鄰苯二甲酸丁芐酯與肺纖維化的關聯及潛在毒性分析

[摘要] 目的 探索鄰苯二甲酸丁芐酯（butyl benzyl phthalate，BBP）毒性機制對防治肺纖維化的意義。方法 采用網絡毒理學結合分子對接技術，通過PubChem、GeneCards等數據庫篩選BBP的作用靶點及肺纖維化相關靶點，利用韋恩圖分析交集基因。構建蛋白質–蛋白質相互作用網絡篩選核心靶點，并通過基因本體論和京都基因與基因組百科全書富集分析揭示通路機制。最后，利用AutoDock進行分子對接驗證核心靶點與BBP的結合模式。結果 共篩選出91個BBP誘導肺纖維化的潛在靶點，其中PTGS2、CYP3A4為核心靶點（結合能分別為–1.84kcal/mol、–1.68kcal/mol）。富集分析表明BBP通過G蛋白偶聯受體信號通路、鈣信號通路及環腺苷酸信號通路調控纖維化進程。分子對接證實BBP與核心靶點通過氫鍵和疏水作用穩定結合。結論 通過網絡毒理學為BBP誘導肺纖維化的分子機制提供初步見解，PTGS2和CYP3A4可能在BBP誘導肺纖維化中發揮關鍵作用，為環境毒物與疾病關聯的機制探索提供新的方法學參考。

[關鍵詞] 鄰苯二甲酸丁芐酯；肺纖維化；網絡毒理學；分子對接

[中圖分類號] R114" """"[文獻標識碼] A """""[DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2025.19.002

Association and potential toxicity analysis of butyl benzyl phthalate with pulmonary fibrosis

ZHOU Xinbei^1，2， LIANG Ningjuan¹， WU Ting¹， YU Dandan¹， JIANG Xiaohan¹， TENG Jingjing¹

1.Institute of Toxicology， Anhui Center for Disease Control and Prevention， Hefei 230601， Anhui， China; 2.Anhui Key Laboratory of Occupational Health， Second People’s Hospital of Anhui Province， Hefei 230041， Anhui， China

[Abstract] Objective To explore the significance of the toxicity mechanism of butyl benzyl phthalate （BBP） in prevention and treatment of pulmonary fibrosis. Methods In this study， we used network toxicology combined with molecular docking technology to screen the targets of BBP and those related to pulmonary fibrosis through PubChem， GeneCards and other databases， and analyzed the intersecting genes by using a Wayne diagram. Protein-protein interaction networks were constructed to screen the core targets， and the pathway mechanisms were revealed by Gene Ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Finally， molecular docking using AutoDock was performed to verify the binding patterns of core targets and BBP. Results A total of 91 potential targets of BBP-induced lung fibrosis were screened， among which PTGS2 and CYP3A4 were the core targets （binding energies of –1.84 kcal/mol and –1.68 kcal/mol， respectively）. Enrichment analysis showed that BBP regulated the fibrosis process through G protein-coupled receptor signaling pathway， calcium signaling pathway and cyclic adenosine monophosphate signaling pathway. Molecular docking confirmed that BBP was stably bound to the core target through hydrogen bonding and hydrophobic interaction. Conclusion This study provides preliminary insights into the molecular mechanism of BBP-induced pulmonary fibrosis through network toxicology， and PTGS2 and CYP3A4 may play key roles in BBP-induced pulmonary fibrosis， which provides a novel reference for the exploration of the mechanism of toxicant-disease association.

