關鍵詞:西花薊馬;花粉;消化酶中圖分類號:Q968.1 文獻標識碼:A文章編號:1008-0457(2025)03-0010-07國際DOI編碼:10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2025.03.002
西花馬Frankliniellaoccidentalis是世界性的重要農業害蟲,自2003年夏季在北京部分保護地首次發現其為害以來,已迅速蔓延至我國多個地區,并逐漸演變成為害最為嚴重的害蟲之—[1-2]西花薊馬不僅取食植物葉片,還取食花粉花蜜。與葉片相比,花粉營養更加豐富[34],因此,花粉對西花薊馬的生長發育、存活、繁殖和種群擴增均有明顯的促進作用[47]。在植物的葉片上添加花粉后,西花薊馬的發育歷期縮短,產卵量明顯增加[5-7,但不同花粉的作用程度不同[7-8],如松花粉是西花薊馬的嗜食花粉,油菜花粉是非嗜食花粉,松花粉的作用優于油菜花粉[7]
消化酶在分解、吸收及利用蛋白質、脂肪及碳水化合物等營養物質的過程中扮演著至關重要的角色,消化酶主要包含淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等。植食性昆蟲取食不同食物后消化酶發生明顯的變化,西花薊馬消化酶活性的變化和取食寄主的嗜食性有關。取食玫瑰花朵(含花粉花蜜)后西花薊馬 α -淀粉酶和胰蛋白酶的活性顯著高于取食玫瑰花瓣(不含花粉花蜜)5」。消化酶的活性變化還與消化酶的種類有關,如取食嗜食的黃瓜葉片時,西花薊馬淀粉酶活性顯著高于取食非嗜食辣椒葉片,但取食辣椒時西花薊馬脂肪酶活性顯著高于取食黃瓜[10]。西花薊馬2齡若蟲取食嗜食寄主菜豆葉片時, α -淀粉酶活性顯著高于取食非嗜食寄主蠶豆葉片,但類胰蛋白酶的活性則為取食蠶豆葉片時更高[1]。不同食物對西花薊馬消化酶基因的表達量具有顯著的調節作用。西花薊馬成蟲和2齡若蟲從菜豆豆莢轉換到菜豆植株后,淀粉酶基因FoAMY-1的表達量受到明顯的抑制,但轉換到蠶豆植株后,其表達量顯著上調[\"]。胰蛋白酶基因CL4520.Contigl的表達量也有類似的結果[12]
已有研究報道,花粉對西花薊馬的生長發育及繁殖有促進效應[4-8]。然而,西花薊馬取食具有不同嗜食性的花粉后,其消化酶活性的相應變化尚不明確。鑒于花粉通常作為西花薊馬的輔助食物來源,本研究進一步探討了西花薊馬在僅取食花粉與同時取食花粉及植物葉片時,消化酶活性變化及其基因表達量的差異。研究選取了西花薊馬非嗜食的油菜花粉和嗜食的松花粉作為研究對象,分別考察了西花薊馬2齡若蟲取食油菜花粉、松花粉、油菜花粉與菜豆葉片混合食物、松花粉與菜豆葉片混合食物4種不同食物條件下,其消化酶活性及其基因表達量的變化情況。本研究結果為揭示不同食物對西花薊馬消化酶活性及基因表達影響的作用機制提供基礎數據。
1 材料和方法
1.1 供試材料
西花薊馬:采集于省市花溪區蔬菜基地,在實驗室用菜豆豆莢飼養于人工氣候箱:溫度(25±1)eC 、濕度( 75%±5% )、光周期
。菜豆豆莢購買于省市花溪區農貿市場,使用前用 0.5% 次氯酸鈉浸泡 15min 去除農藥殘留,然后用清水反復沖洗至無味,晾干后備用。
松花粉和油菜花粉:購買于云南省騰沖市益爾原生態養蜂場,在烘箱內(WGLL-125BE系列電熱鼓風干燥箱,天津泰勒斯儀器有限公司) 25°C 烘干, 4°C 密封保存備用。
菜豆植株:菜豆Phaseolusvulgaris品種為金束鹿泰國地豆王(河北省辛集市盛農種子公司)。挑選顆粒飽滿的菜豆種子,將每粒種子單獨種植于裝有滅菌營養土的營養缽內,置于人工氣候室內,溫度( 25±1 ) C 、濕度( 70%±5% )光周期 14h:10h ,待長至3對真葉時(出芽后約13d)備用。
1. 2 試驗方法
花粉處理:分別將 0.1g 油菜花粉或 0.1g 松 花粉(保證薊馬有足夠量的花粉取食)均勻撒入養 蟲盒(長 20.6cm 寬 13.4cm 高 9.3cm )內。
花粉 + 菜豆葉片處理:將健康菜豆植株的第一對真葉取下,用濕潤的棉花包裹葉柄防止葉片萎蔫,放至養蟲盒(規格同上)內,將 0.1g 松花粉或油菜花粉均勻撒在葉片上,每一葉片約 0.05g 花粉。
