二甲雙胍增強體外擴增γST細胞的抗腫瘤活性

Abstract：Gamma delta （yδ） Tcellsare a subset ofTlymphocytes expressing γδT cell receptors，which possess both innate andadaptiveimmune functions.Theycanrecognizeandkilltumor cells inamanner independentlyofMHCrestriction. However，theirlimitedquantityinvivoandlowefficiencyinvitroexpansionrestricttheirclinicalapplication.Thisstudy utilizedacombinationofcytokinesinterleukin-2（I-2）nterleukin-15（-15），ndtebisphosphonatedugzoledrocacid （Zol） to stimulate γδT cellsand optimize their in vitro expansion strategy.Results demonstrated that thecombination of Zol （5μmol/L） ，IL-2（ 100IU/mL ，andIL-15 Δ_10ng/mL ）achieveda10 ooo-foldexpansion of γδT cells，with a purity of 95.74% among CD3-positivecels.Additionally，metformintreatmentsignificantlyincreasedtheproportionsofcentralmemorycell subsets from 10.75% to 15.85% and effector memory cell subsets from 5.98% to 19.30% in γδT cells ）.Metformin also markedly upregulated the expression of anti-tumor factors interferon ?γ （IFN-γ） ， granzyme B （GZMB），and perforin in γδT cels，promotedexosomesecretion，andeancedcytotoxicactivity.Thisstudyprovidesanovelstrategyforinvitropansion and functional optimization of γδT cells，laying the foundation for their application in adoptive immunotherapy for tumors.

Key words： γδT cells; antitumor activity; metformin; anti-tumor factor; adoptive immunotherapy （ActaLaser Biology Sinica，2025，34（3）：229-238）

γδT 細胞是具有 γ 鏈和8鏈組成的T細胞受體（Tcellreceptor，TCR）表達的T細胞亞群，在外周血的CD3 陽性細胞里所占比例為 5%～10%^[1-3] 。與ααααααααααααααααααααααααααααααβαααα 細胞相似，胸腺內 γδT 細胞的發育需要重組激活基因對其TCRCDR3區的V（D）J片段進行體細胞重排[4]。人 γδTCR 由兩個不同的基因片段編碼：位于7號染色體上的TRG基因片段編碼6個功能性Vγ基因，TRD基因片段嵌人14號染色體的TRA位點，編碼8個功能性的 Vδ 基因[5]。根據Vδ鏈的特征，γ8T細胞分為兩大子集： Vδ2⁺ 亞群和非 Vδ2⁺ 亞群。非 Vδ2⁺ 亞群主要存在于皮膚、腸道和生殖系統等上皮組織區域中[6]。在外周血中的γδT細胞絕大多數表達半不變的磷酸抗原反應性TCRVγ9V82，由于其極容易獲得所以最早被關注用于臨床研究[5]。

在過繼性免疫細胞治療中， γδT 細胞是具有巨大潛力的一種免疫細胞[7]。 γδT 細胞不僅能夠呈遞抗原并觸發 αβT 細胞和樹突狀細胞的成熟，還可通過高表達顆粒酶B（granzymeB，GZMB）和穿孔素（perforin）直接殺傷腫瘤細胞，同時激活NK細胞受體，增強抗腫瘤應答[8]。不同于經典的 αβT 細胞，γ8T細胞不受主要組織相容性復合體（majorhistocompatibilitycomplex，MHC）限制即可識別抗原并發揮細胞毒性作用，可以作為同種異體移植物輸注，因此在腫瘤免疫治療中具有重要潛力[9]。但γ8T細胞在人體內占比相對較少，數量的限制減弱了其殺傷腫瘤的能力。 γδT 細胞主要分布在外周血和消化系統、呼吸系統黏膜中，末梢血中也有少量的γ8T細胞[10]。從外周血中提取γδT細胞，并在體外進行大量擴增獲得高純度、高數量的γ8T細胞回輸給腫瘤患者進行過繼性腫瘤免疫治療是近年來的一個研究熱點。

