芙止眩方改善自發(fā)性高血壓大鼠腎纖維化的作用機(jī)制

[摘要]目的基于轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）/Smad信號通路探討天芙止眩方對自發(fā)性高血壓（SHR）大鼠腎纖維化和炎癥的改善作用。方法將40只SHR大鼠隨機(jī)分為5組：模型組、厄貝沙坦組（ 13.5mg/kg） 及天芙止眩方高 （5.94g/kg） 、中 （2.97g/kg） 、低L 1.49g/kg） 劑量組，每組8只；另取8只WKY大鼠作為正常組。模型組和正常組給予等體積蒸餾水。各組均連續(xù)灌胃給藥11周，每天1次。分別在第1、3、5、7、9、11周測量大鼠尾動脈收縮壓及舒張壓。實(shí)驗結(jié)束后，生化分析儀檢測血清中尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）含量;ELISA法檢測血清中血管緊張素I（AngII）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子- σ?α（TNF-α） 的含量；HE、Masson及天狼星紅染色檢測腎組織病理變化和膠原纖維沉積；免疫組織化學(xué)染色法檢測腎組織I型膠原（ColagenI）、I型膠原（CllagenI）、TGF-β1、CD68蛋白表達(dá);Westem blot法檢測腎組織CD68、TGF-β1蛋白表達(dá)及磷酸化細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子 2/3（p-Smad2/3 和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子2/3（Smad2/3）的蛋白比值;RT-qPCR檢測 AngII 、TGF-β1、CD68的mRNA表達(dá)。結(jié)果與正常組比較，模型組SHR大鼠第1、3、5、7、9、11周收縮壓和舒張壓均升高 （Plt;0.001? ；血清BUN、Scr、AngⅡI、IL- ?1β 、TNF- σ?α?α?α?α 水平升高 （Plt;0.01，Plt;0.001） ；腎組織出現(xiàn)病理損傷和炎性浸潤，并形成明顯的纖維化，CollagenI和CollagenI的蛋白表達(dá)升高（ Plt;0.001 ），CD68、TGF- -β1_?p -Smad2/3和Smad2/3的蛋白比值及AngII、TGF-β1、CD68的mRNA水平均增高 （Plt;0.01，Plt;0.001 ）。與模型組比較，厄貝沙坦組及天芙止眩方高、中劑量組第3、5、7、9、11周收縮壓及舒張壓均降低（ Plt;0.01 ），天芙止眩方低劑量組第5、7、9、11周收縮壓及舒張壓下降 （Plt;0.05，Plt; 0.01）;血清 BUN，Scr，AngII 、IL-1β、TNF- 水平降低 （Plt;0.05，Plt;0.01） ；腎組織病理損傷明顯改善，炎癥浸潤及纖維化減少，CollagenI、CollagenI的蛋白表達(dá)降低（ Plt;0.05 或 Plt;0.01 ），CD68、TGF-β1、p-Smad2/3和 Smad2/3的蛋白比值及AngII、TGF-β1、CD68的mRNA水平均降低 （Plt;0.05，Plt;0.01） 。結(jié)論天芙止眩方治療能有效降低SHR大鼠血壓并改善高血壓引起的腎纖維化，其機(jī)制可能與減少組織炎癥，抑制TGF- ?β1/Smad 信號通路有關(guān)。

本文引用：.基于TGF-β1/Smad信號通路探討天芙止眩方改善自發(fā)性高血壓大鼠腎纖維化的作用機(jī)制[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2025，45（4）：608-616

[關(guān)鍵詞]高血壓；天芙止眩方；腎纖維化；巨噬細(xì)胞；TGF-β1/Smad信號通路 [中圖分類號]R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.04.004

[Abstract]ObjectiveToexplorethealleviativeefectsof Tianfu ZhixuanFormula （TFZXF）onrenalfibrosisandinflammation inspontaneously hypertensive rats （SHR） based on the transforming growth factor -β1 （TGF-β1）/Smadsignaling pathway.

