液相色譜質譜聯用法同時測定谷物中3種真菌毒素方法的優化

Optimization of the Method for Simultaneous Determination of Three Mycotoxins in Cereals by Liquid ChromatographyMass Spectrometry

LU Feng （Liaoning Provincial Food and Materials Reserve Affairs Service Center （Liaoning Provincial Grain Inspection and Testing Center）， Shenyang 110033， China）

Abstract： In this study， a method for simultaneous determination of mycotoxins in major cereals by liquid chromatography-mass spectrometry was optimized.This method can achieve complete separation of three mycotoxins， aflatoxin B₁， deoxynivalenol， and zearalenone，within 25min . The spike recovery rate was increased by more than 2% while maintaining analytical precision （relative standard deviation of 0.036% to 0.089% ）and correlation coeficient greater than O.999.This method has high accuracy and sensitivity while ensuring analysis speed， and is highly practical for the determination of mycotoxins in cereals.

Keywords： cereals; mycotoxins; liquid chromatography-massspectrometry; method optimization

谷物作為人們飲食中的重要組成部分，其安全性和質量直接關系到人們的健康。然而，谷物在生長、收獲、儲存和加工過程中，容易受到各種真菌的污染，進而產生真菌毒素。這些真菌毒素不僅對人體健康構成嚴重威脅，還會影響谷物的品質和市場流通。谷物中常見的真菌毒素包括黃曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮等，具有肝毒性、腎毒性、神經毒性、致畸性和致癌性等多種生物毒性。長期攝入含有真菌毒素的谷物，不僅會增加肝癌、腎癌等惡性腫瘤的發病風險，還可能對兒童生長發育造成不良影響，導致其免疫力下降等。因此，對谷物中的真菌毒素進行準確、快速測定顯得尤為重要。在眾多測定方法中，液相色譜質譜聯用法（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）以其高靈敏度、高分辨率和高選擇性的優勢，成為當前真菌毒素測定的主流方法之一。該方法將液相色譜的高效分離能力與質譜的強大定性定量功能有機結合，具備以下優勢：檢測靈敏度極高，能有效識別谷物中痕量真菌毒素，確保測定結果的準確性和可靠性；能夠同時分離和測定多種真菌毒素，即使在復雜基質中也能獲得清晰的色譜圖，從而提高測定效率和準確性，降低誤判和漏判風險；

質譜的高選擇性使得LC-MS/MS能夠準確識別目標化合物，排除干擾物質的影響，特別適用于谷物中多種真菌毒素的同時測定；樣品處理相對簡便，不需要復雜的提取和凈化步驟，降低了測定成本，提高了測定效率，具備較高的實驗室推廣價值。

本文參考《糧油檢驗主要谷物中16種真菌毒素的測定液相色譜-串聯質譜法》（LS/T6133—2018）標準，對樣品制備過程和儀器條件進行了優化。在樣品前處理方面，延長了樣品提取和離心的時間；在儀器條件方面，則從色譜柱長度、流動相比例、質譜掃描電壓、氣體流速和加熱溫度等多個維度進行了優化。通過線性關系、精密度實驗、加標回收實驗等對比分析，驗證了優化方法的可行性與優勢。

1材料與方法

1.1儀器與設備

LC-MS-8045質譜儀、LC-40Dxs液相色譜儀，日本島津；CF16RN離心機，日本天美；BIOFUGEStratos離心機，美國賽默飛；VortexGenius3.0漩渦混合器，德國IKA；T18勻漿機，德國 IKA 。

1.2材料與試劑

玉米，明山糧庫J5號庫；黃曲霉毒素 ΔB₁ （MSL023-2）， 100μg?mL^-1 ；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（BWQ8875-2016）， 1000μg?mL^-1 ；玉米赤霉烯酮（BWQ8670-2016）， 1000μg?mL^-1 ；乙腈（CAS：75-05-8）、甲醇（CAS：67-56-1）、乙酸（CAS：64-19-7）、乙酸銨（CAS：631-61-8），色譜純。

1.3儀器條件

（1）液相色譜條件。色譜柱：RestekRaptor C₁₈ （ 100mm×2.1mm ， 2.7μm ）；流動相：A相為5mmol?L^-1 乙酸銨 +1% 乙酸水溶液，B相為甲醇；進樣體積： 3μL ；柱溫： 40°C ；流速： 0.3mL?min^-1 洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序見表 1^[1-2] 專

