環磷酰胺對大鼠丸Pnldc1-Piwils基因表達的影響

環磷酰胺是一種臨床常用的烷化劑類抗腫瘤藥物，其能有效的治療乳腺癌、肺癌、肝癌等[1-3]，但其治療過程中會出現嚴重的不良反應，可導致患者肝、腎、辜丸等組織器官的損傷，以及嚴重的免疫抑制[4-6]。研究表明，環磷酰胺的代謝產物丙烯醛可造成辜丸損傷，并可抑制辜丸支持細胞分泌精原細胞生長因子，干擾精子生成過程[。在精子發生過程中，Pnldc1通過調控piRNAs表達，達到控制精細胞DNA甲基化的作用，而piR-NAs與Piwils蛋白家族成員結合能抑制轉錄和轉錄后轉座子基因表達的作用，調控精子發生[811]。Nagirnaja等[12]對4例Pnldc1 基因缺陷非阻塞性無精子癥患者辜丸小RNA測序后發現，與Pnldc1基因正常的非阻塞性無精子癥患者相比，Pnldc1基因缺陷患者的睪丸組織piRWA的表達顯著缺失，粗線期精母細胞Piwil1和精原細胞Piwil4表達顯著降低；同時也發現，在敲除谷胱甘肽過氧化物酶5后小鼠附睪頭中Piwill和Piwil2與piRNA的結合顯著降低[13]。這些研究結果表明Pnldcl-Piwils在精子發生的過程中起到調控的作用，但是其是否參與環磷酰胺損傷大鼠辜丸有待進一步研究。因此，為了探究Pn-ldcl-Piwils在環磷酰胺損傷大鼠辜丸中的作用，本研究以環磷酰胺為模型復制藥物，以性成熟的SD大鼠作為試驗動物，探究Pnldcl-PiwilsmR-NA在大鼠辜丸損傷模型中的表達情況，以期為環磷酰胺致生殖損傷機制的研究提供參考。

1材料與方法

1.1 材料

動物：12只SD雄性大鼠， 18. 0g±2. 0g ，購自醫科大學實驗動物中心，試驗動物生產許可證為SCXK（皖）2017-001。飼養條件：濕度55%～65% ，溫度 20～24^°C ，自由采食和飲水。

藥物和試劑：HE染液（D006，南京建成科技有限公司）；環磷酰胺（F1812016，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；大鼠睪酮（Testosterone，T）ELISA試劑盒（EK7014，武漢博士德生物工程有限公司）；大鼠促黃體激素（Luteinizinghormone，LH）ELISA試劑盒（ER1123，武漢菲恩生物科技有限公司）；大鼠促卵泡素（Folliclestimulating hormone，FSH）ELISA 試劑盒（ER0960，武漢菲恩生物科技有限公司）；RNA提取液（G3013，武漢賽維爾生物科技有限公司）；HyPureTMMolecular Biology Grade Water（SH30538. 02，HyClone）；RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit（#K1622，Thermo）;FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）（04913914001，Roche）;其他涉及試劑均為分析純。

儀器：顯微切片機（YD-335，浙江金華益迪醫療設備有限公司）；顯微鏡（BX53，Olympus）；超微量分光光度計（NanoDrop2000，Thermo）；熒光定量PCR 儀（Stepone plus，Applied Biosystems）等。

1.2 動物分組與給藥方法

按照隨機數表法，將12只雄性SD大鼠均分為空白組和模型組，每組6只。模型組大鼠每周腹腔注射1次環磷酰胺 （50mg/kg） ，共注射8次，空白組給予等量的生理鹽水。最后一次注射環磷酰胺 12h 后，斷頸處死所有大鼠，稱量所有大鼠體質量和睪丸質量，采集血液并分離血清用于生殖激素含量檢測，取附辜尾用于精子質量檢測，使用 4% 多聚甲醛溶液固定左側睪丸，用于病理組織學檢查；使用液氮凍存右側辜丸，用于qRT-PCR檢測。其中，睪丸臟器系數 （mg/g）= （ 1000× 辜丸質量）/體質量

1.3 精子質量分析

使用眼科剪和眼科鑷取下左側附辜尾，剪碎后放入盛有 200μL37^°C 生理鹽水的96孔板中，37^°C 恒溫孵化 10min 。孵化結束后，移液槍混勻，取 10μL 混勻液于載玻片上，蓋上蓋玻片，BX53顯微鏡檢測精子的活率；取 10μL 混勻液，20倍稀釋后，血球計數板法檢測精子的密度；取10μL 混勻液進行精子抹片，伊紅染色后檢測精子畸形率。