Methods Forty SHR rats were randomly divided into five groups： a model group，an irbesartan group （13.5mg/kg） ，and high- （5.94 g/ kg）， medium- （2.97g/kg） ，and low- （1.49 g/kg） dose TFZXF groups，with eight rats in each group. Another eight WKY rats were used asthe normal group.The model groupsandthenormal group weregivenanequalvolumeof distiledwater.All groupswere administeredbygavagefor11consecutiveweksonceaday.Thesystolicanddiastolicbloodpressuresoftherats’tailterywere measuredatweeks1，3，5，7，9，and11.Aftertheexperiment，thelevelsofbloodureanitrogen（BUN）andcreatinine（Scr） inthe serumwere measured by the biochemical analyzer.The levels of angiotensinII（ AngI ），interleukin- ?1β （IL-1β），and tumor necrosis factor- α （TNF- α ）intheserum were measured byELISA.The pathological changes andcollagen fiber deposition inrenal tissue weremeasuredbyHE，MassonndSiusedsainngTexpressionsof typeIcollagen （CollagenI）typelcollagen（ollage II），TGF-β1，ndCD68protesinnal issuereeasuedbymmunistohemicalstainngeproteinexpressisofD68 andTGF-β1inrenal tisse，aswellasthe proteinratiosof phosphorylatedcelularsignal transduction molecules Smad2/3（pSmad2/3）tocelllarsignaltransductionmolecules2/3（Smad2/3），were measuredbyWestem blotAndthemRNAexpresionsof ，TGF-β1，and CD68 were measured byRT-qPCR.Results Compared with thecontrol group，the SHRratsin themodel group showed increased systolic and diastolic blood pressure at weeks 1，3， 5，7， 9，and 11（ P lt;0.001）. The levels of serum BUN， Scr， Angll ， IL-1β， and TNF- α_α∝α_α were higher （ Pe40.01 ， Plt;0.001 ）. The renal tisue in the model group exhibited pathological damage， inflammatoryinfiltration，andsignificantfibrosis.TheproteinexpressionsofCollgenIandCollagenIincreased（ P lt;0.001）. The proteinexpresionlevelsof CD68andTGF-β1，the proteinratioofp-Smad2/3and Smad/3，as wellasthemRNA levelsofAgI， TGF-β1，and CD68，wereall higher（ P lt;0.01， P ，TGF-β1，and CD68，were all lower （ P lt;0.05， P lt;0.01）.Conclusion Treatment with TFZXF can efectivelyreducebloodpressureandallviatehypertension-inducedrenalfibrosisinSHRrats.Themechanismmayberelatedto reducing tissue inflammation and inhibiting the TGF- ?β 1/Smad signaling pathway.

[Keywords]hypertension; Tianfu Zhixuan Formula;renal fibrosis; macrophages;TGF-β1/Smad signaling pathway

高血壓是心血管疾病潛在的危險因素，長期血壓升高會對血管、心臟、腎臟等靶器官造成損傷腎臟作為人體水鈉調(diào)節(jié)的主要器官，對維持機(jī)體正常的血壓起著重要的作用[2-3]。研究表明，高血壓與慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）密切相關(guān)，長期高血壓可引起腎小球毛細(xì)血管損傷和腎小管間質(zhì)炎癥，進(jìn)而形成腎纖維化，最終導(dǎo)致腎衰竭4]。腎纖維化的形成涉及炎癥細(xì)胞浸潤、促纖維化因子的分泌、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）聚集與降解失衡等多個環(huán)節(jié)，其中以ECM過度生成和沉積為主要特征5]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforminggrowth factor- _?β1 ，TGF- _?β1 ）/Smad信號調(diào)節(jié)ECM成分的生成，在CKD的腎小球和腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)病中起關(guān)鍵作用，以TGF- _?β1 為靶標(biāo)阻止CKD纖維化已受到廣泛關(guān)注[8。近期研究提示，減少腎纖維化、預(yù)防腎損傷可能是治療高血壓的有效策略，這為抗高血壓新藥的研發(fā)提供了新的思路[9-10]。

半夏白術(shù)天麻湯是源于《醫(yī)學(xué)心悟·眩暈》中的經(jīng)典方，治療痰濕壅盛型高血壓療效確切[II-I2]，天芙正眩方以半夏白術(shù)天麻湯為基礎(chǔ)化裁，由天麻、鉤藤、白術(shù)等中藥組方而成，為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院王宇紅研究員團(tuán)隊多年治療原發(fā)性高血壓的臨床經(jīng)驗方，具有平肝息風(fēng)、利濕化痰之功效。本研究以自發(fā)性高血壓（spontaneouslyhypertensive rats，SHR）大鼠為模型，探討天芙止眩方的降壓和腎臟保護(hù)作用，以期為其臨床應(yīng)用提供新的科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗動物

