溫度和葡萄糖雙重響應性共聚物水凝膠支架的性能研究

中圖分類號：TB381 文獻標志碼：A 文章編號：1004-0935（2025）06-0889-05

智能響應性水凝膠是一種出色的藥物遞送系統由水和聚合物交聯網絡組成，高含水量使其與機體組織具有近似的物理特性，展現出優異的生物相容性和易于包封藥物的能力，同時可以通過條件刺激控制水凝膠網絡的擴散過程，從而實現對藥物的控制釋放。溫度和葡萄糖響應性水凝膠與人體生理條件密切相關，在胰島素遞送系統開發方面前景廣闊，具有作為人工胰腺替代品的可行性[1-3]。

制備了以聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）和3-丙烯酰胺苯硼酸（AAPBA）為主體的溫度和葡萄糖雙重響應性共聚物水凝膠支架，并利用水凝膠支架的溫敏特性將胰島素進行有效負載，同時在不同葡萄糖質量濃度條件下考察胰島素在水凝膠支架中的控制釋放情況。利用PNIPAAm溫敏性和AAPBA糖敏性的雙重響應性共聚物水凝膠支架通過自調節“開關”來控制胰島素的負載和釋放，同時保護藥物免受免疫或酶解影響，在糖尿病治療方面具有較大的潛在應用價值。

1 實驗部分

1.1材料

聚（N-異丙基丙烯酰胺-co-3-丙烯酰胺苯硼酸- co-甲基丙烯酸羥丙酯-co-3-（三甲氧基甲硅基）甲基 丙烯酸丙酯）（P（NIPAAm-co-AAPBA-co-HPM-co

TMSPM，簡稱PNAHT共聚物），各單體物質的量比為 20：1：1：1 ，LCST為 23°C ， pK_a 為7.28，自制[4]；無水乙醇、牛血清白蛋白（BSA）、FITC-胰島素、葡萄糖、磷酸鹽緩沖溶液（PBS， pH=7.4 ），西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司。

1.2 制備方法

將PNAHT共聚物以 100mg?mL^-1 的質量濃度溶于無水乙醇，室溫攪拌 12h ，之后采用Millipore濾膜（ 0.2μm ）對共聚物溶液進行過濾。將 10μL 質量濃度為 1mg?mL^-1 的BSA溶液滴于載玻片表面并室溫干燥，然后將 10μL 共聚物溶液滴于BSA涂層表面，將復合涂層室溫靜置 30min 后， 125‰ 真空加熱 3h 。將產品用去離子水充分清洗，最后室溫真空干燥得到共聚物水凝膠支架

1.3 表征方法

采用衰減全反射-傅里葉變換紅外光譜儀（ATR-FTIR，Bruker TENSOR27，Bruker OPTIKGmbH，德國）檢測PNAHT共聚物水凝膠支架的化學成分，其波數范圍為 500～4000cm^-1 。通過掃描電子顯微鏡（SEM，Quanta4OOFEG，FEI，美國）分別觀測水凝膠支架浸于 20，37°C 的去離子水、PBS溶液（ pH=7.4 ）以及 5mg?mL^-1 葡萄糖-PBS 溶液（ ΔpH 為7.4）后的表面形貌，用以驗證其溫敏性和糖敏性。為了評估水凝膠支架在不同水溶液的穩定性能，首先記錄干燥支架的質量，然后將浸入20、37℃的去離子水以及PBS溶液（ pH=7.4 ）、 5mg?mL^-1 葡萄糖-PBS溶液（ pH=7.4 ）0＼～15天后的支架分別取出，真空干燥后依次稱重。