在抗原刺激下， γδT 淋巴細胞從幼稚細胞逐漸成熟為增殖能力強、效應功能低的中央記憶型（central memory，TCM）細胞（CD62L+CD45RA），在T細胞抗原進一步的刺激下，它們可能成熟為效應記憶型（effector-memory，TEM）細胞（CD62LCD45RA），最后驅動到表達終末分化CD45RA的終末分化效應記憶型（terminallydifferentiatedeffectormemory，TEMRA）細胞[I-3]。目前腫瘤過繼性細胞療法，幾乎用的都是TEM型細胞，但是大多數TEM細胞輸入人體后只可存活兩周，療效難以維持[14]與TEM細胞相比，TCM細胞回輸體內后可長期存活并能夠自我復制，同時它被腫瘤細胞激活后能轉化為TEM型細胞并持續發揮直接殺傷腫瘤細胞的作用[15]。所以，本研究希望尋求體外誘導培養TCM比例更高的γ8T細胞的方案。

病毒感染的細胞和癌細胞通常會通過羥基甲基戊二酰輔酶還原酶上調異戊烯焦磷酸（isopentenylpyrophosphate，IPP）[1-17]。這種非肽二磷酸代謝物“磷酸抗原\"（pAgs）特異性結合細胞表面蛋白BTN2A1/3A1的B30.2結構域，進而激活 TCRV_Y9Vδ2 細胞的反應[18]。因此， v_Y⁹v_δ2T 細胞不是通過檢測病原體特異性或癌細胞特異性抗原發揮免疫功能，而是通過細胞表面的BTN2A1/3A1蛋白識別細胞感染或通過AMP活化蛋白激酶（AMP-activatedproteinkinase，AMPK）感應ATP水平識別癌細胞代謝危機進而發揮免疫功能[19]。有研究表明，白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）是效應T細胞發育的關鍵因子[20]，白細胞介素-15（interleukin-15，IL-15）可以促進γ8T細胞在體外大量增殖[21]，所以我們嘗試使用IL-2、IL-15和雙麟酸藥物唑來麟酸（zoledronicacid，Zol）聯合擴增高純度的γ8T細胞。

二甲雙胍（metformin，Met）作為一種一線降糖藥物，一般用于治療2型糖尿病[22]，它主要通過降低肝臟葡萄糖生成和提高肌肉組織、脂肪組織對葡萄糖的攝取利用發揮作用。二甲雙胍一直被稱為是“神藥”，它不僅能治療糖尿病、降低血糖、改善血脂代謝，還具有一定的抗腫瘤作用[23-24]。二甲雙胍可通過激活AMPK途徑，引發腫瘤抑制因子LKB-1的激活，從而抑制mTOR途徑，減少腫瘤細胞增殖[25-26]。有研究發現，二甲雙胍可促進記憶性T細胞的分化，提高其抗腫瘤功能[27]。然而，二甲雙胍對γδT細胞擴增及抗腫瘤功能的影響尚不明確。因此，本研究探討了二甲雙胍對體外誘導γδT細胞擴增及其抗腫瘤功能的影響，旨在優化γδT細胞體外擴增策略，為其在腫瘤免疫治療中的應用提供新思路。

1材料與方法

1.1試驗材料

人外周血淋巴細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司，紅細胞裂解液購自上海生工生物工程有限公司。人肝癌細胞MHCC97H由本實驗室凍存保存。

RPMI1640培養基（含谷氨酰胺，不含硝酸鈣）DMEM/F12培養基和DMEM高糖培養基（含谷氨酰胺、丙酮酸鈉）購自Gibco公司，胎牛血清（fetalbovineserum，FBS）購自CellMax公司，噻唑藍（MTT）、二甲基亞礬、青霉素和鏈霉素均購自上海生工生物工程有限公司。ⅡL-2購自北京同立海源生物科技有限公司，Zol購自美國Selleck生物科技有限公司，L-15重組蛋白購自武漢云克隆科技有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1γ8T細胞的分離和擴增純化