雄性SHR大鼠40只，SPF級，7周齡，體質(zhì)量200～220g ；雄性WKY大鼠8只，SPF級，7周齡，體質(zhì)量 200～220g_o 大鼠均購于北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司，實(shí)驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2024-0001 。所有動物均飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物中心，溫度（ 22±2 ） C ，濕度 50%±5% ，自由攝食飲水，晝夜循環(huán) 12h 。實(shí)驗動物使用許可證號：

SYXK（湘）2019-0009，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗。本研究已通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物中心倫理委員會審查，倫理批準(zhǔn)號：LLBH-202309120004。

1.2主要藥物及試劑

天芙止眩方由天麻 _15g 鉤藤 10g 、白術(shù) 10g 、法半夏 _9g 茯苓 6g 、陳皮 6g 甘草 3g 組成，原藥材由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，經(jīng)王宇紅研究員鑒定為正品，均符合2020年版《中華人民共和國藥典》3的質(zhì)量要求。全方蒸餾水提取，提取2次，第一次加10倍量水、煎煮 1.5h ，第二次加8倍量水、煎煮 ¹h ;合并兩次提取液，最終濃縮至0.594g/mL 高劑量藥液（以生藥量計），用蒸餾水稀釋成中、低劑量 4。厄貝沙坦膠囊（珠海潤都制藥股份有限公司，批號：3062204002，規(guī)格： 0.15g/ 粒）。

Masson試劑盒（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號：CR2108024）；改良天狼星紅染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：G1472）;TGF- 、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子2/3（mothersagainst decapentaplegic homolog2/3，Smad2/3）、p-Smad2/3、CD68（美國Affinity公司，批號：AF1027、AF3367、AF6367、DF7518）;I型膠原（Collagen typeI，CollagenI）、I型膠原（Col-lagen ttype III，Collagen II）（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：14695-1-AP、22734-1-AP）；大鼠腫瘤壞死因子- σ?α?α?α?α （tumornecrosis factor- ??αα ，TNF- ??αα?αα?α?α?βαβ?α ）ELISA試劑盒、大鼠白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL- 1β ）ELISA試劑盒、大鼠血管緊張素ⅡI（angiotensin，AngII）ELISA試劑盒（江萊生物公司，批號：JL13202、JL20884、JL11637）;兔二步法檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：PV-9001）；磷酸化蛋白酶抑制劑100X（賽文創(chuàng)新生物科技有限公司，批號：SW107-02）;RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定液（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：C5029、C05-02001）。

1.3 主要儀器

無創(chuàng)血壓檢測儀（北京軟隆科技有限責(zé)任公司，型號：BP2010AUL）；自動脫水機(jī)、自動包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)、全自動HE染色封片機(jī)、普通光學(xué)顯微鏡（德國Leica公司，型號：HistoCore PEARLHistoCoce Ar-cadia H、RM2235、HistoCoce SPECTRA ST、DM500）;數(shù)字玻片掃描儀（匈牙利3DHISTECH公司，型號：PannoramicMIDI）；全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科技公司，型號：Chemray80O）；蛋白電泳儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司，型號：Mini-TransBlot、ChemiDocXRS）;PCR梯度基因擴(kuò)增儀（美國SCILOGEX公司，型號：SCI1000-G）。

1.4 動物分組及給藥

40只SHR大鼠隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為模型組、厄貝沙坦組和天芙正眩方高、中、低劑量組；另取8只WKY大鼠作為正常組。厄貝沙坦膠囊給藥劑量為 13.5mg/kg ；天芙止眩方高、中、低劑量分別為 5.94，2.97，1.49g/kg; 模型組和正常組分別給予等體積蒸餾水。各組均灌胃給藥，藥液量均為 10mL/kg 每天1次，連續(xù)11周。

1.5樣本采集及檢測

1.5.1樣本收集最后1次給藥后，大鼠禁食不禁水 8h_c 以 10% 水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉，予以腹主動脈采血， 4% 靜置 4h，3 500r/min 離心 15min （離心半徑為 15cm ）。取上清液于 -80^°C 保存，用于AngII、IL-1β、TNF- 以及肌酐（serum creatinine， Scr）、尿素氮（bloodureanitrogen，BUN）檢測。快速分離新鮮腎組織，部分置于 4% 多聚甲醛固定 24h，4^°C 冰箱保存；部分放入凍存管， -80^°C 保存。