1.4胰島素的負載和控制釋放

1.4.1 胰島素負載

將共聚物水凝膠支架置于 20°C PBS溶液中至平衡溶脹，然后 20°C 真空干燥 24h ；將干燥的水凝膠支架浸于 75% 乙醇，取出后紫外滅菌，置于培養皿備用；在 20°C ，利用微注射器將 10μL 質量濃度為 0.5mg?mL^-1 的FITC-胰島素溶液（ 4°C ）注入水凝膠支架。隨后將負載FITC-胰島素的水凝膠支架移至 37°C PBS溶液，并用 37°C PBS溶液沖洗3次。采用熒光顯微鏡（TE2000-U，Nikon，日本）觀測胰島素的包封情況，激發波長為 495nm ，發射波長為 525nm ，并采用熒光分光光度計（F-4500，Hitachi，日本）測試洗脫液的熒光強度，激發波長為495nm ，發射波長為 525nm 。根據胰島素質量濃度-熒光強度標準工作曲線及下列公式分別計算包封率和載藥量[5]。

包封率= 總胰島素質量濃度-游離胰島素質量濃度 ×100% 總胰島素質量濃度總胰島素質量-游離胰島素質量 ×100% 載藥量=共聚物水凝膠支架質量

1.4.2 模擬人體血液微環境的胰島素控制釋放

為了考察共聚物水凝膠支架在模擬人體血液微環境的胰島素控制釋放，首先將等量負載FITC-胰島素的共聚物水凝膠支架分別置于不同的24孔細胞培養板，并注入 1mL37Ω°C 、 pH=7.4 的PBS溶液。分別將終質量濃度為0、1、 5mg?mL^-1 的葡萄糖溶液注入細胞培養板，然后放入 （37±0.1） ） C 恒溫搖床，轉速為 100rmin^-1 。每 ^1h 取 100μL 上清液，檢測其胰島素釋放量，同時將等體積同質量濃度的葡萄糖-PBS溶液補入孔板，繼續進行釋放實驗。利用熒光分光光度計測試釋放的FITC-胰島素的熒光強度。根據標準曲線計算樣品胰島素質量濃度，進而確定胰島素含量。

2 結果與討論

2.1溫度和葡萄糖雙重響應性共聚物水凝膠支架 的制備

該研究為溫度和葡萄糖雙重響應性共聚物水凝膠支架提供了一種可行且便捷的制備策略。首先將PNAHT共聚物溶液滴涂于BSA涂層表面，然后通過加熱促使共聚物的分子間和分子內硅氧烷鍵與羥基發生脫甲醇反應，從而形成交聯網絡結構，隨后通過充分浸泡和漂洗得到共聚物水凝膠，最后通過真空干燥制得共聚物水凝膠支架。

由4種單體NIPAAm、AAPBA、HPM和TMSPM組成的PNAHT共聚物既含有體現智能特性的響應基團，又具備形成網狀結構的反應基團。NIPAAm和AAPBA反應物分別賦予水凝膠支架以溫敏和糖敏特性。TMSPM和HPM為水凝膠支架的形成提供了有效的硅氧烷鍵和羥基[。BSA作為基底，用于防止共聚物的硅氧烷鍵與玻璃表面的羥基鍵合，BSA可通過浸泡和漂洗的方法去除，從而獲得完整純凈的共聚物水凝膠支架。采用滴涂方式制備了溫度和葡萄糖雙重響應性共聚物水凝膠支架，也可升級為其他涂覆方法，如噴涂，以減少支架的尺寸，為其在體內應用提供可能。

