地黃苷A對成骨細胞增殖分化及MCP-1/CCR2信號通路的影響

[摘要］目的觀察地黃苷A對成骨細胞增殖和分化能力的影響及其潛在分子作用機制。方法以成骨細胞株MC3T3-E1細胞為體外細胞模型，以不同濃度 （0，1，10，100μmol/L） ）地黃苷A進行處理，采用CCK-8法和細胞增殖溴脫氧尿苷（BrdU）熒光標記法檢測24、48、72h后不同濃度地黃苷A對成骨細胞增殖能力的影響。將細胞分為空白組（生理鹽水）地黃苷A組（ 10μmol/L ）地黃苷A+RS504393組（ 10μmol/L 地黃苷 RS504393）。堿性磷酸酶（ALP）檢測試劑盒檢測成骨細胞的ALP活性，采用RT-qPCR檢測成骨細胞分化標志物骨鈣素（OCN）、Runt相關轉錄因子2（Runx2）、成骨細胞特異性轉錄因子 （Osx） 和單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、CC類趨化因子受體-2（CCR2）的mRNA表達量，Westernblot法檢測 0CN，Runx2，Osx，MCP-1，CCR2 2的蛋白表達。結果與 0μmol/L 地黃苷A組 、1μmol/L 地黃苷A組比較， 10μmol/L 地黃苷A組在培養 ^48，72h 的OD值及BrdU熒光表達量增高號 （Plt;0.01），100μmol/L 地黃苷A組在培養 ^48，72h 的OD值降低 （Plt;0.05） ；與 10μmol/L 地黃苷A組比較， 100μmol/L 地黃苷A組在培養 ^48，72h 的OD值降低 （Plt;0.05） 。與 0μmol/L 地黃苷A組、 10μmol/L 地黃苷A組比較， 100μmol/L 地黃苷A組BrdU熒光表達量在24、48、72h降低 與 1μmolL 地黃苷A組比較， 100μmol/L 地黃苷A組BrdU熒光表達量在48、72h降低 （Plt;0.01） 。與空白組比較，地黃苷A組3、7、14d的ALP活性均增高 （Plt;0.01） ;且隨成骨細胞培養時間增長，ALP活性持續增高 （Plt;0.01 。與地黃苷A組比較，地黃苷 A+RS504393 組3、7、14d的ALP活性均降低 （Plt;0.01） ；且隨成骨細胞培養時間增長，ALP活性持續增高（ Plt; 0.05）。與空白組比較，地黃苷A組 0CN，Runx2，Osx，MCP-1，CCR2 的mRNA和蛋白表達量均升高 ）。與地黃苷A組比較，地黃苷 A+RS504393 組 0CN，Runx2，Osx，MCP-1，CCR2 的mRNA和蛋白表達量均降低（ Plt;0.01 ）。結論地黃苷A能通過激活MCP- CCR2信號通路進而促進成骨細胞的增殖和分化。

[關鍵詞]地黃苷A；成骨細胞；成骨分化；單核細胞趨化蛋白-1；類趨化因子受體-2 [中圖分類號]R285.5 [文獻標志碼]A [文章編號]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.04.007