從健康的供體獲取一定量的外周血與無菌磷酸鹽緩沖液（phosphatebufferedsaline，PBS）按1：1體積比混勻后獲得稀釋血樣。稀釋血樣緩慢加在淋巴細胞分離液Ficoll上層，稀釋血樣與分離液的比例為1：1。 800g 離心 18min ，去除大部分上層液體，移液槍吸取中間白色云霧層細胞，加入5倍體積PBS混勻，再用 800g 離心 10min ，保留沉淀細胞，再次使用PBS洗滌。棄上清，加入2倍體積的紅細胞裂解液，室溫孵育 5min 。加入 2mL PBS， 800g 離心10min ，洗滌細胞兩次，即獲得外周血單個核細胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）。進行細胞計數后將其加至含有 10% FBS以及擴增必需的含有Zol、IL-2和IL-15的RPMI1640培養基中，置于37^°C ） 5%CO₂ 培養箱中培養；每2＼～3d更換一半培養液，添加新的含Zol、IL-2和IL-15的培養液，或重新更換新的含有Zol、IL-2和IL-15的培養液，培養11d收獲γδT細胞。細胞擴增倍數計算公式：擴增倍數 Σ=Σ （擴增后總細胞數 × 擴增后 γδT 細胞純度）/（擴增前總細胞數 x 擴增前γδT細胞純度）。

1.2.2 流式細胞術分析

離心 800g，10min） 收集細胞，用PBS清洗兩次，檢測細胞表面蛋白時則用 4% 多聚甲醛固定細胞 10～15min ，離心去除后用PBS清洗兩次，再用含 1% FBS的PBS封閉 15～20min ，PBS清洗兩次。然后用 100μL PBS重懸細胞，加人適量的熒光素標記抗體，抗體量根據細胞的數量而定。 1×10⁶ 個細胞加人 5μL 抗體，充分混勻， 4^°C 避光孵育30～60min 。離心去除上清，用PBS清洗兩次，用適量PBS重懸細胞后即可上機檢測。使用MoFloAstriosEQ流式細胞儀進行流式細胞分析（Beckman-Coulter，USA），使用FlowJov10.8軟件進行數據分析和可視化。

1.2.3 MTT試驗

將培養至對數生長期的MHCC97H細胞，植入96孔板，設置對照組和試驗組，每組設6個復孔。待細胞貼壁后，對照組加入 100μL 細胞培養液，試驗組加入 100μL 含有5000個 γδT 細胞的細胞懸液，即效靶細胞比例為10：1，共培養 12h ，接著棄去培養液，PBS清洗2～3次，每孔加入 10μL MTT溶液（ 5mg/mL ，即 0.5% MTT）和 90μL 無血清無雙抗的DMEM培養基，繼續培養 4～6h 。棄上清，加入100μL 二甲基亞砜，在搖床上輕微震蕩 10min 使結晶充分溶解，在酶聯免疫檢測儀上于 490nm 處測量光密度值。

1.2.4實時熒光定量逆轉錄PCR（RT-qPCR）分析

使用Trizol試劑（賽默飛世爾科技公司）從人肝癌組織中提取總RNA，使用Takara逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。

根據VazymeSYBRqPCR試劑盒說明書配制反應體系，每個樣品設置4個平行反應，根據說明書設置擴增曲線和熔解曲線反應程序。RT-qPCR引物列于表1中。得到擴增階段Ct值，使用 2^-ΔΔCt 計算基因與對照組的相對表達值，計算并作圖分析。

1.2.5 外泌體分離與蛋白質印跡

體外分離培養 γδT 細胞8d后，在培養基中加人 2mmol/L 的二甲雙胍處理 12h 。為了排除培養基中添加的血清影響外泌體檢測，先離心去除原培養基，使用無血清的DMEM/F12培養基培養γδT細胞 48h ，再進行外泌體分離。使用超速離心法提取外泌體，先使用 800g 離心 10min 去除細胞，收集培養基; 2000g 離心 10min ，去除死細胞，留上清； 10000g 離心 30min ，去除細胞碎片，留上清；用0.22μm 過濾器過濾上清液以清除細胞碎片，使用超速離心機 100000g 離心 70min 小心去除上清，再用PBS重懸后 100000g 離心，得到潔凈的外泌體，用 20μL PBS重懸沉淀， -80^°C 保存備用。