2.2溫度和葡萄糖雙重響應性共聚物水凝膠支架的表征

2.2.1 化學成分

PNAHT共聚物及其水凝膠支架的ATR-FTIR譜圖如圖1所示。

由圖1可以看出，酰胺鍵I（ C=0 ）和酰胺鍵II（N—H）的吸收峰展現于1653、 1546cm^-1 處；異丙基的對稱吸收峰出現在1387、 1367cm^-1 處[7]；硼酸的特征吸收峰展現于 1353cm^-1 處；苯環的吸收峰出現在 709cm^-1 處[8]。上述實驗結果與PNAHT共聚物呈現的特征峰值基本一致，證明水凝膠支架同樣含有NIPAAm和AAPBA等組分。而分布在3100～3700cm^-1 的羥基吸收峰發生紅移，同時變得陡峭。另外，硅氧烷鍵的吸收峰（ 1079cm^-1 ）產生了偏移，在1090、 999cm^-1 處出現了新峰，這是由形成的Si一O鍵所引起的[9]。結果表明，共聚物水凝膠支架的分子鏈是通過共聚物中硅氧烷鍵與羥基鍵合而成。綜上，共聚物水凝膠支架含有溫敏性的異丙基鍵和酰胺鍵以及糖敏性的苯硼酸基團，這是支架具有雙重響應特性的決定性因素。此外，真空加熱促使TMSPM的硅氧烷鍵與HPM的羥基之間發生脫甲醇反應從而形成Si一O鍵，進而形成共聚物網絡，這會導致共聚物水凝膠支架的ATR-FTIR光譜中硅氧烷鍵和羥基的特征峰消失。

2.2.2 表面結構分析

PNAHT共聚物水凝膠支架的外觀及在不同溶液中的表面形貌如圖2所示。

由圖2可以看出，浸于不同水溶液且等溫真空干燥后的水凝膠支架與直接干燥支架相比，其表面形貌變化明顯，這主要是由于水分子進入水凝膠支架的微孔所致。在 20°C 去離子水中，共聚物水凝膠支架表面粗糙且多孔，但當溫度上升到 37°C 時，支架表面的微孔幾乎消失。這是因為當溫度高于LCST時，水凝膠支架的分子鏈由親水性變成疏水性整體結構由松散轉變為致密，這證實了共聚物水凝膠支架具有良好的溫度響應性[10]。在 20C，pH=7.4 的PBS溶液中，共聚物水凝膠支架表面呈現粗糙多孔結構；而在 37°C 、 pH=7.4 的PBS溶液中，支架孔隙尺寸明顯變小，同時微孔數量顯著減少。在20、37^°C 的 5mg?mL^-1 葡萄糖-PBS溶液中，水凝膠支架表面微孔的尺寸和數量比在相同溫度下的去離子水和PBS溶液中明顯增加。這說明水凝膠支架在葡萄糖刺激下進行內部結構重構，即水凝膠支架對葡萄糖質量濃度具有智能響應。這是因為帶電荷的苯硼酸基團可以與葡萄糖結合產生可逆的共價復合物，使PBA的負電荷數量增加，從而產生更為親水的結構[11]。通過改變水凝膠微孔的尺寸和數量可有效控制胰島素的負載和釋放。因此，PNAHT共聚物水凝膠支架具有在生理條件下作為新型胰島素控釋載體的潛力。

2.2.3 結構穩定性

藥物載體的穩定性是其能否在體內外應用的重要因素。PNAHT共聚物水凝膠支架在不同水溶液的降解情況如表1所示。

由表1可以看出，分別在20、37 C 的不同溶液中浸泡 15d ，水凝膠支架的剩余質量分數仍保持在 97% 以上，支架質量的損失可能是由于少數共聚物分子鏈交聯不足所引起[12-13]。另外，在同一溫度下，浸泡在去離子水、PBS 溶液和 5mg?mL^-1 葡萄糖-PBS溶液的實驗結果并無顯著差異。上述結果證明，制備的共聚物水凝膠支架具有優良的結構穩定性[14-15]，這也證實加熱退火處理利于硅氧烷鍵和羥基的交聯，從而形成共聚物網絡結構，促使水凝膠支架的穩定性得以提升。