[Abstract]ObjectiveToobservetheefectsofrehmanniosideAontheosteoblastproliferation，diferentiationandits potentialmolecularmechanisms.MethodsOsteoblastcelline MC3T3-E1wasusedasaninvitromodelCelsweretreatedwith diferentconcentrationsofrehmaosideA（0，1100OμmolL）.heCCK-8assayndbromodeoxyuridine（BrdU）fuorescnce labelingmethodwereemployedtoevaluatetheefectsofrehmanniosideAonosteoblastproliferationat24，48，and72hposttreatment. Experimental groups were divided as follows： blank group （saline），rehmannioside A group （10 μmol/l ），and rehmannioside A+RS504393 group（10 μmol/L rehmannioside A+10 μg/mL RS504393）. Alkaline phosphatase （ALP） activity of osteoblasts was determinedusinganALPassaykit.RT-qPCRwasperformedtomeasuremRNAexpressionlevelsofosteogenicdifferentiation markersosteocalcin（OCN），Runtelatedtransiptionfactor（unx2）osterix（Osx），ooytehmoaractantprotein-（1）， andCC chemokinereceptor-2（CR2）. Westernblotanalysisasusedtomeasureprotein expressionsofOCN，Runx2，OsxMP-1， and CCR2. Results Compared with the 0μmol/L and 1 μmol/L rehmannioside A groups， the 10 pumoldL rehmannioside A group showed increased OD values and BrdU fluorescence expressions at 48 and 72 h （ P- lt;0.01），while the 100μmol/L rehmannioside A group exhibited decreased OD values at 48 and 72 h （ P lt;0.05）. Compared with the 10 μmolL rehmannioside A group， the 100μmol/L （204號 group had reduced OD values at 48 and 72 h （ Plt; 0.05）. Compared with the O μmol/L and 10 μmol/L rehmannioside A groups，the 100 μmol/L group showed decreased BrdU fluorescence expressions at 24， 48， and 72 h （ P- lt;0.01）. Compared with the 1μmol/L （204號 group， the 100μmol/L group exhibited reduced BrdU fluorescence expressions at 48 and 72 h （ P- lt;0.01）.Compared with the blank group，the rehmannioside A group demonstrated increased ALP activity at 3，7，and 14 days （ P lt;0.01），with ALPactivity progressively increasing over the prolonged culture time of osteoblasts Plt; 0.01）. However，compared with the rehmannioside A group， the rehmannioside A+RS504393 group showed decreased ALP activity at 3， 7， and 14 days （ Plt; 0.01）， with ALP activity progressively increasing over the prolonged culture time of osteoblasts （ P lt;0.05）. Compared with the blank group，the rehmannioside A group exhibited elevated mRNA and protein expresson levels of OCN， Runx2， Osx， MCP-1，and CCR2 （ P lt;0.01）.Compared with the rehmanniosideA group，therehmaniosideA+S504393groupshowedreducedmRNAandproteinexpresions ofOCN，Run2Osx MCP-1，and CCR2（ P_- lt;0.01）.Conclusion Rehmannioside Acan promoteosteoblast proliferation and differentiationbyactivating the MCP-1/CCR2 signaling pathway.

[Keywords]rehmanniosideA；osteoblasts；osteogenicdiferentiation；monocytechemoatractantprotein-l；CCchemokine receptor-2

骨質疏松是老年人群中最常見的臨床問題之一，由于醫療資源有限和人口老齡化，我國骨質疏松疾病負擔越來越重。骨質疏松癥是一種以骨量減少和骨結構破壞為特征的疾病，可導致脆性骨折風險增加，老年人發生骨質疏松性骨折后通常需要住院治療以及長期醫療護理，患者生活質量下降，出現殘疾甚至死亡2。成骨細胞源自骨髓腔中的間充質干細胞，負責骨基質的合成、分泌和礦化，成骨細胞的增殖和分化影響骨組織的生長發育和形態變化，與骨質疏松的病理過程相關。中藥具有多途徑、多靶點治療等優勢，目前已有多種中藥被報道可通過調節成骨細胞功能延緩骨質疏松癥的疾病進展4。生地黃是玄參科多年生草本植物地黃的根，為“四大懷藥\"之一，在我國被廣泛用作治療由腦動脈粥樣硬化、衰老相關性中風和癡呆等“腎虛\"引起的疾病[5]研究發現，地黃苷A具有增強體液免疫和細胞免疫的功能，但地黃苷A潛在的分子機制目前研究較少[6-8]。趨化因子是一種高度保守的分泌性蛋白，作為一種免疫調節因子，其通過與相應的受體結合將白細胞遷移和募集至炎癥及損傷部位。因此，地黃苷A的免疫調節功能很可能通過趨化因子受體相關通路實現。目前研究發現，單核細胞趨化蛋白-1/CC類趨化因子受體-2（monocytechemotactic protein-1/CCchemokine receptor-2，MCP-1/CCR2）信號通路可能影響成骨細胞的功能，從而導致絕經后骨質疏松的發生。綜合上述研究和發現，本研究通過研究地黃苷A對成骨細胞增殖和分化功能以及MCP-1/CCR2信號通路的影響，探索地黃昔A應用于骨質疏松癥治療的臨床潛在價值。

1材料

1.1 細胞

MC3T3-E1細胞由中國科學院生物化學與細胞生物學研究所提供。細胞培養于 α∝-MEM 培養基中，培養基由 10% 胎牛血清、 10mmol/L β- 甘油磷酸鹽 $＼ 、 5 0 ＼ ＼mu ＼mathrm { g / m L }$ L-抗壞血酸組成。每3天更換一次培養基，待細胞達到 70% 融合后，用 0.05% 胰蛋白酶處理細胞，然后重新接種以進行實驗。制備低傳代凍存液，實驗中使用早期傳代細胞（傳代數少于10代）。