1.4 病理組織切片檢測

取 4% 多聚甲醛溶液固定的睪丸組織，經修塊、沖水、梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟后，對組織進行常規包埋。組織切片機對蠟塊切片，使用超凈黏附載片撈片后，將載片放入 60^°C 烘箱中固定，固定后，依次將載片浸人二甲苯、梯度酒精、水中后，按照HE試劑盒說明書提供的方法染色，染色后，再將載片依次浸入梯度酒精和二甲苯后，中性樹脂封片，晾干后，在數碼攝像顯微鏡下拍照觀察。

1.5大鼠血清激素含量的檢測

將采集的血液 3000r/min 離心 10min 后，取上層血清用于血清激素ELISA檢測，血清睪酮（T）、促卵泡激素（FSH）、黃體生成素（LH）含量的檢測按照相應試劑盒的要求進行。

1.6丸組織Pnldc1-Piwils基因表達

按照GenBank中Rattusnoruegicus全長序列基因設計 β actin、Pnldcl、Piwill、Piwil2和Piwil4mRNA的上下游引物，并由Servicebio公司合成（表1）。按照Servicebio公司提供的RNA提取試劑盒的要求提取大鼠辜丸組織RNA，并將RNA的終濃度調節為 200ng/μL ，按照RevertAidFirst Strand cDNA SynthesisKit的要求將RNA反轉錄為cDNA，按照FastStartUniversalSYBRGreenMaster（Rox）試劑盒的要求進行熒光定量PCR檢測，結果數據用 2^-ΔΔCT 法處理。

1. 7 統計學分析

所有數據均采用SPASS19.0進行單因素方差分析，結果以“平均值 ± 標準差”的形式表示，Plt;0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1環磷酰胺對大鼠體質量、辜丸質量和睪丸臟 器系數的影響

結果顯示，與空白組相比，模型組大鼠的體質量、睪丸質量和睪丸臟器系數顯著降低，差異均有統計學意義（ Plt;0.05） ，見表2。

2.2環磷酰胺對大鼠精子質量的影響

結果顯示，與空白組相比，模型組大鼠精子活率和密度顯著降低，畸形率顯著升高，差異均有統計學意義（ Plt;0.05） （表3）。

2.3環磷酰胺對大鼠辜丸病理組織學影響

空白組睪丸曲細精管基膜完整，曲細精管內生精細胞層次完整，生精細胞和支持細胞排列緊密有序，管腔內各級生精細胞數量豐富，辜丸間質緊密，間質細胞結構正常。模型組大鼠睪丸組織曲細精管的結構發生了明顯變化，生精細胞和支持細胞排列松散，緊密連接消失，管腔內各級生精細胞層數減少，部分曲細精管內生精細胞完全脫落，細胞排列紊亂，結構疏松，管腔內初級精母細胞、次級精母細胞、精細胞和精子數量減少，精細胞和精子結構異常，多數精子并未形成尾部；睪丸間質空隙明顯增加，辜丸間質內出現大量空泡，間質細胞染色質濃縮、染色變深、核體積縮小（圖1）。

2.4環磷酰胺對大鼠血清辜酮含量的影響

結果顯示，模型組大鼠血清睪酮、FSH和LH含量顯著低于空白組，差異均有統計學意義（ Plt; 0.05）（表4）。

2.5環磷酰胺對大鼠丸Pnldc1-Piwils基因表 達的影響

結果顯示，與空白組相比，模型組大鼠 Pn

ldcl、piwill、piwil2、piwil4mRNA的表達水平顯著降低，差異均有統計學意義 （Plt;0.05） （表5）。

3討論

環磷酰胺是臨床常用的烷化劑類抗腫瘤藥，其能引起嚴重的免疫抑制和機體組織器官的損傷[7，14-15]。環磷酰胺經肝臟細胞色素 P45O 酶生物轉化形成4-羥基環磷酰胺和醛基磷酰胺，醛基磷酰胺在體內不能穩定存在，極易分解為磷酰氮芥和丙烯醛，而丙烯醛可造成睪丸的損傷[16-19]環磷酰胺可以導致精子活力下降，畸形率升高，使睪丸不能正常產生精子，同時精母細胞發生液泡化[16]。本研究結果顯示，環磷酰胺能使大鼠睪丸質量及附睪中精子活率、密度降低，精子畸形率升高，使曲細精管內各級生精細胞層數減少，部分曲細精管內生精細胞完全脫落，曲細精管內初級精母細胞、次級精母細胞、精細胞和精子數量減少，精細胞和精子結構異常，多數精子并未形成尾部。這與穆毅[20]的研究結果相似，提示環磷酰胺具有較強的生殖毒性，能夠使大鼠辜丸發生損傷。