西花薊馬的取樣:以取食量大并嚴重為害的西花薊馬2齡若蟲為初始蟲源。將在菜豆豆莢長期飼養的西花薊馬2齡若蟲分別轉移至放有油菜花粉(RP)、松花粉(PP)、油菜花粉 + 菜豆葉片( RP+ KL)、松花粉 + 菜豆葉片( PP+KL )的養蟲盒內,每盒大約3000頭薊馬,1個盒子的薊馬為1個重復,共設置3個生物學重復。分別待薊馬取食 6、12、24 和 48h 后取樣,每次取100頭西花薊馬放人貼有標簽的 2.0mL 離心管中,立即用液氮冷凍并放置于 -80°C 冰箱保存,用于消化酶活性和基因表達量的測定。
西花薊馬消化酶活性的測定: α -淀粉酶、胰凝乳蛋白酶和脂肪酶活性的測定分別根據蘇州科銘生物技術有限公司生產的試劑盒說明書進行操作。
西花薊馬消化酶基因表達量的測定:取不同處理的西花薊馬樣品,通過Eastep Super Total RNAExtractionKit試劑盒來提取西花薊馬總RNA;使用HiFiScriptgDNA Removal cDNA SynthesisKit試劑盒,以西花薊馬總RNA為模板進行第一鏈cDNA的合成。
引物設計:以 EF–Ia (GenBank登錄號:AB277244.1)作為內參基因,引物由生工生物工程上海股份有限公司合成。西花薊馬 α -淀粉酶基因FoAMY-1特異性引物設計參照 Zhi等[\"]。胰凝乳蛋白酶基因FoTRY(GenBank登錄號:LOC113211721)和脂肪酶基因FoLip(GenBank登錄號:LOC113207469)的基因序列基于NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得,使用NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對這些序列進行初步鑒定,然后利用NCBI在線工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設計目的基因逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)引物(表1)。
熒光定量PCR檢測:通過Q1000熒光定量PCR系統(Bio-rad公司),參照FastStart EssentialDNAGreenMaster熒光染料(Roche公司)說明書進行RT-qPCR測定。反應體系( 21μL \" 2μL cDNA,上/下游引物各 1μL ,無核酸酶水 7μL,10μL GreenMaster Mix 。反應程序: 95°C 預變性 10min ,95 C 變性 30s ,退火30s(退火溫度參考每對引物合成數據),最后延伸 30s ,共40個循環; 65~95°C 生成熔解曲線。參考Zheng等[13以 EF-la (GenBank登錄號:AB277244.1)為內參基因,根據 2-ΔΔct 相對定量法計算目的基因相對表達量[14] 。
1.3 數據處理與分析
使用MicrosoftExcel2019和SPSSv.22.0統計軟件進行數據處理,采用單因素方差分析(One-wayANOVA)和Tukey檢驗( Plt;0.05, 分析西花薊馬取食同一食物不同時間以及取食不同食物同一時間下消化酶活性和基因表達量的差異顯著性。
2 結果與分析
2.1不同食物對西花薊馬消化酶活性的影響
2.1.1不同食物對西花薊馬 α -淀粉酶活性的影響不同食物對西花薊馬2齡若蟲 α -淀粉酶有明顯的影響(表2)。在 6h 時,取食RP、PP和 PP+ KL的西花薊馬 α -淀粉酶活性差異不顯著,但都顯著高于取食 RP+KL 。在 12h 時,取食4種食物的α -淀粉酶活性差異不顯著。在 24h 時,單獨取食2 種花粉的西花薊馬體內 α -淀粉酶活性明顯高于取食花粉 + 葉片。在 48h 時,西花薊馬取食PP和PP+KL 的 α -淀粉酶活性均顯著高于取食RP和RP+KL 。