2.3FITC-胰島素的負載與控釋

2.3.1 胰島素的負載與控制釋放

首先利用水凝膠支架的溫敏特性和毛細作用力將FITC-胰島素負載于PNAHT共聚物水凝膠支架。使用熒光顯微鏡監測FITC-胰島素的包封和控釋過程，同時采用熒光分光光度計對水凝膠支架的胰島素包封率和載藥能力進行分析。FITC-胰島素在水凝膠支架負載和釋放的熒光圖像如圖3所示。在 37°C 的PBS溶液中，鮮見胰島素從支架脫出，這是由于支架孔隙較為狹窄，限制了胰島素的自由通行。在37°C 下，在PBS溶液中加入質量濃度為 5mg?mL^-1 的葡萄糖后，支架孔徑顯著增大，部分胰島素從支架逸出。上述結果說明，具有溫度和葡萄糖雙重響應性的水凝膠支架在生理條件下可作為胰島素的控釋載體。在相同條件下，理論載藥量為 5% 的水凝膠支架的包封率和載藥量分別為 48.9% 和 3.46% ，而理論載藥量為 10% 的水凝膠支架的包埋率和載藥量分別為 61.8% 和 9.29% 。對比結果可知，隨著理論載藥量的增加，水凝膠支架的胰島素包封率和載藥量均明顯增加。因此，選擇理論載藥量為 10% 的水凝膠支架進行后續胰島素控釋實驗

2.3.2模擬人體血液微環境下共聚物水凝膠支架內胰島素的控制釋放

在模擬正常和患病人群血液微環境條件下（ 37°C ， pH=7.4 ，僅改變葡萄糖質量濃度）進行胰島素在PNAHT共聚物水凝膠支架的控制釋放實驗。將負載胰島素的共聚物水凝膠支架分別置于0、1、5mg?mL^-1 葡萄糖溶液中，每 ^1h 測定胰島素釋放量并計算累積釋放率，結果如圖4所示。由圖4可以看出，在PBS溶液中胰島素的累積釋放量僅為 10% 左右，這表明水凝膠支架在生理溫度和 pH 條件下可有效限定胰島素的活動區域；當加入質量濃度為

1mg?mL^-1 葡萄糖時，胰島素的釋放量快速提升，約4h 后達到平臺期，累積釋放率約為 40% ；當加人質量濃度為 5mg?mL^-1 葡萄糖時，胰島素的釋放速度驟然加快，同樣 ^4h 后達到平臺期，累積釋放率約為80% 。結果表明，隨著葡萄糖質量濃度的升高，水凝膠支架的微孔尺寸不斷增大，致使胰島素的釋放量隨之增加，這表明水凝膠支架可根據葡萄糖質量濃度變化情況而進行自我調節，從而實現胰島素的智能控制釋放。

3結論

制備的水凝膠支架保持了原始PNAHT共聚物對溫度和葡萄糖的雙重響應特性，并具有優良的穩定性。可以利用水凝膠支架的溫度響應性將胰島素負載于水凝膠支架，同時支架可在不同葡萄糖質量濃度的刺激模式下，進行葡萄糖質量濃度的瞬時感應，通過調節自身孔徑尺寸，從而實現胰島素的智能控制釋放。該研究的智能給藥系統可以模擬人體胰島素的分泌模式，為人工胰腺的研發提供新的思路和技術支持。

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Study on Properties of Temperature- and Glucose-Responsive Copolymer Hydrogel Scaffolds

LIU Jianqin1，2， CHEN Baiqiang1， ZHANG Xinhao1， YANG Lei1 （1.SchoolofPetrochemical Engineering，Liaoning PetrochemicalUniversity，FushunLiaoning 113oo1，China; 2.Collegeof Science， ShantouUniversity， Shantou Guangdong515o63，China）

Abstract：Thecopolymerhydrogelscaffoldswerepreparedfromtemperature-responsiveand glucose-responsivecopolymersbydrip coating，heatingannealingandvacuumdryngrespectivelyTechemicalcompositio，surface morphologyandstabilityofopolyer hydrogescafoldswereinvestigated.Theresultsdmonstratedthatehdrogelscafoldscouldmaintainothtemperatureadglucose responses ofthecopolymers，ndhadgod structuralstabilityThetemperature-senstive propertiesofthehydrogelsafolds were usedtoloadinsulineffectivelyandtheinsulincontrolledreleaseofhumanbloodmicroenvironmentwassmulatedaccordngtothe glucose-sensitivepropertiesofthehdrogelscafolds.Thecopoymerhydrogelscaffoldscouldself-regulateacording tothechange of glucose mass concentration， which had the feasibility of clinical application.

Keywords：PolyNsopropylacylide）;-Aclamdopyboroicacid;Smartsposiedogel; Isuncotroldeee