下丘腦一垂體一睪丸軸調控機體生殖激素的分泌，下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素作用于垂體，促進垂體分泌LH和FSH，調控辜丸間質細胞合成睪酮[21]。睪酮通過睪丸支持細胞上的睪酮受體促進和維持精子生成[22]。環磷酰胺的代謝產物丙烯醛可以誘導辜丸間質細胞損傷，抑制其類固醇生成途徑，降低睪酮的合成[18]。本研究結果表明，環磷酰胺可使生精細胞和支持細胞排列松散及緊密連接消失，睪丸間質空隙明顯增加，辜丸間質內出現大量空泡，間質細胞染色質濃縮、染色變深、核體積縮小。同時模型組大鼠血清睪酮、FSH和LH含量顯著低于空白組（ Plt; 0.05）。表明環磷酰胺損傷睪丸支持細胞和間質細胞的生理功能，使其喪失分泌和維持生殖激素穩定的作用，導致大鼠精子生成和發育受阻。

Pnldcl是一種piRNAs基因微調器，與TDRKH/Papi蛋白共同調整piRNAs，沉默轉座子，引起基因表達的異常[12]。Pnldcl通過調控piRNAs表達，達到控制精細胞DNA甲基化和Piwis表達，以調控精子的生成[11]。此外，ρiR-NAs與Piuis結合調控著精母細胞向精細胞轉變[23-24]。本研究結果顯示，與空白組相比，環磷酰胺造模大鼠睪丸Pnldcl、piwill、piwil2、piwil4mRNA的表達水平顯著降低（ Plt;0. 05 ）。表明環磷酰胺所致大鼠精子發生的異常可能與環磷酰胺抑制Pnldc1-Piwils途徑基因的表達有關。

綜上所述，環磷酰胺破壞辜丸細胞結構，使生殖激素合成受阻，導致精子發生異常，其機制可能與Pnldcl-Piwils基因調控有關。

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Effect of Cyclophosphamide on Expression of Pnldcl-PiwilsGeneinRat Testis

JIANG Ping，HE Yanfei，XU Guangpei，ZHA Xiulan，ZUO Ruihua and SUN Chuanbo （Collge of BiologicalandPharmaceutical Engineering，West Anhui University，Lu'an Anhui237ol2，China）

Abstract To investigate the efect of cyclophosphamide on Pnldcl-Piwils mRNA expression in rat testis，12 male Sprague-Dawley rats were divided into control group and model group. The rats in the model group received 50mg/kg body mass of cyclophosphamide by intraperitoneal injection once a week for 8 weeks，while the control group received the same amount of saline. At the end of the experiment，all rats were weighed for body mass and testicular mass，and bloods were collected for reproductive hormone measurement，epididymal tails were collcted for sperm quality testing，and testes were collected for pathological histological and qRT-PCR testing. The results showed that the rats in the model group showed a significant decrease in body mass，testicular mass，organ coefficient，sperm viability，sperm density，and the contents of testosterone，FSH，and LH，and the expresson of Pnldcl ， piwill，piwil2，and piwil4 mRNA，and significant increase in sperm abnormality rate compared with the control group （ .Plt;0..05 ）. Pathological histology revealed a reduction in the number of spermatogenic cells and spermatozoa in the seminiferous tubules，fewer primary spermatocytes，secondary spermatocytes，spermatids，and spermatozoa，as wel as abnormal structures of spermatocytes and spermatozoa.Most spermatozoa lacked tails，and there were numerous vacuoles，chromatin condensation， dark staining，and reduced nuclear size in the testicular interstitium compared to the control group. These results indicate that cyclophosphamide causes testicular damage in rats，and the mechanism may be closely related to the expression of Pnldcl and Piwils mRNA.

Key wordsCyclophosphamide;Testicular injury;Pnldcl;Piwils

Received 2023-10-18 Returned 2024-01-22

Foundation item Anhui Key Research and Development Program（No.202104a06020037）；Horizontal Project-Shucheng Hongsheng Agriculture and Forestry（No. O045o22041）.

First authorJIANG Ping，male，lecturer. Research area：Chinese medicine pharmacology. E-mail： 837264050@qq.com

Corresponding authorSUN Chuanbo， male，associate professor. Research area： pharmacology. E-mail： 42699275@qq.com

（責任編輯：郭柏壽 Responsible editor：GUO Baishou）