在外泌體中加入適量的細胞裂解液，冰上放置20～30min ，加入 6×SDS 上樣緩沖液， 105°C 金屬浴變性 10min ，進行 12% 聚丙烯酰胺凝膠電泳（恒壓 80V30min ，后調整為 120V ）。電泳結束后，采用濕轉法（100V，60min）將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidenefluoride，PVDF）。封閉： 5% 脫脂牛奶室溫封閉1h；一抗孵育：抗CD63單克隆抗體（武漢三鷹，貨號67605-1-Ig， 1：5000 稀釋），抗CD9單克隆抗體（武漢三鷹，貨號82105-1-RR，1：5000 稀釋） 4^°C 孵育過夜；二抗孵育：HRP標記山羊抗小鼠IgG（ 1：10000 稀釋），室溫孵育1h；最后進行增強化學發光（enhancedchemiluminescence，ECL）顯影。

1.2.6 統計分析方法

使用Image J_? GraphPad軟件進行統計分析，數據來自至少3個獨立試驗的平均值 ± 標準差。兩組和兩組以上的比較分別用獨立樣本 t 檢驗和單因素方差分析檢驗。當 Plt;0.05 時，結果被認為具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1γδT細胞的體外擴增方案優化

從健康人體的外周血中梯度離心提取出PBMC，在培養基中添加刺激γ8T細胞擴增生長的Zol和細胞因子（IL-2、IL-15）誘導γδT細胞的擴增和活化。在光學倒置顯微鏡下觀察細胞的大小、形態，檢驗細胞的活性和狀態?；瞀?T細胞為外表光滑、形狀規則、大小均一、發亮的圓球狀，體外培養5d以后細胞會聚集結團（圖1a），18d后細胞活力逐漸減小，細胞在顯微鏡下顏色暗淡，細胞形態變小且形狀不規則。有研究表明，使用IL-2和Zol體外誘導培養γ8T細胞，第14天時擴增倍數只有450＼～1200倍[28-29]。因此，為了盡可能縮短誘導培養周期，進一步探究體外高效誘導 γδT 細胞擴增的方案，我們使用不同濃度的細胞因子誘導同一批相同數量（ 1× 10⁵ 個）的PBMC細胞，發現同時使用 Zol（5μmolL） ）IL-2（ 100IU/mL ）IL-15（ 10ng/mL ）時擴增的效率最高?；诹魇郊毎麅x計數檢測第11天時細胞數量達到了 1×10⁹ 個，細胞擴增數量達到了10000倍，γ8T細胞在CD3陽性中的比例為 95.74% （圖1b、1e）。這種培養方案擴增倍數優于僅使用IL-2和Zol誘導的 γδT 細胞[30-31]。為方便后續試驗統計，后續都使用最優方案誘導培養γ8T細胞。

使用上述培養方案誘導培養 γδT 細胞，第3天時，在培養基中加入 2mmol/L 的二甲雙胍處理48h ，流式細胞術分析表明，與未加入二甲雙胍的γδT細胞相比，經過二甲雙胍處理的 γδT 細胞在CD3陽性細胞中的占比從 81.90% 提升到 97.67% （ Plt;0.01 ）（圖1c）。記憶性T細胞在CD3陽性細胞的比例從 16.73% 提高到 35.15% ，其中TCM（CD62L⁺CD45RA^-） 和TEM（CD62LCD45RA）比例都有明顯增加（圖1d、1f），TCM的比例從 10.75% 提高到 15.85% ，TEM的比例從 5.98% 提高到 19.30% （圖1d、1g）。這些試驗結果表明，二甲雙胍增強了γδT 細胞的記憶表型分化。