取食同一食物的西花薊馬在不同時間下 α -淀粉酶活性也有差異。取食RP和PP的 α -淀粉酶活性均在 24h 最高;取食 RP+KL 的 α -淀粉酶活性在 12h 最高, 6h 最低;而取食 PP+KL 的 α -淀粉酶活性在 6h 最高, 24h 最低。
2.1.2不同食物對西花薊馬胰凝乳蛋白酶活性的影響
不同食物對西花薊馬2齡若蟲胰凝乳蛋白酶活性有明顯的影響(表3)。在 6h 和 24h ,均是取食RP的胰凝乳蛋白酶活性顯著高于取食其他3種食物,且在其他3種食物間的差異不顯著。在12h ,取食RP和PP的胰凝乳蛋白酶活性明顯高于取食 RP+KL 和 PP+KL ,且兩者間差異不顯著。在 48h 時,取食RP的胰凝乳蛋白酶活性最高,取食 PP+KL 的次之,而取食PP和 RP+KL 的最低,
且兩者間差異不顯著。
取食同一食物的西花薊馬在不同時間下胰凝乳蛋白酶活性變化趨勢不同。取食RP的胰凝乳蛋白酶活性隨取食時間的延長,活性不斷升高,在24h 達到最高水平,為 6h 的2.40倍。取食PP的胰凝乳蛋白酶活性在 12h 和 24h 時顯著高于 6h 和 48h 。取食 RP+KL 的胰凝乳蛋白酶活性在24h時最高,分別為 6h,12h 和 48h 的4.06倍、2.77倍和2.68倍。取食 PP+KL 的胰凝乳蛋白酶活性也是 24h 時最高,取食 6h 最低。
2.1.3不同食物對西花薊馬脂肪酶活性的影響
不同食物對西花薊馬2齡若蟲脂肪酶活性有顯著的影響(表4)。在 6h 時,取食PP的脂肪酶活性明顯高于取食 PP+KL 。在 12h 和 48h 時,取食RP和PP的脂肪酶活性均顯著高于取食 RP+ KL和 PP+KL 。在 24h 時,取食RP的脂肪酶活性最高,而取食 RP+KL 的脂肪酶活性最低。
當西花薊馬在不同時間下取食同一食物,其脂肪酶活性也有差異。取食 RP24h 時的脂肪酶活性達到最高,分別為 6h,12h 和 48h 時的2.21倍、1.88倍和1.51倍。取食PP后脂肪酶活性在4個時間段均無顯著差異。取食 RP+KL 和 PP+KL 的脂肪酶活性均是在 48h 時最高。
2.2不同食物對西花薊馬消化酶基因表達量的影響
2.2.1不同食物對西花薊馬淀粉酶基因FoAMY-1表達量的影響
不同食物對西花薊馬淀粉酶基因FoAMY-1表達量有明顯的影響(圖1)。西花薊馬取食6、24和48h ,其FoAMY-1表達量均是取食 PP+KL 的最高。在 12h ,取食PP和 PP+KL 的FoAMY-1表達量之間沒有顯著差異,且表達量均處于最高水平。在6、12和 24h 均是取食RP的FoAMY-1表達量最低。在 48h ,取食RP的FoAMY-1表達量也最低,但與取食 RP+KL 的FoAMY-1表達量差異不顯著。
注:圖中數據代表均值 ± 標準誤,不同大寫字母和小寫字母分別代表同一食物不同時間下以及不同食物同一時間下 α -淀粉酶基因表達量差異顯著( Plt;0.05 )。下同。
在取食同一食物不同時間下, FoAMY-l 的表達量也有所差異。西花薊馬取食RP后其FoAMY-1表達量在 24h 最高。且取食PP和 PP+KL 后FoAMY-1的表達量均是在 48h 最高,而取食 RP+ KL后FoAMY-1的表達量在 24h 最高。
2.2.2不同食物對西花薊馬胰凝乳蛋白酶基因FoTRY表達量的影響
不同食物對西花薊馬2齡若蟲胰凝乳蛋白酶基因FoTRY表達量有顯著的影響(圖2)。在 6h 時,西花薊馬取食 RP+KL 時FoTRY表達量最高。在 12h 時,取食 RP+KL 后FoTRY表達量明顯高于取食 PP 。在 24h 時, FoTRY 表達量在4種食物間無顯著差異。在 48h 時,取食1 PP、RP+KL 和PP+KL 的 FoTRY 表達量均顯著高于取食 RP 。
西花薊馬取食同一食物不同時間下, FoTRY 表達量也有所差異。取食RP后FoTRY表達量在6、12和 24h 間無顯著差異,但均明顯高于取食 +48h 。西花薊馬取食PP時, FoTRY 表達量在 24h 顯著高于 6h 和 12h 。取食 RP+KL 的FoTRY表達量在6h 明顯高于 12h 和 48h 。取食 PP+KL 的FoTRY表達量在4個時間內均無顯著差異。