1.2 主要試劑和儀器

地黃苷A（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-150513，分子量：524.47，分子式： C₂₁H₃₂O₁₅ ，4℃冷藏密封避光保存）；RS504393抑制劑（美國Pro-teintech公司，批號：CM03344）； αα-MEM 培養基、胎牛血清、胰酶消化液（賽默飛世爾科技有限公司，批號：12561056、A5670701、R001100）; β- 甘油磷酸鹽、L-抗壞血酸（美國Sigma公司，批號：13408098、50817）;CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術公司，批號：Coo38）;增殖溴脫氧尿苷（bromodeoxyuridine，BrdU）標記法載玻片細胞繁殖熒光顯微鏡檢測試劑盒（深圳子科生物科技有限公司，批號：GMS10033.3）；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：A059-1）;RNAisoPlus試劑、PrimeScriptRT預混液（日本TaKaRa公司，批號：9108、RR036B）；SYBRGreenPCR預混液（美國AppliedBiosystems公司，批號：4309155）;RIPA緩沖液（上海碧云天生物技術公司，批號：P0013B）;骨鈣素（osteocalcin，OCN）Runt相關轉錄因子2（Runt-relatedtranscriptionfactor2，Runx2）成骨細胞特異性轉錄因子（osteoblast-specific transcription factorOsterix，Osx）MCP-1、CCR2[艾博抗（上海）貿易有限公司，批號：ab93876、ab192256、ab209484，ab315478、ab273050];Immun-StarTMHRP化學發光試劑盒（美國Bio-Rad 公司，批號：1705060S）。

超凈工作臺（蘇州凈化科技有限公司，型號：SW-CJ-2FD）；二氧化碳細胞培養箱（上海精其科技有限公司，型號：BPC-270）；倒置熒光顯微鏡（廣州廣卓精密儀器有限公司，型號：M30C）；細胞離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司，型號：XZ-4A）；多功能酶標分析儀（賽默飛世爾科技有限公司，型號：Multiskan FC）。

2方法

2.1 CCK-8檢測

將MC3T3-E1細胞培養至 80% 融合，用含 0.25% 胰蛋白酶的胃蛋白酶溶液處理，制成細胞懸液。將細胞以3000個孔的密度接種于96孔板，分為 0μmol/L 地黃苷A組 .1μmol/L 地黃苷A組 、10μmol/L 地黃苷A組、 地黃苷A組，每組設置3個復孔，加入地黃苷A后分別培養 24、48、72h ，每孔加入10μL CCK-8溶液。在培養箱中培養 ^2h ，用酶標儀檢測 450nm 處的吸光度（opticaldensity，OD）值。

2.2 BrdU檢測

將MC3T3-E1細胞接種在細胞爬片上，給予藥物，分為 0μmol/L 地黃苷A組 、1μmol/L 地黃苷 A組 地黃苷A組、 .100μmol/L 地黃苷A組，每組設置3個復孔，加入地黃昔A后分別培養24、^48，72h ，向培養基中添加 10μmol/L BrdU，孵育 ¹h 。4% 多聚甲醛固定 10min ，用PBS洗3次，每次 5min 用 0.1% Triton X-100或PBS-T（ 0.1% Triton X-100）透化細胞 10～15min 。用PBS洗3次，每次 5min 用2NHCl（濃鹽酸：水 ?=1：6 在 37°C 孵育 30min 使核酸變性，暴露BrdU結合位點。用PBS洗3次，每次 5min ，用 5% 血清封閉液常溫下封閉 ^1h，4°C 下孵育一抗BrdU抗體過夜，常溫下孵育熒光二抗 1～ 2h 用DAPI工作液在常溫下孵育 3～5min ，抗熒光淬滅封片劑封片。 37°C 烘箱中稍作烘干直到蓋玻片不自行滑動，熒光顯微鏡采集圖片。

2.3 ALP活性檢測

MC3T3-E1細胞分為空白組（生理鹽水）地黃苷A組（ 10μmol/L） 、地黃苷 A+RS504393 組（ 10μmol/L 地黃苷 A+10μg/mL RS504393）。將MC3T3-E1細胞以 1×10⁵ 細胞/孔的濃度接種于24孔培養板中，并在培養箱中培養3、7、14d后，通過ALP活性檢測分析MC3T3-E1細胞成骨能力。用RIPA裂解緩沖液裂解細胞后，將獲得的細胞上清液以 200×g 離心 5min 。使用ALP檢測試劑盒在微孔板讀數儀下檢測 520nm 波長下的OD值。