2.2二甲雙胍處理 γδT 細胞增強了其抗腫瘤殺傷作用

為探究二甲雙胍是否影響γ8T細胞的殺傷腫瘤的能力，體外誘導 γδT 細胞培養5d后，我們用2mmol/L 的二甲雙胍預處理γδT細胞 48h ，離心去除含二甲雙胍的RPMI1640培養基，將經二甲雙胍預處理過的 γδT 細胞與MHCC97H細胞共培養12h 。通過流式細胞術檢測發現，與未經二甲雙胍處理的γδT細胞相比，經二甲雙胍處理的 γδT 細胞對MHCC97H細胞的殺傷率從 28.8% 提高到 39.9% （圖2a＼～2b）；MTT試驗中γδT細胞對MHCC97H細胞的殺傷率從 40.8% 提高到 52.9% （圖2c）。試驗證明，二甲雙胍預處理γδT細胞增強了γδT細胞的細胞毒性，推測可能是由于激活了部分TEM型細胞所導致的。

（a）顯微鏡下γδT細胞體外擴增5d的狀態；（b）最佳培養策略下CD3陽性細胞群中 γδT 細胞的純度；（c）流式細胞術檢測二甲雙胍對γST細胞體外擴增純度的影響；（d）流式細胞術檢測二甲雙胍對γδT細胞的記憶表型分化的影響；（e）二甲雙胍對γδT細胞體外擴增純度的影響的統計圖；（f）二甲雙胍對γδT細胞體外擴增中央記憶細胞分化影響的統計圖； （g） 二甲雙胍對y8T細胞體外擴增效應記憶細胞分化影響的統計圖。 ^**Plt;0.01 ^**Plt;0.001 。

（a）Microscopic observation of the in vitro expansion status of γδT cellsafter 5d （b）Purityof γδT cells in the CD3-positive cell population under optimal culture conditions; （c）Flow cytometry analysis of the effect of metformin on the purity of γδT cells during in vitro expansion; （d） Flow cytometryanalysis of the effect of metformin on memory phenotype differentiation of γδT cells;（e） Statistical analysis of metformin's impact on the purity of γδT celsduringinvitroexpasio;（f）Statisticalchartoftheefectofmetformiontediferentiatioofentralmemorycelsdurngin vitro expansion of γδT cels;（g）Statisticalchartoftheeffectofmetformnonthediferentiationofeectormemorycellsduringinvitroexpansionof γδT cells. ^\"Plt;0.01 ^**Plt;0.001 ：

2.3二甲雙胍增強γδT細胞抗腫瘤因子的表達

為了研究二甲雙胍促進 γδT 細胞抗腫瘤相關機制，我們用二甲雙胍預處理 γδT 細胞后檢測其IFN- ?γ 的表達水平量。IFN-γ是γ8T細胞對腫瘤細胞殺傷性的一個重要標志。通過流式細胞術檢測γδT 細胞的IFN- ?γ 這項指標，結果發現，二甲雙胍處理后的 γδT 細胞 IFN-γ 的表達上調，從 22.5% 提高到 32.8% ，表明二甲雙胍可以提高IFN-γ的表達（圖3a、3c）。與MHCC97H細胞共培養后，二甲雙胍預處理的γ8T細胞的IFN- ?γ 的表達水平進一步提高至 83.4% （圖3b＼～3c）。隨后，通過RT-qPCR技術驗證 γδT 細胞中發揮腫瘤殺傷作用的相關細胞因子GZMB、perforin的mRNA表達水平變化，發現二甲雙胍可以提升GZMB、perforin的mRNA表達水平（圖3d）。接著，取γδT細胞和經二甲雙胍處理72h 的γ8T細胞的上清，經酶聯免疫吸附試驗檢測分析，二甲雙胍的處理會增加γδT細胞的TNF- ??a 的分泌（圖3e）。進一步，我們使用超速離心法提取γδT 細胞的外泌體。外泌體提取后需要進行表征，在透射電鏡下通過負染直接觀察外泌體形態結構，提取物為茶杯狀形態的小囊泡，說明外泌體提取純度較高（圖3f）。通過蛋白質印跡檢測外泌體的標志蛋白CD63和CD9相對表達量，發現經過二甲雙胍處理 12h 以后的γ8T細胞分泌的外泌體量顯著升高（圖3g、3h）。為了研究外泌體是否能在體外發揮抗腫瘤作用，我們將經過和未經過二甲雙胍處理的γ8T細胞外泌體分別與MHCC97H細胞共培養 12h ，發現經過二甲雙胍處理以后外泌體的殺傷力顯著提高（圖3i）。這些結果表明，二甲雙胍可以增強γ8T細胞分泌發揮腫瘤殺傷作用的相關細胞因子的能力，從而提高γ8T細胞對抗腫瘤的作用。