2.2.3 不同食物對西花薊馬脂肪酶基因FoLiP表達量的影響
不同食物對西花薊馬2齡若蟲脂肪酶基因
FoLiP表達量有顯著影響(圖3)。在 6h 時,取食RP的FoLiP表達量顯著高于取食 PP 。在 12h 時,取食 PP+KL 的FoLiP表達量顯著高于取食RP。在 24h 和 48h,FoLiP 表達量在4種食物間沒有顯著差異。
西花薊馬在取食同一食物不同時間下其FoLiP表達量也有所不同。取食RP后FoLiP表達量在 6h 時最高,且顯著高于其他3個時間段。取食PP時FoLiP表達量則相反,在 6h 時FoLiP表達量最低。取食 RP+KL 和 PP+KL 時FoLiP表達量在4個時間點差異均不顯著。
3 討論與結論
3.1不同食物對西花薊馬消化酶活性的影響
本研究揭示了不同食物對西花薊馬消化酶活性的差異化影響。在多數情況下,西花薊馬2齡若蟲 α -淀粉酶和脂肪酶的活性在取食嗜食PP和非嗜食RP之間差異不明顯,表明花粉種類對西花薊馬這兩種消化酶活性沒有明顯的影響。同時,研究發現,在大多數情況下,薊馬胰凝乳蛋白酶和脂肪酶活性在取食 RP+KL 和 PP+KL 后差異不顯著,進一步說明在菜豆葉片存在的情況下,花粉種類對胰凝乳蛋白酶和脂肪酶活性的影響不大。其他學者的研究也支持了這一現象,如在 400μL/LCO2 濃度下,西花薊馬淀粉酶活性在取食嗜食寄主菜豆和非嗜食寄主辣椒間差異不顯著[10]。本研究還發現,當西花薊馬取食非嗜食RP時,胰凝乳蛋白酶活性明顯高于取食嗜食PP的情況,說明胰凝乳蛋白酶活性與食物的嗜食性成反比。這可能是由于西花薊馬在取食非嗜食的食物時,通過調節較高蛋白酶活性來獲得足夠的營養以滿足自身的需要。類似的結果也在其他研究中得到證實,如椰心葉甲5齡幼蟲取食營養更豐富的椰樹展葉葉片相較于取食營養匱乏的心葉,其淀粉酶、蛋白酶以及脂肪酶活性更低[15]。西花薊馬2 齡若蟲在取食非嗜食寄主蠶豆葉片時,類胰蛋白酶活性顯著高于取食嗜食寄主菜豆葉片的情況[]。然而,也有研究發現昆蟲取食嗜食寄主時,其酶活性較高,這與本文的研究結果相悖。例如,西花薊馬取食嗜食寄主黃瓜時,淀粉酶活性明顯高于取食非嗜食寄主辣椒[10]西花薊馬2齡若蟲取食嗜食寄主菜豆葉片時, ∝ -淀粉酶活性顯著高于取食非嗜食寄主蠶豆葉片[]取食嗜食的野生金銀花時,金銀花尺蠖幼蟲的淀粉酶和蛋白酶活性最高[9]。柑橘鳳蝶幼蟲取食嗜食的九葉青品種時,消化酶活性顯著高于取食其他3個花椒品種[16]。本研究結果與上述研究報道均表明,食物與消化酶的活性之間存在著多樣化的關系,食物的嗜食性與消化酶活性可能無關,也可能正相關或負相關。因此,不同食物對昆蟲消化酶活性的影響并無簡單規律可循,而是呈現出復雜的動態變化,這種變化與消化酶的種類、食物的理化性質以及取食時間等因素密切相關。
研究發現,西花薊馬在單獨取食花粉(RP)和葉片(PP)后,其脂肪酶活性顯著高于同時取食花粉與菜豆葉片( RP+KL 和 PP+KL );同時,單獨取食RP的薊馬胰凝乳蛋白酶活性亦明顯高于取食RP+KL 。這一現象可能歸因于葉片的存在導致西花薊馬對花粉的取食量減少,而單獨取食花粉比取食花粉 + 菜豆葉片的組合獲得的營養更加豐富[34]。昆蟲取食營養豐富的食物后,更高的消化酶活性能快速分解和消化大量營養物質,從而確保其快速生長[17-18],也可能是昆蟲通過調整消化酶的活性達到優化利用營養物質的目的[9]
西花薊馬的3種消化酶活性在不同取食時間點表現出相似的變化趨勢,即隨著取食時間的延長而逐漸升高,大多數情況下在 24h 達到酶活峰值,隨后活性有所下降。這可能是因為西花薊馬在獲得足夠營養后,無需進一步提升消化酶活性,以避免不必要的能量消耗。這一結果與西花薊馬取食玫瑰花朵后胰凝乳蛋白酶活性在不同時間點的變化趨勢一致[5]。此外,雙斑螢葉甲成蟲在取食棉花和大豆等寄主后,其胰凝乳蛋白酶活性在24h顯著上升,而在 48h 后明顯下降,與本研究結果相一致[19]
3.2不同食物對西花薊馬消化酶基因表達量的影響
