基因編輯水稻RPA-CRISPR/Cas12b快速檢測方法的建立

生命科學學院/湖北省豆類[蔬菜]植物工程技術研究中心/湖北省食用豆類自然科技資源中心，武漢 430056；2.中國質量檢驗檢測科學研究院，北京100176；3.三亞中國檢科院生物安全中心，海南三亞572024）

基因編輯是一種能夠對基因組進行定點修飾的基因工程技術[1]。近年來，伴隨著分子生物學技術的飛速發展，成簇規則間隔短回文重復序列相關蛋白系統（clusteredregularlyinterspacedshort palindromic repeats associated protein，CRISPR/Cas）作為一種新興的基因編輯工具，因其具有高效性、精確性和靈活性而被廣泛應用[2-3]。其中，CRISPR/Cas9系統是常用的基因編輯系統，通過在特定基因組位點引入插入、缺失或替換堿基等方式實現基因的特異性改造，從而對目標性狀進行定向改良[4-6]。現階段已出現多種由基因編輯技術定點修飾基因組而獲得的新性狀作物，如耐鹽水稻和耐貯番茄[7-9]、抗除草劑水稻[10-11]、抗白粉病辣椒[12]、高產玉米[13-14]等，但是對其誤用和濫用可能危害生物安全。因此，加強對基因編輯作物及其產品的監管，并開發高靈敏度和高特異性的檢測技術，對保障生物安全具有重要意義。

基因編輯技術在不引入外源DNA的條件下，可在編輯位點處實現堿基插入、缺失、替換或這3種類型的混合突變。這使得基因編輯突變體與親本之間在基因組水平上差異極小，極大地增加了檢測難度。因此，迫切需要研發更精準、高效的檢測技術，實現對基因編輯產品的精準識別與檢測[15-16]。目前，已報道了多種基因編輯產品檢測方法。例如，基于T7核酸內切酶I（T7endo-nuclease I）[17]、Surveyor酶[18]和Cruiser酶[19]等酶切檢測技術，可估計突變效率，但成本較高，對實驗要求嚴格。基于聚合酶鏈式反應（polymer-asechainreaction，PCR）的檢測技術，如臨界退火溫度PCR、TaqMan方法和高分辨率熔解曲線法等[15]，其靈敏度高，且可實現對單堿基突變的檢測，但實驗設計復雜，耗時耗力。

CRISPR/Cas系統是目前常用的一種檢測技術，該系統的效應蛋白Cas12、Cas13和Cas14均被報道具有非特異性切割核酸特性。利用Cas蛋白的反式切割活性，結合人工合成單鏈向導RNA（single guide RNA， sgRNA） 和單鏈DNA（singlestrandedDNA，ssDNA）熒光報告分子；當sgRNA識別并結合目標序列時，系統隨即被激活，同時熒光報告分子被切割，從而釋放出熒光信號，完成對目標序列的檢測[20]。基于CRISPR/Cas系統的這一原理，可以將其與核酸擴增方法如PCR、RPA和環介導等溫擴增技術（loop-me-diated isothermal amplification，LAMP）等相結合，對目標核酸進行預擴增，進而實現對目標片段快速、特異性檢測。在這些核酸擴增方法中，RPA以其操作簡單、反應速度快以及對設備要求低等優點而被廣泛使用[21]。例如，有研究報道了CRISPR/Casl2a結合RPA，在 40min 內即可在1個反應管中完成對基因編輯水稻突變體的現場可視化檢測。該技術顯示出對水稻突變體檢測的巨大潛力，尤其是對單堿基突變體的檢測[22]。此外，利用SpCas9突變體SpRY開發了CRISPR/SpRY檢測平臺[23-24]。該平臺可精準檢測基因編輯水稻樣本的TGW位點，并結合RPA開發了“一管法\"CRISPR/SpRY 測定方法，可在 ¹h 內成功鑒定各種類型的突變，包括插人、缺失和替換，且具有良好的靈敏度。相比其他傳統檢測方法，CRISPR/Cas檢測技術在基因編輯產品檢測領域顯示出顯著的優勢，其不僅能夠實現對基因編輯產品的快速、靈敏、特異檢測，還具備可視化的特點，極大地提高了檢測效率與準確性，具有廣泛的應用前景。

