低溫脅迫下玉米根系轉錄組和代謝組分析

中圖分類號：S513.01 文獻標識碼：A 文章編號：1000-4440（2025）06-1063-09

Abstract：Cold stress is one of the primary abiotic stresses limiting the growth of maize seedlings.Inorder to study theeffectoflowtemperaturestressonmaizeroots，thisstudyusedmaizeinbredlineB73astheexperimentalmaterial，and dynamically monitored the growth of the primary root at different time points under control（28 C day/22 C night）and low-temperature treatment （ 15‰ day/ 10^qC night）.Additionally，we determined the transcriptome and metabolome of the rottissues from both thecontrol groupand the1-daylow-temperature treatment group.Phenotypic characterizationresults indicatedthatthe growthof the primaryroot was significantly inhibitedunderlow-temperature stress.Metabolomic analysis identified 57diferentiallyaccumulated metabolites，predominantlyenriched in starchand sucrose metabolism pathways.A total of 2 769 differentially expressed geneswere identified bytranscriptomeanalysis，which weremainlyinvolved in starch and sucrose metabolism and phenylalanine metabolism.Further integrationof transcriptomic andmetabolomic analyses revealed that starch and sucrose metabolismwere keypathwaysmediatingroot adaptationtolow-temperature stress.Under low-temperature stress，the content of soluble

sugarssuchasfructoseandglucosesignificantlyincreasedAtotalof26diferentiallyexpressed genes wereidentifiedinthe starchand sucrose metabolicpathways，with12 genesshowing significant upregulationand14 genesshowing significant downregulation.Thisstudyprovidesatheoretical foundationandcandidategenes forfurther investigation intothemolecular mechanisms of maize root adaptation to low-temperature stress and for genetic improvement.

Key words： maize；low temperature stress；transcriptomics；metabolomics

植物的生長和發育依賴于農田環境，在植物生長過程中常受到干旱、高溫、低溫、洪澇等非生物脅迫的影響[1]。為適應非生物脅迫，植物在長期的進化過程中形成了多樣的適應機制[2-3]。隨著全球氣候的變暖，非生物脅迫已成為作物高產穩產的重要限制因素。因此，加強植物對非生物脅迫的響應機制及適應對策研究對現代農業可持續發展具有重要意義。

玉米（ZeamaysL.）是全球廣泛種植的作物之一。2021年中國玉米總產量為 2.7×10⁸t ，占全國糧食總產量的 39.91% 。然而，當前的糧食增產速度已難以匹配人口增長所帶來的糧食需求增長[4]。盡管農業生產技術不斷進步，玉米的種植技術持續優化，但氣候條件（特別是光照、溫度、水分和大氣狀況）仍是影響玉米產量的關鍵因素。玉米是典型的短日照喜溫作物，最佳生長溫度為 25～28°C^[5-6] ，全生育期都對低溫極為敏感[7-8]。其中，生長初期的低溫對玉米生長發育的影響尤為顯著[9-10]。在寒冷區域種植時，玉米植株的生長速度會減緩，幼苗的生長活力也會減弱，從而導致產量的降低[1I-12]。中國每3＼～5年就會遭遇一次大范圍的重度低溫危害，導致玉米大幅度減產[13-14]

低溫脅迫與可溶性糖的關系是植物抗寒生理研究中的重要內容。可溶性糖在植物體內扮演著碳水化合物轉運和利用的重要角色[15]。這些糖類一方面作為呼吸底物，為植物的生長發育提供能量，另一方面作為代謝過程的中間產物，可轉化為細胞結構的構成成分、儲存物質等[16-18]。高濃度的蔗糖、葡萄糖和低濃度的甘露糖均能抑制子葉的伸長，冬小麥、擬南芥等植物在受到低溫脅迫后，葉片和根系中可溶性糖含量顯著升高[19-22] 。