1.5.2大鼠收縮壓及舒張壓檢測于第1、3、5、7、9、11周，大鼠給藥 ¹h 后采用無創(chuàng)血壓儀在上午7：00—12：00時間段內(nèi)對大鼠進(jìn)行測量。將大鼠置于安靜環(huán)境中固定于容器內(nèi)，用感應(yīng)器固定于大鼠尾根部，測量大鼠收縮壓及舒張壓，每只大鼠重復(fù)測量3次，取平均值。

1.5.3腎功能指標(biāo)檢測將 -80^°C 凍存的血清樣本解凍后，取 200μL ，應(yīng)用全自動生化儀檢測各組大鼠血清 Scr 、BUN的含量。

1.5.4血清ELISA檢測取 -80‰ 適量血清樣本解凍后，按照ELISA試劑盒步驟檢測各組大鼠血清中 的含量。設(shè)定空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測樣品孔，將標(biāo)準(zhǔn)樣品、待測樣品加入酶標(biāo)板中。用密封膜密封酶標(biāo)板，在 37°C 下孵育 30min 清洗，拍干。除空白孔外，加入 50μL 的酶標(biāo)記試劑，溫育、洗滌、拍干、著色、終止。酶標(biāo)儀經(jīng)空白孔調(diào)零后，在 450nm 的波長下測定每個孔的吸光度并分析。1.5.5腎組織的病理檢測取新鮮腎組織，生理鹽水沖洗后置于 4% 多聚甲醛固定 24h ，進(jìn)行乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，制備 4μm 厚的石蠟?zāi)I組織切片，并對切片進(jìn)行染色。分別按照全自動HE染色封片機(jī)程序、MASSON和天狼星紅染色試劑盒進(jìn)行操作，中性樹脂封片，光鏡下肉眼觀察各組大鼠腎組織病理形態(tài)變化，并使用數(shù)字玻片掃描儀進(jìn)行拍照與分析。采用Image J6.0 計算纖維化率。

1.5.6免疫組織化學(xué)染色檢測腎組織石蠟切片，常規(guī)方法進(jìn)行脫蠟至水，將切片置于EDTA（ pH=9.0 ）抗原修復(fù)液中進(jìn)行高壓修復(fù)，加入過氧化物酶阻斷劑以阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶的活性，室溫孵育 30min ，PBS洗滌3次，孵育一抗（CD68稀釋比例為1：2000，TGF- _-β1 稀釋比例為1：1000，CollagenI稀釋比例為1：1000，CollagenI稀釋比例為1：500）。PBS洗滌3次，后續(xù)操作按照二步法檢測試劑盒PV-9001操作，DAB顯色，蘇木素染細(xì)胞核，中性樹脂封片。采用數(shù)字玻片掃描儀進(jìn)行全玻片掃描，隨機(jī)選擇區(qū)域，采用Image J6.0 軟件分析各組目的蛋白陽性表達(dá)。1.5.7RT-qPCR 檢測稱取新鮮腎臟組織 100mg 于無酶EP管中，使用RNA提取試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將所得cDNA樣品進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 C 預(yù)變性 5min，95^°C 變性 10s ，60^°C 退火 30min ，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，2^-ΔΔCt 法計算目的基因相對表達(dá)量。引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成，引物序列見表1。

1.5.8Westernblot檢測取新鮮腎臟組織置于RIPA裂解液中裂解并提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度并稀釋樣品。95 ^°C 變性 10min ，進(jìn)行PAGE凝膠電泳，上樣 20μg 后按 80V 電泳 20min.120V 電泳 60min 的順序進(jìn)行電泳，恒流 400mA 轉(zhuǎn)膜40min 。 5% 脫脂奶粉室溫封閉 ¹h ，加TBST稀釋一抗（TGF- _?β1 、Smad2/3、p-Smad2/3稀釋比例均為1：1000，CD68稀釋比例為 -actin稀釋比例為1：40000）， 4‰ 搖床孵育過夜。洗膜3次后加入1：5000比例稀釋的二抗中， 37°C 搖床孵育 ¹h 。采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行曝光顯影，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照，ImageJ6.0軟件分析灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS24.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以 x±s ”表示，若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布和方差齊性檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-wayANOVA），兩兩比較采用LSD檢驗；數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)性則用Kruskal-Wallis H 非參數(shù)檢驗。以 Plt;0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1天芙止眩方對SHR大鼠尾動脈血壓的影響