目前CRISPR/Cas12b系統已在多個領域中被廣泛應用，但其在基因編輯水稻檢測方面的研究鮮見報道。鑒于此，本研究以基因編輯水稻為材料，建立基于RPA-CRPSPR/Casl2b快速可視化檢測方法，從而為基因編輯產品研發和有效監管提供技術支撐。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1水稻材料研究所用的野生型（WT）水稻‘日本晴'（japonica），水稻SWEET14基因編輯突變體由中國檢驗檢疫科學研究院植物檢驗與檢疫研究所保存。

1.1.2主要試劑多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒（DP360，天根生化科技有限公司）；RPA恒溫快速擴增試劑盒（基礎型）

（WLB8201KIT，安普未來生物科技有限公司）；DNA提取酚試劑（T0250，北京索萊寶科技有限公司）；無酶無菌水（R1600，北京索萊寶科技有限公司）;SynSorAaCasl2b（C2cl）蛋白（V2.0版本，北京迅識生物科技有限公司）等。

1.2方法

1.2.1水稻基因組提取剪取適量水稻葉片，加入液氮后充分研磨，稱取約 100mg 于 2mL 離心管中，按照多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒（DP360，天根生化科技有限公司）說明書提取樣品DNA，于一 保存備用。

1.2.2RPA 引物、 sgRNA 及ssDNA熒光報告分子設計根據水稻SWEET14基因序列，使用Primer5.O軟件設計RPA引物。CRISPR/Cas9基因編輯突變體水稻SWEET14基因序列及編輯靶位點 （5^′3^′） 如圖1所示，突變靶位點信息見表1。RPA引物、sgRNA及ssDNA熒光報告分子序列均由生工生物工程科技（北京）有限公司合成（表2）。

1.2.3RPA-CRISPR/Casl2b檢測方法RPA擴增體系（共 50μL ：向每個干粉管中加入ABuffer 29μL （主要成分重組酶、DNA聚合酶和單鏈結合蛋白等），RPA上游和下游引物（ Ω_Ω10μmol/L） 各 2μL，ddH₂O 12μL ，待測樣品DNA 模板2.5μL ，最后加入BBuffer 2. 5μL （主要成分為Mg²⁺ ，激活RPA反應），混合均勻后于加熱金屬浴上 39^°C 孵育 30min ，反應結束后對擴增產物進行純化，加入Tris飽和酚/氯仿/異戊醇（ 25： 24：1） 抽提液 1：1 提純，充分混勻，12000r/min 離心 5min ，取 10μL 擴增產物進行 2% 瓊脂糖凝膠電泳確定結果。

CRISPR/Cas12b熒光檢測體系（共 50μL） “AaCasl2b（2.5 μmol/L ）2 μL ，sgRNA（3μmol/L）1μL，10×AaCas12b Buffer 5μL ， ssD-NA熒光報告分子 （10μmol/L）0.5μL ，RPA反應產物 1μL，ddH₂O 補足 50μL ，充分混勻后于加熱金屬浴上 45^°C 反應 25min ，使用便攜式藍光儀 （440～460nm） 進行可視化檢測，當肉眼觀察到溶液發綠色熒光時，即可判定待測樣品為陽性。1.2.4RPA-CRISPR/Casl2b反應條件優化以WT水稻DNA為模板，進行RPA-CRISPR/Cas12b反應條件優化。（1）RPA反應條件優化。根據設計的4條RPA引物篩選特異性引物；設置RPA反應時間分別為 5min?10min.15min?20 min.25min.30min ，其他反應條件保持不變，以 作為陰性對照，篩選RPA最適反應時間。（2）CRISPR/Casl2b反應條件優化。 ① 基于RPA最適反應條件，共設置7個反應溫度，分別為 35^°C?40^°C?45^°C?50^°C?55^°C?60^°C?65^°C 其他反應條件保持不變，以 作為陰性對照，按照“1.2.3\"體系進行反應，結果使用便攜式藍光儀檢測。 ② 固定Cas12b的濃度為100nmol/L不變，分別設置Casl2b與sgRNA的比例為 1：0.5，1：1，1：2，1：5，1：10 ；設置Cas12b與sgRNA濃度均為 篩選最佳的Cas12b與sgRNA的比例和濃度。③ 為篩選ssDNA熒光報告分子最適濃度，分別設置ssDNA熒光報告分子終濃度為 nmol/L.400nmol/L.600nmol/L.800nmol/L.