近年來，植物中許多調控響應非生物脅迫的基因得到了鑒定。水稻bZIP71基因[23]和bZIP73Jap基因[24能調控水稻植株的耐寒性。水稻受到低溫脅迫時，bZIP71與bZIP73Jap蛋白形成異源二聚體，進而激活相關基因的轉錄活性，提高可溶性糖轉運效率和水稻結實率[25]。擬南芥CBL與CIPK7基因互作能調控植株對低溫的響應能力[26]；擬南芥中ABI3基因的異常表達可提高植株的抗冷能力和低溫適應性[27]

目前，玉米對低溫響應的分子機制已有初步研究。Dolferus[]研究發現，玉米ZmCOOL1基因能直接抑制低溫關鍵轉錄因子基因DREB1/CBF和海藻糖合成關鍵基因TPS的表達，負向調控玉米的耐冷性。玉米中ZmbZIP68基因的表達量升高能導致玉米植株的耐冷性下降[2]。但將代謝組學和轉錄組學相結合進行玉米對低溫響應的分子機制研究還鮮見報道。本研究采用代謝組學和轉錄組學相結合的方法，分析玉米苗期對低溫脅迫的響應機制，為玉米苗期的低溫冷害預防提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試驗設計

種子培養液的配制：分別稱取 K₂SO₄、MgSO₄ ：7H₂0 、 KH₂PO₄ 、KCl、EDTA-FeNa、 MnSO₄?H₂O 、ZnSO₄?7H₂O、CuSO₄?5H₂O、 （ NH₄）₆Mo₇O₂₄ ·4H₂O，H₃BO₃，Ca（NO₃）₂?4H₂O 各 0.131mg?0 .160mg.0.034mg.0.007mg.0.037mg.0.223μg.0.228 μ_o，^g，0.025μ_o，^g，0.062μ_o，^g，0.062μ_o，^g，0.472mg ，用蒸餾水定容成1L的混合溶液，再用 ΔNaOH 調節 pH 值調至6. 00±0.05 ，即得玉米種子培養液。

選擇飽滿且大小一致的玉米自交系B73種子200粒，用 10% （204號 H₂O₂ 消毒 30min 后，用蒸餾水多次沖洗，去除種子表面的 H₂O₂ 。將消毒后的種子在飽和硫酸鈣溶液中浸泡 6h ，然后放在濕潤濾紙上，置于溫度 28^°C 相對濕度 60% 的人工培養箱中培養2d。種子萌發后，選取長勢一致的發芽種子8粒用發芽紙（美國PaperAnchorCompany產品）卷起來，采用水培體系進行發芽種子培養，每6卷苗放入1個裝有1L營養液的桶中。

將裝有卷苗的桶置于人工氣候箱中進行培養，設置常溫對照和低溫兩個處理。常溫對照的白天溫度為 28^°C（14h） 、夜間溫度 22%（10h） ，低溫處理的白天溫度為 15C（14h） 、夜間溫度為 10^c ，相對濕度均設為 60% 。每2d更換一次營養液，每處理設4個重復。低溫處理第2d開始每天選取長勢一致的植株20株用直尺測量主胚根長度，連續測定8d。低溫處理 24h ，每個處理采集30條主胚根在液氮中冷凍，并保存于 -80^°C 冰箱中，用于轉錄組和代謝組分析。使用IBMSPSS軟件及 χ_t 檢驗法進行不同時間常溫與低溫玉米種子主胚根長的差異顯著性分析。

1.2 代謝物提取及測定

將低溫處理1d的 100mg 新鮮根樣和5個鋼球置于 5mL 離心管中，液氮冷凍 5min ，然后轉移到SCIENTZ-48高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司產品）以 70Hz 的頻率研磨 1min 。然后，依次加入1 400μL （204 -20^°C 預冷的甲醇和 60μL 質量濃度為 0.2mg/mL 的核糖醇，渦旋振蕩 30s 。然后，將試管置于KQ-100TDV超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司產品）中，室溫下放置 30min ，加人 750μL 預冷后的氯仿和1 400μLddH₂O ，渦旋1min，4%14000r/min 離心 10min 后，將 1mL 上清液轉移到 1.5mL 離心管中，利用53050型真空濃縮器（德國Eppendorf公司產品）吹干。然后加入60μL 甲氧基溶液，渦旋 30s ，在 37^°C 下反應 ^2h ，最后加入 60μL BSTFA試劑， 37°C 反應 90min ，4℃12 000r/min 離心 10min ，轉移到檢測瓶中利用7890A氣相色譜儀和5975C質譜儀（美國Agilent公司產品）進行氣相色譜-質譜聯用檢測分析（GC-MS）。采用HP-5MS毛細管柱（美國Agilent公司產品），以 1mL/min 氮氣恒流分離衍生物。將 1μL 樣品以分流比 20：1 的方式通過自動進樣器注入，注射溫度為 280^°C ，接口溫度設為 150^c ，離子源調節溫度為 230^qC 。初始溫度設為 后以10C/min 的速率增加到 300^qC ，并在 300‰ 保持5min 。質譜測定采用全掃描方法，掃描范圍的質荷比為35～750。