與正常組比較，第1、3、5、7、9、11周，模型組收縮壓及舒張壓均升高 （Plt;0.001） 。與模型組比較，第3、5、7、9、11周，厄貝沙坦組及天芙止眩方高、中劑量組收縮壓及舒張壓均降低 （Plt;0.01） ；第5、7、9、11周，天芙止眩方低劑量組收縮壓及舒張壓均降低（Plt;0.05，Plt;0.01） 。與厄貝沙坦組及天芙止眩方中劑量組比較，第3周，天芙止眩方低劑量組收縮壓及舒張壓均升高 （Plt;0.05） ；與天芙止眩方高劑量組比較，第7、9、11周，天芙止眩方低劑量組收縮壓及舒張壓均升高 （Plt;0.05） 。詳見圖1。

2.2 天芙止眩方對SHR大鼠血清腎功能指標(biāo)的影響

與正常組比較，模型組BUN、Scr水平均升高（ Plt; 0.01）。與模型組比較，厄貝沙坦組及天芙正眩方高、中劑量組BUN、Scr水平均降低 （Plt;0.05，Plt;0.01） 。與厄貝沙坦組及天芙止眩方高劑量組比較，天芙止眩方低劑量組Scr水平升高 （Plt;0.05） ）。詳見表2。

2.3 天芙止眩方對SHR大鼠血清促炎因子的影響

與正常組比較，模型組AngⅡI、IL-1β、TNF- ??αα 水平均升高 （Plt;0.01，Plt;0.001） 。與模型組比較，厄貝沙坦組及天芙止眩方高、中劑量組AngII、IL-1β、TNF- 水平均下降 （Plt;0.05，Plt;0.01 ），天芙止眩方低劑量組 水平均下降（ _{（Plt;0.05）} 。詳見表3。

2.4天芙止眩方對SHR大鼠腎組織病理改變的影響

正常組腎組織結(jié)構(gòu)清晰，腎小管排列較有序，間質(zhì)無明顯水腫表現(xiàn)。模型組腎組織結(jié)構(gòu)明顯異常，可見腎小球肥大，系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生，部分腎小管擴(kuò)張，炎癥細(xì)胞浸潤，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性。與模型組比較，各治療組的腎組織病理性損傷均有不同程度的改善，其中厄貝沙坦組及天芙止眩方高、中劑量組對腎組織病理損傷的改善程度最為明顯。詳見圖2。

2.5 天芙止眩方對SHR大鼠腎組織纖維化形成的影響

正常組腎組織中無明顯膠原纖維沉積。模型組腎組織間質(zhì)中膠原纖維沉積明顯。厄貝沙坦組及天芙止眩方高、中劑量組腎組織膠原纖維沉積較少。天芙正眩方中、低劑量組腎組織膠原纖維沉積增多。詳見圖3。

與正常組比較，模型組腎組織纖維化率增高（ Plt; 0.001）。與模型組比較，厄貝沙坦組及天芙止眩方高、中劑量組腎組織纖維化率均減少 （Plt;0.01） 。與厄貝沙坦組及天芙止眩方高劑量組比較，天芙止眩方中、低劑量組腎組織纖維化率均增多 （Plt;0.05，Plt; 0.01）。與天芙止眩方中劑量組比較，天芙止眩方低劑量組腎組織纖維化率增多 （Plt;0.01） 。詳見表4。

2.6天芙止眩方對SHR大鼠腎組織CollagenI、CollagenII、TGF-β1和CD68表達(dá)的影響

正常組腎組織中幾乎無膠原沉積及巨噬細(xì)胞促炎表達(dá)。模型組腎組織中腎小球及腎間質(zhì)周圍膠原沉積明顯，巨噬細(xì)胞促炎表達(dá)增多。厄貝沙坦組及天芙止眩方高、中劑量組腎組織膠原沉積、巨噬細(xì)胞 促炎表達(dá)均減少。天芙止眩方低劑量組腎組織膠原 沉積及促炎表達(dá)增多。詳見圖4—5。