，在優化后的反應條件下進行。④ 設置6個反應時間，分別是 3min，5min，7 minmin?11minmin ，其他反應條件保持不變，在優化后的反應條件下進行，篩選CRISPR/Cas12b最適反應時間。

1.2.5RPA-CRISPR/Casl2b 靈敏度驗證分別設置樣品DNA 濃度為 200ng/μL，100ng/μL ， ， 1ng/μL 、 、 、1pg/μL，100fg/μL，ddH₂O 作為陰性對照，按照優化后的最適條件進行RPA-CRISPR/Cas12b檢測，結果使用便攜式藍光儀檢測，確定RPA-CRISPR/Cas12b的檢測靈敏度。

1.2.6實際樣品驗證 使用野生型水稻的sgRNA（WT-sgRNA）和突變水稻sgRNA（TB1-sgRNA、TB2-sgRNA），以突變水稻DNA為陽性樣品，設置WT水稻DNA、 為對照，利用建立的RPA-CRISPR/Casl2b方法檢測突變水稻樣品。

2 結果與分析

2.1 RPA引物篩選

以WT水稻樣品DNA為模板，對4條RPA引物進行篩選。結果如圖2所示，對比各泳道擴增產物條帶，其中F3/R3引物相對其他引物擴增效率更高，熒光強度最大。由于Cas12b蛋白識別靶標依賴TTN（N為任意堿基）PAM位點，因而將F3引物第23位堿基 （5^′3^′）C 突變為堿基T，引人Casl2bPAM位點。F3/R3擴增產物經測序，結果與目標序列大小一致，且成功引入Cas12bPAM位點，因此選擇F3/R3進行后續實驗。

2.2 RPA反應時間優化

RPA反應時間優化結果如圖3所示，反應5min 時無擴增條帶，隨著反應進行，擴增條帶亮度逐漸增強。當反應時間達到 25min ，擴增產物熒光強度達到最大，但在 30min 時，擴增產物電泳條帶有拖尾現象。因此，確定RPA最佳反應時間為 25min 。

圖2RPA引物篩選Fig.2RPA primer screening

2.3 RPA-CRISPR/Cas12b反應溫度優化

RPA-CRISPR/Cas12b體系反應溫度的優化結果如圖4所示，當溫度為 35^°C 時，未出現明顯的綠色熒光；隨著反應溫度升高，綠色熒光信號強度逐漸增強，當溫度為 55^°C 時，綠色熒光信號強度達到最大；繼續升高反應溫度，綠色熒光信號強度逐漸減弱。此結果表明溫度過低或過高均會抑制Cas12b的酶切活性。因此，選擇 55^°C 作為反應溫度進行后續試驗。

2.4 Cas12b與sgRNA濃度比例優化

Cas12b與sgRNA濃度比例的優化結果如圖5-A所示，當Casl2b與sgRNA濃度比例為 1：1 時，反應管中綠色熒光信號強度最高；隨著sgRNA濃度比例提高，反應管中綠色熒光信號強度逐漸降低，這表明sgRNA高濃度會抑制Casl2b的剪切效率。Casl2b與sgRNA濃度篩選結果如圖5-B所示，按照Cas12b與sgRNA的濃度比例為 ，設置12.5nmol/L、25nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L 和 200nmol/L共5個濃度，當Casl2b與sgRNA濃度由 12.5nmol/L 逐漸增加至 200nmol/L 時，反應管中綠色熒光強度隨著濃度增加而增強，當濃度為 100nmol/L 時綠色熒光信號強度達到最大。研究結果表明，Cas12b與sgRNA的濃度比例為 1：1 且濃度均為 100nmol/L 時，反應體系達到最優反應條件。

2.5ssDNA熒光報告分子濃度篩選

ssDNA熒光報告分子濃度優化結果如圖6所示，隨著ssDNA熒光報告分子濃度增加，反應管中綠色熒光信號逐漸增強。當ssDNA熒光報告分子終濃度為 600nmol/L 時，反應管中綠色熒光強度達到最大，繼續增加ssDNA熒光報告分子終濃度，綠色熒光強度無顯著變化。因此，本反應體系的ssDNA熒光報告分子最適濃度為600nmol/L 。