（a）流式細胞術檢測二甲雙胍對y8T細胞表達抗腫瘤因子IFN-γ的影響；（b）流式細胞術檢測γ8T細胞與MHCC97H細胞共培養對抗腫瘤因子IFN-γ表達的影響；（c）二甲雙胍和MHCC97H細胞對γ8T細胞表達抗腫瘤因子 IFN_-γ 的影響統計圖；（d）RT-qPCR檢測二甲雙胍處理對γδT細胞GZMB、perforin表達量的影響（ n=4 ；（e）酶聯免疫吸附試驗檢測二甲雙胍處理對γST細胞TNF- σ_?a 表達的影響 （n=4） ；（f）透射電鏡觀察外泌體形態； （g） 蛋白質印跡檢測外泌體的標志蛋白CD63和CD9相對表達量； η（h） 蛋白質印跡檢測外泌體的標志蛋白CD63和CD9相對表達量統計圖 （n=3 ）；（i）經過和未經過二甲雙胍處理后 γδT 細胞的外泌體與MHCC97H細胞共培養 12h ，檢測細胞存活率 （n=4） 。 ^*Plt;0.05 ^**Plt;0.01 ^**Plt;0.001， 。

（a）Flow cytometric analysis of metformin’s effect on IFN-γ production in γδT cells;（b）Flow cytometric evaluation of IFN-γ expression in γδT cells co-cultured withMHCC97Hcels;（c）QuantitativeanalysisofcombinedefectsofmetforinandMHCC97HcellsonIN-exprssioin γδT cells; （d） RT-qPCR assessment of GZMB and perforin expression in metformin-treated γδTcells （n=4） ； （e）ELISA-based detection of TNF- ??a secretion bymetformin-treated γδT cells （n=4） ;（f）Observationof extracellular vesicle morphologyusing transmission electron microscopy;（g）Western blot analysisofrelatieexpevesofexoalkpesd;QatiiealysofCepress Western blot （n=3） ; （i）CellviabilityofMHCC97Hcelsafter12hco-culture with exosomes derived from metformin-treatedoruntreated γδT cells （n=4） ?_Plt;0.05 ^*Plt;0.01 ^**Plt;0.001 ，

3 討論

盡管基于 aβββ 細胞的免疫療法革新了部分癌癥的治療模式[32-33]，但臨床數據顯示，有 50% 的實體瘤患者因惡性腫瘤固有的檢查點抑制劑耐藥機制，仍表現出對現有免疫治療方案的臨床應答率低下[34-35]。個性化治療嵌合抗原受體（chimeric antigenreceptor，CAR）-T細胞療法在癌癥治療領域引起了人們的興趣[36]。其工作原理是修飾患者的T細胞，使其在表面表達CAR蛋白，從而誘導它們識別和破壞癌細胞[37]。CAR-T細胞療法在治療血液腫瘤方面取得了一些成功，但它在治療實體瘤方面仍面臨許多挑戰，如抗原選擇、耐受性和安全性[38]。此外，CAR-T細胞療法的嚴重急性不良反應也讓人們放慢了腳步去開發這種昂貴的治療方法[39]。令人欣喜的是，生物學研究表明， γδT 細胞是一種更適合用作免疫治療的細胞。與傳統的αβT細胞相比，γδT細胞的優勢在于它們不依賴MHCI類介導的抗原呈遞，這使其可用于MHCI缺失的腫瘤治療[40]，并且更適用于同種異體細胞治療。此外， γδT 細胞的抗腫瘤功能不依賴于體細胞突變負荷，因此在比黑色素瘤或肺癌等突變程度低得多的癌癥中仍能發揮有效作用[41]。另一方面，γδT細胞相比NK細胞也具有優勢，如其更強的腫瘤浸潤能力以及關鍵抑制分子（如殺傷抑制受體）的低表達，而這些抑制分子會干擾NK細胞的激活[42]。事實上， γδT 細胞可被視為結合了“兩全其美”的特性，即同時具備αβT細胞和NK細胞的抗腫瘤能力，能夠同時利用TCR和NK細胞受體，從而增強對癌癥的靶向作用及廣度[43]。