與正常組比較，模型組腎組織中CollagenI、CollagenII、TGF-β1及CD68陽性表達(dá)均增多（ Plt; 0.001）。與模型組比較，厄貝沙坦組及天芙止眩方高、中劑量組CollagenI、CollagenII、TGF-β1及CD68陽性表達(dá)均減少 （Plt;0.05，Plt;0.01） ，天芙止眩方低劑量組CollagenI陽性表達(dá)減少（ Plt;0.05 ）。與厄貝沙坦組比較，天芙止眩方低劑量組TGF- _?β1 陽性表達(dá)增多 （Plt;0.05） 。與天芙止眩方高劑量組比較，天芙止眩方低劑量組CollagenI、CD68陽性表達(dá)均增多（Plt;0.05） 。詳見表5。

2.7天芙止眩方對SHR大鼠腎組織AngII、TGF-β1.CD68mRNA 表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組腎組織 AngII 、TGF- _?β1 、CD68mRNA相對表達(dá)量均升高 （Plt;0.01，Plt;0.001） 。與模型組比較，厄貝沙坦組和天芙止眩方高、中劑量組腎組織AngII、TGF- 、CD68mRNA相對表達(dá)量均降低 （Plt;0.05，Plt;0.01） 。詳見表 6

2.8天芙止眩方對 SHR大鼠腎組織 TGF- Smad2/3和Smad2/3比值及CD68蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組腎組織TGF- -Smad2/3

表6各組大鼠腎組織 AngII 、TGF- 、CD68 mRNA表達(dá)比較 0

與Smad2/3比值、CD68蛋白表達(dá)量均上調(diào) （Plt;0.01 。與模型組比較，厄貝沙坦組及天芙止眩方高、中劑量組腎組織TGF- ?|β1?|p-Smad2/3 與 Smad2/3比值、CD68的蛋白表達(dá)量均下調(diào) （Plt;0.05，Plt;0.01） 。與厄貝沙坦組及天芙止眩方高劑量組比較，天芙止眩方低劑量組腎組織p-Smad2/3和Smad2/3比值上調(diào) （Plt;0.05） 。詳見圖6、表7。

注：A.正常組；B.模型組；C.厄貝沙坦組；D.天芙止眩方高劑量組；E.天芙止眩方中劑量組；F.天芙止眩方低劑量組。

3討論

中醫(yī)學(xué)從辨證的角度將高血壓歸屬于“眩暈”“頭痛”“肝風(fēng)\"等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，高血壓發(fā)病主要是由于風(fēng)、痰、瘀、虛等病邪引起風(fēng)眩內(nèi)動、痰瘀交阻、氣血阻滯、清竅失養(yǎng)，病屬本虛標(biāo)實(shí)證5。高血壓主要病位在肝，病情發(fā)于腎，初為肝陽上亢，而乙癸同源，亢陽銷爍陰液，久致肝腎陰虛，則脈絡(luò)失養(yǎng)，行血不暢，瘀阻腎絡(luò)，腎失封藏，精微外泄，而致腎損害[。腎為先天之本，腎元不足，致脾王虧損，因而水液代謝異常，痰濕內(nèi)生。故而血行艱澀成瘀，痰瘀膠結(jié)郁久化火，血脈不通，臟腑失養(yǎng)而加重五臟虛損，進(jìn)一步加重眩暈。因此，肝風(fēng)、阻、痰濁是眩暈發(fā)病的重要病理基礎(chǔ)[。根據(jù)以上病機(jī)化裁而來的天芙止眩方由天麻、鉤藤、法半夏等多味中藥組成，方中天麻平肝息風(fēng)、祛風(fēng)通絡(luò)，鉤藤清熱平肝、息風(fēng)止痙，兩者共為君藥；法半夏燥濕化痰，白術(shù)健脾燥濕，兩者為臣藥；佐以茯苓利水滲濕，陳皮理氣化痰，甘草調(diào)和諸藥。全方共奏平肝息風(fēng)、利濕化痰之功效。本研究利用SHR大鼠模型，以不同劑量的天芙止眩方進(jìn)行治療，結(jié)果顯示，天芙止眩方高、中劑量組第3、5、7、9、11周大鼠舒張壓和收縮壓明顯降低，而天芙止眩方低劑量組第5、7、9、11周血壓明顯降低，說明該方具有良好的抗高血壓效果。