2.6 RPA-CRISPR/Cas12b檢測反應時間優化

RPA-CRISPR/Cas12b檢測反應時間優化結果如圖7所示，當反應時間為 3min 時，反應管出現綠色熒光信號，但信號較弱。隨著反應時間增加，反應管中熒光信號強度逐漸增強。當反應達到 11min 時，熒光信號強度達到最大，繼續增加反應時間，綠色熒光強度無顯著變化。因此，本反應體系的最適反應時間為 11min 。

2.7 RPA-CRISPR/Cas12b檢測體系靈敏度

為驗證RPA-CRISPR/Cas12b檢測靈敏度，以WT水稻DNA為模板，分別設置模板濃度為200ng/μL，100ng/μL，10ng/μL，1ng/μL，100 pg/μL，10pg/μL，1pg/μL，100fg/μL，N 表示陰性對照。按照優化后的最佳條件進行RPAC-RISPR/Cas12b檢測。結果如圖8所示，CRISPR/Casl2b的檢測靈敏度可達 1pg/μL 。

2.8 實際樣品驗證

利用建立的RPA-CRISPR/Cas12b檢測方法對CRISPR/Cas9基因編輯突變體水稻進行檢測。如圖9-A所示，當檢測體系中sgRNA為WT-sgRNA時，WT水稻樣品可以觀察到明顯綠色熒光信號，空白對照（CK）以及突變1和突變2基因編輯水稻樣品均未觀察到熒光信號。當檢測體系中sgRNA為TBl-sgRNA時，如圖9-B所示，突變1水稻樣品可以觀察到明顯熒光信號，WT水稻樣品和空白對照（CK）檢測均未觀察到熒光信號。如圖9-C所示，當檢測體系中sgRNA為TB2-sgRNA時，突變2水稻樣品可以觀察到明顯熒光信號，WT水稻樣品和空白對照（CK）檢測均未觀察到熒光信號。表明研究建立的RPA-CRISPR/Cas12b熒光檢測體系能夠準確識別并檢測到單堿基突變的基因編輯水稻樣品，具有較高的特異性。

3討論

RPA-CRISPR/Casl2b檢測方法作為一種新興的分子診斷技術，在農業、食品、醫學檢測等領域備受矚目，該方法結合了重組酶聚合酶擴增（RPA）的快速擴增特性與CRISPR/Cas12b系統的高靈敏性和特異性，從而實現了對目標核酸的高精準檢測，在實際應用中得到廣泛認可。在基因編輯產品的現場快速檢測方面，中國農業科學院生物技術研究所開發了基于CRISPR/Casl2a的便攜式快速可視化檢測生物傳感平臺，將RPA反應試劑放置在反應管底部，CRISPR/Cas12a反應試劑預置在管蓋里，實現了2個反應的一體化檢測， 40min 內完成對基因編輯水稻的檢測，可在藍光下肉眼觀測結果，該平臺基于 Cas12a/ CRISPR/crRNA復合體對靶標序列的準確識別，在檢測少數幾個堿基變異及SV突變時表現出良好的性能，檢測限為12 copies/ μL^[22] 。Wang等[25]將多重RPA與Casl2a 結合，開發了單管檢測系統，使用便攜式藍光儀實現對基因編輯豬的CD163基因和乳鐵蛋白基因的熒光可視化檢測，與傳統PCR檢測相比，可以更準確區分基因編輯豬與野生型豬，在 30min 內，檢測靈敏度可達每個反應 8×10³ copies。在轉基因產品檢測方面，Han等[26]將耐熱Casl2b與LAMP結合開發了轉基因大豆檢測方法，結果表明耐熱Cas12b最適溫度在 60^°C 左右，與LAMP技術的最適反應溫度相一致，能夠檢測到10copies/ μL 的質粒

DNA樣品，在 40min 內檢測到 0.05% 的轉基因含量。與Cas12a最適反應溫度 37°C 相比，CRISPR/Cas12b可在更高的溫度下進行反應，出現非特異剪切的概率更低，對單堿基突變的檢測更為精準[27]。本研究基于Cas12b的這些優點，建立了RPA-CRISPR/Cas12b基因編輯水稻檢測方法。