1.3RNA提取及轉錄組測序

利用RNeasyplantminikit試劑盒（德國Qiagen公司產品）提取玉米根系總RNA。利用Oligo（dT）磁珠富集總RNA中帶有polyA結構的mRNA，采用離子打斷的方式，將RNA打斷到長度為 300bp 左右的片段。以RNA為模板，用6堿基隨機引物和逆轉錄酶合成cDNA第一鏈，并以第一鏈cDNA為模板進行第二鏈cDNA的合成。然后對雙鏈cDNA進行純化得到cDNA文庫。進一步采用PCR擴增進行文庫片段富集，之后根據片段大小進行文庫選擇。利用Agilent2100生物分析儀（美國Agilent公司產品）對文庫總濃度及文庫有效濃度進行檢測，最后采用Ilumina測序平臺，對文庫進行雙末端測序。

1.4代謝組數據分析

經過GC-MS分析得到的原始數據通過AgilentMSDChemStation軟件轉換為netCDF格式。使用XCMS v3.1.3 軟件進行峰識別、峰過濾和峰對齊。將檢測到的代謝物信號與NIST數據庫和Wiley代謝物數據庫進行比對，獲得玉米根系代謝物的注釋信息。所有代謝物特征值取2為底的對數后進行分析。通過Excel軟件和 χ_t 測驗法以錯誤發現率（FDR）lt;0.05 為標準篩選出差異代謝物。

1.5轉錄組數據分析

利用TrimGalore軟件對測序得到的原始數據進行過濾，去除含有InDex、poly-N比例大于 10% 和低質量的reads，以獲得高質量數據（Cleanreads）。使用HISAT2軟件[28]將獲得的高質量數據與玉米參考基因組（ RefGen_-V3 ）進行比對。使用Feacture-Counts軟件統計每個基因的讀數，然后計算基因的表達水平，得到FPKM（每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的片段數）[29]

利用 DESeq1.18.0 軟件進行轉錄組數據差異表達分析。采用Benjamini和Hochberg方法矯正得到的 q 值（假陽性概率）來控制錯誤率。定義 qlt;0.05 的基因為差異表達基因[30]。使用KOBAS3.0數據庫對差異表達基因進行KEGG功能富集分析[31，以錯誤發現率 （FDR）lt;0.05 的KEGG路徑為顯著富集的代謝通路。

2 結果與分析

2.1低溫脅迫下玉米自交系B73的主胚根長

不同處理下玉米自交系B73的主胚根生長動態如圖1所示。從圖中可以看出，常溫對照下，玉米自交系B73的主胚根長呈不斷增加的趨勢，而低溫處理下，處理1d時，主胚根長有顯著增加，此后，主胚根生長緩慢。低溫處理2d后，玉米自交系B73的主胚根長顯著低于常溫對照。低溫處理6d時，玉米自交系B73的主胚根長比常溫對照下降 75.3% 。