2.4 RT-qPCR檢測

MC3T3-E1細胞分為空白組、地黃苷A組、地黃苷 A+RS504393 組。將細胞以 1×10⁵ 細胞孔的密度接種于6孔板中，培養7d后，使用RNAisoPlus試劑按照說明提取細胞總RNA。使用PrimeScriptRT預混液從RNA樣本逆轉錄cDNA。以逆轉錄的cDNA為模板，使用SYBRGreenPCR預混液進行實時PCR分析。 10μL 反應體系包含 5μL SYBRGreen預混液 $＼ 、 0 . 5 { ＼mu ＼mathrm { L } }$ 正向和反向引物 ，3μL 目標cDNA，剩下體積用無核酸酶的水補充至 10μL_c 。在95 C 下進行 5min 的預變性，然后按順序進行40個擴增循環，每個循環 15s（94%），15s（60%） 和30s（72^°C） 。采用 ΔCt 法計算基因表達變化倍數，采用 2^-ΔΔG 法分析基因相對表達倍數變化，引物序列見表1。

2.5 Western blot檢測

MC3T3-E1細胞分為空白組、地黃苷A組、地黃苷 A+RS504393 組。使用含有蛋白酶抑制劑混合物的RIPA緩沖液裂解細胞的總蛋白。在4 C 下以14000r/min 離心 10min （離心半徑 20cm ）。收集可溶性蛋白質，與 5× 樣品上樣緩沖液混合并煮沸5min 。將蛋白質樣品置于SDS-PAGE凝膠中，并在100V 下電泳 2h 隨后電印跡至PVDF膜上。用 5% 脫脂牛奶封閉PVDF膜，孵育一抗[OCN（1：3000）、Runx2（1：2 000）、Osx（1：2 000）、MCP-1（1：2 000）、CCR2（1：2000）]過夜，加入二抗HRP（1：2000）孵育¹h 后，使用Immun-StarTMHRP化學發光試劑盒對結果進行可視化。

2.6 統計學分析

使用SPSS23.0進行統計學分析，每個實驗獨立重復3次，結果以 ”表示。采用單因素方差分析和Dunnett事后檢驗分析組間顯著性差異，不同時間點的比較采用重復方差分析， Plt;0.05 為差異具有統計學意義。

3結果

3.1不同濃度地黃苷A對成骨細胞增殖的影響

與 0μmol/L 地黃苷A組 .1μmol/L 地黃苷A組比較， 10μmol/L 地黃苷A組在培養 ^48，72h 的OD值增高 （Plt;0.01），100μmol/L 地黃苷A組在培養 ^48，72h 的OD值降低 （Plt;0.05） 。與 10μmol/L 地黃苷A組比較， 地黃苷A組在培養^48，72h 的OD值降低 （Plt;0.05） 。詳見圖1。

注：與 0μmol/L 地黃苷A組比較， ^*Plt;0.05 **Plt;0.01 ；與 1μmol/L 地黃苷A組比較， ^*Plt;0.05，^**Plt;0.01 ；與 10μmol/L 地黃苷A組比較， ^gPlt;0.05 ^ggPlt;0.01 0

與 0μmol/L 地黃苷A組 ?1μmol/L 地黃苷A組比較， 10μmol/L 地黃苷A組BrdU熒光表達量在^48，72h 增高 （Plt;0.01） 。與 0μmol/L 地黃苷A組、10μmol/L 地黃苷A組比較， 地黃苷 A組BrdU熒光表達量在 24，48，72h 降低 （Plt;0.01） 。與 1μmol/L 地黃苷A組比較， 地黃苷A組BrdU熒光表達量在 ^48，72h 降低 （Plt;0.01） 。詳見圖2。

3.2地黃苷A對成骨細胞ALP活性的影響

與空白組比較，地黃苷A組3、7、14d的ALP活性均增高 （Plt;0.01） ；且隨著成骨細胞培養時間增長，ALP活性持續增高 （Plt;0.01） 。與地黃苷A組比較，地黃苷 A+RS504393 組3、7、14d的ALP活性均降低 （Plt;0.01） ；但隨著成骨細胞培養時間增長，ALP活性持續增高（ （Plt;0.05） 。詳見圖3。

注：與空白組比較， **Plt;0.01 ；與地黃苷A組比較， ^**Plt;0.01 。與3d比較， ^gPlt;0.05 ;與7d比較， ^eePlt;0.01 。