本研究設置CRISPR/Cas12b反應溫度為35～65^°C ，相鄰溫度 5^°C 梯度。結果表明Cas12b在 40～60°C 均有明顯反應，最適溫度為55°C ，結果與已報道的Cas12b最適反應溫度基本一致。不同提取來源的Cas12b其最適反應溫度也存在一定差異，為確定其更準確的最適反應溫度，可在 50～60^°C 范圍設置更小跨度的溫度梯度，進而確定誤差在 1°C 左右的最適溫度。除了反應溫度， Cas12b/sgRNA 復合體的準確剪切也依賴于PAM位點，Casl2b蛋白識別靶標依賴TTN（N為任意堿基）PAM位點，本研究在RPA反應正向引物上1個堿基C突變為堿基T，引入Cas12bPAM位點，成功檢測到CRISPR/Cas9單堿基基因編輯突變水稻。研究建立的檢測體系整個反應時間不超過 36min ，其中RPA擴增時間為 25min ，CRISPR/Cas12b反應時間為 11min 與傳統PCR檢測方法相比，明顯縮短了檢測時間。本方法檢測靈敏度為 1pg/μL ，與實時熒光定量PCR檢測靈敏度相當[28]。隨著sgRNA與Cas12b濃度比例提高，反應管中綠色熒光信號強度反而逐漸降低，說明過高的sgRNA濃度會對

Cas12b的剪切效率造成干擾，因此，針對sgRNA與Cas12b的濃度比例進一步精細優化有利于提高檢測效率并降低成本。研究使用便攜式藍光儀實現檢測結果可視化，后續可進一步結合CRISPR/Cas12b核酸檢測試紙條，使檢測結果的呈現不依賴儀器設備。

4結論

Casl2b在sgRNA的引導下，能夠精準識別目標序列。研究設計的3條sgRNA可以準確區分單堿基突變的基因編輯水稻與野生型水稻，具有較高的特異性。

研究建立的方法檢測時間不超過 36min ，檢測靈敏度可達 1pg/μL ，具有反應快速、靈敏度高的特點。

研究建立的RPA-CRISPR/Cas12b檢測方法可實現便攜式現場快速可視化檢測。

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Establishment of a Rapid Detection Method for Gene-edited Rice Using RPA-CRISPR/Cas12b

LUO Liang1，2，NIU Mengliang1，QIAN Yike1，FU Wei3 ， WANG Zhi ² ，WANG Mengyu3 ，ZHAO Wenjun ^2，3 and HU Guang2

（1.School of Life Sciences，Jianghan University/Hubei Province Engineering Research Center for Legume Plants/Hubei Province Natural Science Resource Center of Edible Legume，Wuhan 43oo56，China;

2.Chinese Academy of Quality and Inspection amp; Testing，Beijing 1Oo176，China;3.Center for Biosafety， Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Sanya Hainan 572o24，China）

Abstract This study established a rapid visual detection method based on recombinase polymerase amplification （RPA） combined with CRISPR （clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Casl2b （CRISPR-associated protein l2b） for detecting mutation sites in the SWEET14 gene of gene-edited rice，providing technical support for the detection of gene-edited rice.By optimizing the reaction system，the optimal conditions were determined as follows：a reaction temperature of 55°C，a 1：1 molar ratio of Casl2b to sgRNA，and a final concentration of the ssDNA reporter at 600nmol/L Under these conditions，results could be directly observed using a portable blue light transilluminator after 36 minutes of reaction，with a detection sensitivity of 1pg/μL . The system was capable of effectively distinguishing between single-base-mutated gene-edited rice and wild-type rice. The RPACRISPR/Casl2b rapid visual detection system established in this study is not only applicable for detecting single-base mutations in gene-edited rice but also serves as a technical reference for the detection of other gene-edited products.

Key wordsRPA;CRISPR/Casl2b;Rapid detection;Gene-edited;Rice

Received 2024-10-30 Returned 2025-01-13

Foundation item The Key Research and Development Project of Hainan Province （No. ZDYF2024XDNY160）.

First author LUO Liang，female，master student.Research area：gene-edited crop detection methods. E-mail：19006441251@163.com

Corresponding author NIU Mengliang，male，Ph. D，master supervisor. Research area：development of industrialized seedling cultivation and green pest control technologies.E-mail：nfuyuer@163.com HU Guang，male，Ph.D，master supervisor. Research area：development and detection of biotechnology products. E-mail：huguang@caiq. org. cn

[責任編輯：陳婷婷，顧玉蘭 Responsibleeditor：CHEN Tingting，GUYulan