（2）質譜條件。氮氣作霧化氣和干燥氣，流速分別為 3.0L?min^-1 和 10L?min^-1 ；氬氣作碰撞氣；空氣作加熱氣，流速為 10L?min^-1 ；電噴霧離子源，正負離子同時掃描；掃描模式：多反應監測（MultipleReactionMonitoring，MRM）；離子源接口電壓：+4.5 、 -3.5kV ；脫溶劑管溫度： 250‰ ；接口溫度：300^°C ；加熱模塊溫度： 450°C ；延遲時間： 1ms ：駐留時間： 10ms^[3] 號

1.4樣品溶液制備

準確稱取 5g （精確至 0.01g ）玉米均質樣品，置于 50mL 離心管中，加人 20mL 提取液（乙腈-水-乙酸 =70：29：1 ，體積比）渦旋提取 40min ，然后在 6000rmin^-1 轉速下離心 15min 。準確吸取 500μL 上清液，置于 1.5mL 離心管中，并加入 500μL 水渦旋混勻，在低于 10% 的溫度下以 12 000r?min^-1 轉速離心 15min ，最后將上清液過 0.2μm 聚四氟乙烯濾膜，備測[4-5]

1.5標準溶液配制

分別吸取 1mL 黃曲霉毒素 B₁ Σ₁（Σ₁₀₀Σ_μg?mL^-1 ）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 （ 1 000μg?mL^-1 ）、玉米赤霉烯酮（ 1 000μg?mL^-1 ）至 10mL 容量瓶中，用標準曲線溶劑（乙腈-水-乙酸 =35 64.5 0.5 ，體積比）定容，配制成濃度分別為10、100、 100μg?mL^-1 的單標標準溶液，再分別吸取100、1500、 200μL 的3種單標標準溶液至 10mL 容量瓶中，用標準曲線溶劑定容，配成濃度分別為0.1、15.0、 2.0μg?mL^-1 的混合標準中間液。分別吸取25、50、100、250、500μL 和 1000μL 的混合標準溶液至 10mL 容量瓶，用標準曲線溶劑定容，配制標準系列溶液。

1.6穩定同位素內標的添加

準確吸取 180μL1.4 制備的樣品溶液或1.5配制的標準系列溶液于 400μL 玻璃內插管中，再加入20μL 穩定同位素內標混合工作液（濃度分別為0.01、2.00、 0.20μg?mL^-1 ）渦旋混勻，上機待測。

2 結果與分析

2.1 線性關系

優化前后3種真菌毒素的色譜圖見圖1、圖2、圖3，校準曲線的線性方程與相關系數對比見表2。通過對比發現，優化后色譜峰的峰形較好，其中黃曲霉毒素 ΔB₁ 的色譜峰尤其明顯；優化后的相關系數均在0.999以上，其中黃曲霉毒素 ΔB₁ 的相關系數更是從優化前的0.9968762提升到 0.9997206 。

2.2精密度實驗

將混合標準中間液逐級稀釋成濃度分別為0.25、37.50、 5.00μg?L^-1 的混合標準溶液，取 125μL 的混合標準溶液加入空白玉米基質中，連續進樣6次，計算各真菌毒素色譜峰面積的相對標準偏差（RelativeStandardDeviation，RSD）。由表3可知，優化前、后精密度實驗的RSD均小于 10% ，符合實驗要求；但優化后的方法在一定程度上降低了RSD值，顯示出更佳的重復性。

2.3 加標回收實驗

將混合標準中間液逐級稀釋至濃度分別為0.25、37.50、 5.00μg?L^-1 的混合標準溶液，將 2000μL 的混合標準溶液加入空白玉米樣品中，按1.4方法進行樣品處理，所得加標回收率見表4。可以看出，優化前后3種真菌毒素的加標回收率均高于 90% ，符合方法準確度要求。值得注意的是，方法優化后，各真菌毒素的回收率均提高 2% 以上，表明其準確性和穩定性均有所提升，檢測效果更佳。

3結論

本文對黃曲霉毒素 ΔB₁ 、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮3種真菌毒素的已有測定方法進行了優化。在保證校準曲線具有良好線性關系的基礎上，方法的精密度和準確度均達到較高水平。同時，加標回收率提高 2% 以上，表明該優化方法在檢測谷物中上述3種真菌毒素方面具有更優的適用性和可靠性。

參考文獻

[1]國家糧食和物資儲備局.糧油檢驗主要谷物中16種真菌毒素的測定液相色譜-串聯質譜法：LS/T6133—

2018[S].北京：中國標準出版社，2018.

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[3]楊靜，哈益明，王鋒.高效液相色譜-串聯質譜法檢測花生中的黃曲霉毒素 B₁[J] 分析實驗室，2009，28（6）：35-38.

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[5]孫娟，李為喜，張妍，等.用超高效液相色譜 串聯質譜法同時測定谷物中12種真菌毒素[J].作物學 報，2014，40（4）：691-701.