3.3地黃苷A對成骨細胞分化標志物表達的影響

與空白組比較，地黃苷A組OCN、Runx2、OsxmRNA和蛋白表達量均升高 （Plt;0.01 ）。與地黃苷A組比較，地黃苷 A+RS504393 組 OCN、Runx2、Osx mRNA和蛋白表達量均降低（ Plt;0.01 ）。詳見圖4—5。

3.4地黃苷A對成骨細胞MCP-1/CCR2信號通路 的影響

與空白組比較，地黃苷A組MCP-1、CCR2的mRNA和蛋白表達量均升高 （Plt;0.01） 。與地黃苷A組比較，地黃苷 A+RS504393 組MCP-1、CCR2的mRNA和蛋白表達量均降低 （Plt;0.01） 。詳見圖6—7。

4討論

地黃為玄參科植物地黃的新鮮或干燥塊根，始載于《神農本草經·干地黃篇》，被列為上品。地黃含有多種苷類成分，其中以環烯醚萜昔類為主，如梓醇、二氫梓醇、乙酰梓醇、桃葉珊瑚苷、單密力特苷及地黃苷 _{A，B，C，D} 等，地黃苷A有降血糖、免疫調節等作用]。本研究探討地黃苷A對MC3T3-E1細胞成骨分化的作用機制，結果發現地黃苷A通過MCP-1/CCR2信號通路顯著促進MC3T3-E1細胞成骨增殖和分化。

本研究結果顯示， 100μmol/L 地黃苷A組對MC3T3-E1細胞增殖能力表現出抑制作用， 10μmol/L 為促進成骨細胞增殖及分化的最佳濃度。盡管目前尚無研究報道地黃苷A對成骨細胞的影響，但是已有研究報道地黃昔A可調節炎癥因子的水平，如地黃苷A可減輕膿毒癥大鼠的炎癥因子，降低大鼠腦組織白細胞介素-6和腫瘤壞死因子- σ?α?α?α 水平[]。而成骨細胞增殖和分化與炎癥調節過程密切相關，長時間炎癥刺激下，其增殖和分化功能受到抑制[13]。以上

注：與空白組比較， **Plt;0.01 ;與地黃苷 ΔA 組比較， 。

研究均部分解釋了地黃昔A促進成骨細胞增殖的潛在效應。

為探索地黃苷A促進MC3T3-E1細胞成骨分化的機制，本研究進一步檢測MCP-1/CCR2信號通路相關分子的表達量。與空白組比較，地黃苷A組的MC3T3-E1細胞中成骨細胞ALP活性增強，成骨分化標志物 和信號通路分子MCP-1、CCR2的mRNA和蛋白表達均升高。MCP-1又稱為趨化因子2（chemokineC-C motif ligand 2，CCL2），主要由單核/巨噬細胞分泌，CCR2是CCL2的受體4，CCL2對單核細胞和嗜堿性粒細胞具有趨化活性，是調節單核細胞/巨噬細胞遷移和浸潤的關鍵趨化因子之一[]。CCL2/CCR2在調節生理性骨重建，以響應激素和骨的機械刺激方面有重要作用[。研究表明，CCL2和CCR2基因變異是骨質疏松癥的危險因素，CCL2在骨質疏松性骨中廣泛表達。成骨細胞CCL2的時空表達與炎癥過程中單核細胞的募集和骨重建的調控有關[8]。外源性CCL2可增強炎癥骨中單核細胞的募集，進一步增加CCR2基因缺失小鼠的骨量，降低破骨細胞的數量、大小和活性[19-20]。為進一步確

定MCP-1/CCR2信號通路是否參與MC3T3-E1細胞的成骨分化，本研究采用MCP-1/CCR2信號通路抑制劑RS504393阻斷該通路，ALP檢測結果發現，RS504393部分逆轉了地黃苷A介導的促進MC3T3-E1細胞成骨分化的作用，RT-qPCR和Westernblot分析進一步驗證ALP檢測的結果，表明地黃苷A可能通過MCP-1/CCR2信號通路影響成骨細胞分化。

綜上所述，本研究首次證明地黃昔A通過直接上調MCP-1/CCR2信號通路增強了MC3T3-E1細胞的成骨分化潛能。地黃苷A有可能成為未來干預骨質疏松癥的潛在治療靶點，對預防和治療骨代謝疾病具有重要意義。

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（本文編輯 周旦）