為了更進一步探索γ8T細胞在細胞治療方向的應用，我們急需一種能高效體外誘導具有抗腫瘤活力的γδT細胞的方法。IL-2和Zol是最常見的用于對PBMC刺激選擇性擴增 $＼mathrm { v } _ { ＼ ? } ＼mathrm { v } _ { ? } 9 ＼mathrm { v } _ { ? } ＼delta 2 ? ＼mathrm { T } ?$ 細胞的方案。Vγ9Vδ2T 細胞是細胞免疫治療中經常使用的亞型，表現出釋放穿孔素、顆粒酶和其他溶解細胞因子的能力，同時還分泌IFN-γ 和 TNF- ?a^[44-45] 。此外，它們間接調節NK細胞、B細胞、 CD4⁺ CD8⁺ 和其他免疫細胞群的活性，從而有效消除腫瘤[46-47]。本研究中，我們發現IL-2、IL-15和Zo1共刺激 γδT 細胞可縮短獲得較高純度和記憶性γδT細胞的時間，擴增效率最高可達10000倍。IL-2和IL-15在調節適應性免疫（促進T細胞增殖和誘導T淋巴細胞毒性）和先天免疫（激活自然殺傷細胞）方面具有許多相似的功能[48]。不同的是，IL-15主要負責維持長期的、高親和力的T細胞應答，而IL-2具有的功能是活化T細胞，促進調節性T細胞分化以及活化誘導的細胞死亡[49-50]。Zol可抑制甲羥戊酸途徑限速酶法尼基焦磷酸合成酶（farnesyl pyrophosphate synthase，FPP）發揮作用，會導致FPP上游代謝物IPP濃度增加，γδT細胞識別IPP后，將激活γδT細胞的增殖[51]。同時我們發現，經過二甲雙胍處理后， γδT 細胞純度得到了進一步的提高，從而促進了記憶型γδT細胞的分化，并且會激活γ8T細胞的細胞毒性。通過試驗我們驗證了二甲雙胍預處理γδT細胞會增加IFN-γ、GZMB和perforin的表達，同時促進γ8T細胞分泌更多的外泌體，增加了 γδT 細胞對腫瘤的殺傷力。雖然初步證據表明，二甲雙胍對γ8T細胞具有調節作用，但這種免疫調節作用的分子途徑需要進一步的試驗探索。

總之，上述研究證明了在體外誘導培養γδT細胞時，二甲雙胍有促進γ8T細胞富集和激活其抗腫瘤的新作用。本研究對過繼免疫治療時γ8T細胞的體外擴增和功能增強及持續殺傷作用和外泌體免疫治療策略提供了新思路，具有重要的科研價值與臨床應用前景。

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《激光生物學報》征訂啟事

《激光生物學報》創刊于1992年，是由中國科學技術協會主管，中國遺傳學會和湖南師范大學主辦，激光生物學報雜志社編輯、出版的學術性刊物，已逐漸發行到中國、美國、英國、日本、俄羅斯、法國、德國、意大利、奧地利、瑞典諸國。雙月刊，大16開，96頁，每逢雙月底出版發行，國外發行代號：DK43001，國內發行代號：42-194。

報道內容：以激光（光）生物學、生物光子學、激光（光）生物醫學（含光子中醫學、光動力療法、激光整形美容）輻射生物學（含激光育種、輻射育種、空間育種等）離子束生物工程及其相關的激光生物技術（含微束照射技術、光鑷技術、成像技術、光譜技術、共聚焦掃描顯微技術、細胞分流技術等）儀器研制諸領域的學術論文，適量兼登遺傳學、生物物理學、生物化學、醫學、農學等基礎學科方面的學術論文。

本刊欄目：研究進展、研究論文、信息等。

讀者對象：對從事上述領域的研究人員、高等院校教師、研究生、醫務工作者、育種工作者、激光儀器研制者等，均有裨益。

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