本研究發現不同食物對西花薊馬消化酶相關基因表達量的影響不同。西花薊馬取食嗜食PP后, ∝ -淀粉酶基因FoAMY-1表達量在4個時間下均顯著高于取食非嗜食 RP 。但取食嗜食PP和非嗜食RP的胰凝乳蛋白酶基因FoTRY和脂肪酶基因FoLiP的表達量在大多時間段下差異不顯著。因此,消化酶基因表達量的變化與寄主嗜食性之間的關系各異,與不同食物對薊馬消化酶活性的影響類似,同樣呈現出復雜多樣的變化。前人的相關研究同樣得出了不同的結果,如綠盲蝽胰蛋白酶基因ALSP4的表達量與嗜食寄主和非嗜食寄主沒有關聯[20]。棉鈴蟲淀粉酶基因HaAmyl和HaAmy2的表達量與寄主植物所含的還原糖、蔗糖和淀粉的含量存在密切而復雜的關系[21]
本研究還發現單獨取食花粉和取食花粉 + 葉片的組合后對西花薊馬不同消化酶基因表達量的影響不同。在大多時間下,單獨取食RP和PP的∝ -淀粉酶基因FoAMY-1分別低于取食 RP+KL 和PP+KL ??赡苁腔ǚ?+ 葉片的組合雖然為西花薊馬提供了更為多樣的食物,但營養比單獨花粉的低,西花薊馬通過調高消化酶基因表達量促進營養物質的分解和消化。與課題組先前的研究結果相符,即西花薊馬淀粉酶基因FoAMY-1在營養比較豐富的菜豆植株上表達量較低,但在營養較低的蠶豆植株則表現出較高的表達水平[\"]。本研究還發現西花單獨取食PP后的胰凝乳蛋白酶基因FoTRY的表達量與取食 PP+KL 的無顯著差異,單獨取食
RP和PP后的脂肪酶基因FoLiP表達量分別和取食 RP+KL 與 PP+KL 的差異不顯著??赡苁沁@些消化酶基因的表達量在短時間內差異不明顯,需要取食更長時間才會導致明顯差異。其他昆蟲也有類似的報道,如致倦庫蚊胰蛋白酶基因CPIJ004660和庚凝乳蛋白酶基因CPIJ003915分別在吸血后48h和60h才上調[22]
3.3消化酶活性和基因表達量的關系
本研究發現西花薊馬2齡若蟲 α -淀粉酶、胰凝乳蛋白酶和脂肪酶活性與其基因表達量的變化不一致,這可能是消化酶活性受多個基因構成的復雜網絡共同調控,這些基因之間可能存在復雜的相互關系。前人也有類似的結果,如人工飼養的梨小食心蟲取食寄主毛桃后中腸胰蛋白酶活性與中腸胰蛋白酶基因GMtrypsin-1的表達量[23]、西花薊馬取食蠶豆葉片時淀粉酶活性和胰蛋白酶活性與其基因表達量的變化均不完全一致[]
本研究僅探討了西花薊馬短時取食不同食物后3種消化酶活性及其基因表達量的變化,但西花薊馬長期取食這些食物后有什么變化仍需進一步開展研究。此外,不同食物除了對消化酶有影響外,對解毒酶和保護酶的影響也值得深入探討。總之,不同食物對昆蟲的影響是一個復雜的多維度的過程,需要更加詳盡和全面的研究,才能更準確地揭示其影響機制。
(責任編輯:胡吉鳳)
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Effects of Rape Pollenand Pine Pollen on the Activities of Digestive Enzymes and Their Gene Expression LevelsinFrankliniellaoccidentalis
Chen Hongyun,Zhi Junrui*,Qiu Xinyue,Yue Wenbo
(Institute of Entomology,Guizhou University,The Provincial Key Laboratory for Agricultural Pest Management of the
MountainousRegion,Guiyang55OO25,Guizhou,China)