天麻、鉤藤是天芙止眩方的重要組成，現(xiàn)代藥理研究表明，天麻和鉤藤的主要有效成分為天麻素和鉤藤堿，二者均可通過調(diào)控TGF- _?β1 及其下游信號通路抑制氧化應(yīng)激、降低炎癥反應(yīng)，從而改善因高血壓引起的腎纖維化[9，18]。高血壓腎損傷患者血清BUN、Scr水平上升，二者是判斷腎小球濾過功能的重要指標(biāo)，因此，多用于診斷及評價腎臟疾病[]。高血壓大鼠中AngI及促炎介質(zhì)的增多可刺激腎小球系膜細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)ECM沉積，從而導(dǎo)致過度的腎纖維化20。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，天芙止眩方能有效降低SHR大鼠血清中BUN、Scr的水平，改善腎功能指標(biāo)，抑制血清中 AngII，IL-1β，TNF-α 促炎因子的釋放。HE染色結(jié)果顯示，天芙止眩方治療后腎組織的損傷減輕，炎癥細(xì)胞浸潤減少。以上結(jié)果表明，天芙正眩方能減輕炎癥，對腎臟功能具有保護(hù)作用。此外，Masson、天狼星紅染色以及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果均顯示，SHR大鼠在19周齡時，出現(xiàn)明顯的腎纖維化，而天芙止眩方治療能明顯降低纖維化程度，降低CollagenI和CollagenⅢ表達(dá)。因此，天芙止眩方對高血壓引起的腎纖維化具有明顯的抑制作用。

TGF- 信號通路是腎纖維化的關(guān)鍵通路，TGF- 通過經(jīng)典的Smad2/3信號，促進(jìn)下游基因CollagenI和CollagenI的轉(zhuǎn)錄[2-22]。因此，本研究通過免疫組織化學(xué)染色，Westernblot以及RT-qPCR等方法，檢測 SHR大鼠腎組織中 TGF- ?β1_?p. -Smad2/3的水平，結(jié)果顯示，模型組大鼠腎組織中TGF- 和Smad2/3蛋白磷酸化水平明顯升高，而天芙正眩方治療后能顯著降低其表達(dá)。近期研究表明，腎巨噬細(xì)胞對腎纖維化的調(diào)節(jié)至關(guān)重要，在腎臟損傷時，當(dāng)循環(huán)血液中的單核細(xì)胞被招募到損傷部位時，在不同因子作用下分化為促炎（M1型）或抑炎（M2型）巨噬細(xì)胞，M1型巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出典型的促炎表型，表達(dá)CD68、CD86等標(biāo)志蛋白，主要通過分泌IL-1β，TNF-α 等炎癥因子和活性氧，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加重組織損傷和纖維化[23-24]。巨噬細(xì)胞對高血壓腎纖維化的發(fā)生至關(guān)重要，巨噬細(xì)胞的炎癥作用被認(rèn)為有助于腎纖維化25。高血壓患者巨噬細(xì)胞表型和數(shù)量發(fā)生顯著變化，而抑制巨噬細(xì)胞活化能降低促炎標(biāo)志物在腎中的表達(dá)并減輕腎纖維化，有效降低高鹽及AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓[26-27]，表明巨噬細(xì)胞可增強(qiáng)腎臟炎癥，導(dǎo)致高血壓腎纖維化的發(fā)生。本研究通過免疫組織化學(xué)染色、Westernblot以及RT-qPCR等檢測了腎組織中CD68的表達(dá)。結(jié)果顯示，模型組大鼠腎組織中，CD68蛋白和mRNA表達(dá)顯著增加，而天芙止眩方高、中劑量組能顯著降低CD68的表達(dá)。因此，本研究的結(jié)果表明，天芙正眩方具有抑制促炎巨噬細(xì)胞、降低組織炎癥、減輕腎纖維化的作用。

綜上所述，天芙止眩方能有效降低SHR大鼠血壓、改善腎功能，可能與其抑制組織炎癥和TGF- Smad信號通路，減輕腎纖維化有關(guān)。

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（本文編輯 周旦）