**表示低溫處理各時間與常溫對照相比差異極顯著（ Plt; 0.01）。

2.2低溫脅迫下根系代謝物的變化

對8個根系樣品代謝物進行主成分分析（PCA），得到第1主成分（PC1）和第2主成分（PC2）的貢獻率分別為 97.4% 和 2.1% ，同一處理的4個樣本緊密聚集（圖2A）。通過代謝物注釋共鑒定到86種代謝物，包括27種氨基酸類代謝物、11種碳水化合物、4種脂類代謝物、4種核苷酸類代謝物、20種有機酸類代謝物和20種其他類代謝物，分別占總代謝物的31. 40% 、 12.79% / 4.65% 、4. 65% ） 23.26% 和 23.26% （圖2B）。進一步比較常溫對照和低溫處理下代謝物的變化，鑒定到57種差異代謝物，其中氨基酸類物質17種，有機酸類物質13種。低溫脅迫下，47種代謝物含量增加，包括16種氨基酸類代謝物、8種碳水化合物、4種核苷酸類代謝物、8種有機酸類代謝物以及11種其他代謝物；10種代謝物含量減少，包括1種氨基酸類代謝物（脯氨酸）、4種脂類代謝物（十八烷酸、十六烯酸、十七烷酸和二十烷酸）和5種有機酸類代謝物（衣康酸、2-甲基-富馬酸、水楊酸、莽草酸、奎寧酸）（圖2C、圖2D）。

2.3差異代謝物的KEGG功能富集分析

錯誤發現率 （FDR）lt;0.05 的顯著差異代謝物KEGG通路如圖3所示。從圖中可以看出，差異代謝物的代謝途徑主要富集在淀粉和蔗糖代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝以及半乳糖代謝等途徑。

2.4低溫處理下根系轉錄組分析

對常溫對照和低溫處理的根系樣品進行轉錄組分析，共鑒定出41934個基因。只要基因的FPKM值在1個樣本中大于1，即可認為該基因是活躍表達的[32]，本研究發現共有22261個基因處于活躍狀態。通過對常溫對照和低溫處理轉錄組的比較分析，本研究共鑒定到2769個差異表達基因（DEG）。低溫脅迫下，1304個差異表達基因表達水平上調，1465個差異表達基因表達水平下調。在這些差異表達基因中，進一步鑒定出251個轉錄因子基因，分屬于36個不同的轉錄因子基因家族（圖4A）。這些轉錄因子涵蓋了多種功能，如ARF、ARR-B、ERF等轉錄因子參與激素信號轉導，bHLH、bZIP、MYB、NAC、WRKY等轉錄因子在植物發育中扮演重要角色。差異表達基因的KEGG功能富集分析結果顯示，共有22條通路呈現出顯著富集（圖4B）。

2.5在低溫條件下，可溶性糖影響根系發育

結合差異表達基因和差異代謝物分析發現，在低溫脅迫下，根系生長主要由淀粉和蔗糖代謝通路介導。可溶性糖是植物體內的一類重要碳水化合物，對植物的生長發育、代謝調控以及抗逆性等有重要的影響。低溫脅迫下，海藻糖、葡萄糖、6-磷酸-葡萄糖、果糖、6-磷酸-果糖等代謝物的豐度增加（圖5）。尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-葡萄糖）在蔗糖磷酸合成酶作用下產生6-磷酸-蔗糖，6-磷酸-蔗糖通過 β -呋喃果糖苷酶合成果糖，果糖隨后在己糖激酶的催化下合成6-磷酸-果糖，后者在葡萄糖-6-磷酸異構酶的作用下轉變為6-磷酸-葡萄糖;同時UDP-葡萄糖還在蔗糖合酶作用下合成蔗糖，UDP-葡萄糖合成的6-磷酸-海藻糖在海藻糖-6-磷酸合成酶作用下合成海藻糖。纖維素通過內切葡聚糖酶合成纖維糊精，而纖維糊精則在 β -葡萄糖苷酶作用下合成葡萄糖，葡萄糖可以在己糖激酶的作用下生成6-磷酸-葡萄糖。低溫脅迫下，本試驗中共鑒定出26個參與淀粉和蔗糖代謝的差異表達基因，包括1個表達顯著上調的蔗糖磷酸合成酶基因，4個表達顯著上調的蔗糖合成酶基因，3個表達顯著下調的 β -呋喃果糖苷酶基因，1個表達顯著下調的己糖激酶基因，1個表達顯著上調的葡萄糖-6-磷酸異構酶基因，8個表達顯著下調的CEL家族內切葡聚糖酶基因，1個表達顯著上調的 β -葡萄糖苷酶基因，2個表達顯著上調和2個表達顯著下調的海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因以及與通路中主要代謝物聯系度較低的表達顯著上調的 ZmSS3?_JmSSI?_√mIDP68733 個基因（圖6）。在低溫脅迫下，這些差異基因的表達趨勢與對應代謝物含量的變化趨勢不總是一致。