Abstract:Franklinielloccdentalisisgloballyimportantagriculturalpestthatfeedsonbothplantleavesandpollens.In this study,we investigated the effectsof two pollen types—non-preferredrape polen (RP)and preferred pine pollen (PP)—administered either alone or in combination with kidney bean leaves ( RP+KL and PP+KL ,respectively)on the digestive enzyme activity and gene expression profiles in second instar nymphs of F .occidentalis.Theresults showed thattheactivities ofdigestive enzymes and their relative expresion levels varied significantlywith the typeof diet and feeding duration.At 6 h post-feeding,the activity of α -amylase was the lowest in thrips feeding on RP+KL By12 h,no significant differences were observed among treatments;however,at 24 h,the highest α -amylase activity was detected in thrips consuming RP and PP,while at 48 hours,the PPand PP+KL diets induced the highest enzyme activity. Chymotrypsin activity remained similar between RP and PP treatments at 12 h,but thrips fed on RP exhibited the highest activityatothertime points.Lipase activitypeaked intheRPtreatmentat24handwas generally highest inthrips fedon RP and PP at the other intervals.Gene expression analysis indicated that the α -amylase gene ( FoAMY-I )was expressed atthe lowest levels in thrips fedon RPat alltime points except at48h,when no diference was found between RPand RP+KL .Thechymotrypsin gene(FoTRY)exhibited its lowest expression inthe PP treatment at6 hand12h,yet at 48 h the lowest expresson occurred in the RP group.For the lipase gene ( FoLiP ),expression was minimal in the PP treatmentat6handintheRPtreatmentat12h,withno significant diferences observedat24hor48h.Thesefindings demonstrate that the influence of food on digestive enzyme function in F . occidentalis is both enzyme-specific and timedependent,highlighting the complex interplay between diet,enzyme activity,and gene expression.
Keywords:Frankliniella occidentalis; pollen; digestive enzyme