A：常溫對照（CK）和低溫處理樣本根系代謝物的主成分分析;B：代謝物分類;C：差異代謝物數量;D：對照和低溫處理主胚根差異代謝物熱圖。

FPKM：每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的片段數。

3 討論與結論

低溫脅迫是作物生長發育面臨的主要非生物脅迫之一，目前低溫事件發生的頻率和程度均呈增加趨勢，這嚴重威脅世界各國的糧食安全[33-34]。玉米作為一種典型的熱帶作物，對低溫極為敏感，特別是苗期低溫會顯著抑制植株根系和地上部的生長，進而影響玉米全生育的生長發育和產量形成[34]。本研究通過轉錄組學和代謝組學相結合的方法，系統探討了玉米根系在低溫脅迫下的生理和分子響應機制，對于玉米耐寒性品種改良和栽培措施選擇具有重要的理論和實踐意義。

低溫對植物根系的影響體現在多個層面，包括對細胞分裂和擴展的抑制、根尖活力的降低以及根系吸收能力的減弱[33]。本研究中，低溫處理2d，玉米主胚根的長度顯著下降，并且隨著脅迫時間的延長，根系生長抑制更加明顯，處理6d時玉米主胚根長降低75.3% 。這一結果與前人的研究結果一致[35]

劉芬[36]的研究結果顯示，低溫脅迫能引起大量的基因表達變化，許多與細胞壁形成、激素信號傳導、碳水化合物代謝等相關的基因顯著上調或下調。這些基因的差異表達可能是根系生長受抑制的分子基礎。特別是參與細胞壁合成的內切葡聚糖酶基因表達下調，可能導致根系細胞壁松弛性降低，進而影響根系細胞的擴展和生長[37]

可溶性糖在植物應對低溫脅迫中的作用已經得到廣泛關注。可溶性糖不僅是作物生長發育的能量來源，還能在低溫脅迫下作為滲透保護劑，幫助細胞維持滲透平衡，防止細胞脫水和膜結構損傷[38]。本研究中，低溫脅迫下玉米根系中的多種可溶性糖（如葡萄糖、果糖、海藻糖等）顯著積累，表明這些物質在玉米根系適應低溫脅迫過程中發揮著重要作用[39]。此外，本研究還揭示了淀粉和蔗糖代謝途徑在玉米根系應對低溫脅迫中的關鍵作用。淀粉和蔗糖代謝通路中的多個關鍵基因在低溫脅迫下顯著上調表達，如蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶基因的上調表達 B -呋喃果糖苷酶基因的下調表達、多個海藻糖-6-磷酸合成酶基因的上調表達，這些基因的上調表達或下調表達不但可以促進蔗糖和海藻糖的合成和積累，還能維持細胞的滲透壓穩定、穩固細胞膜和蛋白質結構，從而增強植物抵御低溫脅迫的能力。這些結果與前人研究結果[40-43]一致。同樣，低溫下糖類代謝途徑的調控對于提高植物的耐寒性在擬南芥和水稻等植物中亦具有關鍵作用[445]。糖類不僅作為能量物質，還能與其他物質互作調控植物的生長發育和響應逆境脅迫[46-53] ○

通過轉錄組和代謝組的聯合分析，本研究結果表明，低溫對玉米根系的生長具有顯著的抑制作用，并能誘導基因表達和代謝物積累的變化。其中，淀粉和蔗糖代謝是玉米根系適應低溫脅迫的關鍵途徑，多個與糖類代謝相關的基因和代謝物在低溫下顯著變化。

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（責任編輯：石春林）