[Key words] Butyl benzyl phthalate; Pulmonary fibrosis; Network toxicology; Molecular docking

鄰苯二甲酸丁芐酯（butyl benzyl phthalate，BBP）是廣泛使用的鄰苯二甲酸酯，主要存在于潤滑劑、穩定劑、食品包裝、家居用品和醫療產品中^[1]。這些物質普遍存在于土壤、沉積物、空氣、水和食物中，在自然環境條件下表現出抗降解性，從而對人類新陳代謝、發育、繁殖和行為等基本生物功能構成嚴重威脅。生物監測研究已成功在不同人群的血液、尿液、精液、臍帶血、羊水和母乳中檢測到BBP及其代謝物^[2]。研究表明BBP可在城市固體廢物焚燒過程中大量釋放，其代謝產物可誘導活性氧生成，激活核因子κB和核苷酸結合結構域富含亮氨酸重復序列和含熱蛋白結構域受體3（nucleotide-binding domain leucine-rich repeat and pyrin domain- containing receptor 3，NLRP3）炎癥小體，促進促纖維化因子釋放，驅動成纖維細胞活化及膠原沉積，或通過DNA甲基化或組蛋白修飾影響纖維化相關基因表達。最近研究發現生活在石化廠附近的人群暴露于BBP與肺纖維化之間存在顯著關聯^[3]。肺纖維化是一種以局部氣管壁增厚、細胞外基質持續累積的慢性進行性疾病，死亡率高且尚無有效治療方法^[4]。盡管美國食品藥品監督管理局于2014年批準吡非尼酮和尼達尼布用于控制肺纖維化，但這些治療方法均與胃腸道出血和嚴重腹瀉等不良反應相關^[5]。肺移植仍是能延長晚期肺纖維化患者預期壽命的唯一干預措施。因此，當務之急是評估環境變量對肺纖維化的綜合影響，并研究其潛在的毒理機制。本研究旨在通過網絡毒理學初步評估BBP誘發肺纖維化的潛在不良影響及所涉及的分子機制，為探索環境相關毒物暴露水平及潛在危害提供理論依據。

1" 資料與方法

1.1 "BBP毒性網絡分析

從 PubChem數據庫檢索BBP的分子結構式，通過ADMETlab 3.0進行分析，以獲得與BBP暴露相關的初步信息。

1.2 "BBP的目標構建

在PubChem數據庫中檢索BBP二維分子式，并下載為SDF文件。BBP的2D結構如圖1所示，相應的SMILES號為CCCCOC（=O）C1=CC= CC=C1C=O）OCC2=CC=CC=C2。將該SDF文件用瑞士目標預測平臺預測，物種過濾器設置為“智人”，得到的數據即BBP的潛在靶點。

1.3 "篩選肺纖維化基因

使用GeneCards和OMIM數據庫構建疾病潛在靶點。在上述數據庫中使用“肺纖維化”一詞進行搜索。在剔除重復條目后，共發現13 795個疾病靶標。隨后，通過韋恩圖對數據庫進行重疊，發現91個潛在靶點，即BBP和肺纖維化的共同靶點。

1.4 "構建網絡和確定核心靶點

利用STRING數據庫構建BBP誘導肺纖維化的潛在靶點。將物種限制為“智人”，蛋白質–蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡的置信度閾值設定為中等水平（gt;0.4）。利用Cytoscape 3.10.1中的MCODE插件研究PPI網絡中的模塊。

1.5 "潛在靶點的基因功能和通路富集分析

利用Metascape數據庫對潛在靶點進行基因本體論（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。

1.6 "成分-靶點-通路網絡構建

首先編制一份概述成分–靶點–通路相互作用特性的表格，隨后將其上傳至Cytoscape軟件中，并根據需要對網絡結構的可視化進行調整。

1.7 "分子對接

目標蛋白質及其相應配體的基本結構分別從蛋白質數據庫和PubChem獲得。使用OpenBabel將其轉換為pdb格式。隨后使用PymOL軟件消除蛋白質中的水分子和原始配體，然后使用AutoDock1.5.6進行氫化和脫氫處理，并將得到的結構保存為pdbqt格式。使用AutoDockGrid進行分子對接分析，并使用PymOL對結果進行可視化。

1.8 "統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（"）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料以例數（百分率）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05，Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 "結果

2.1 "BBP的毒性分析

表1總結了與BBP有關的眼刺激、眼腐蝕、皮膚過敏和致癌可能性的預測結果。

2.2 "BBP誘導肺纖維化和肺損傷潛在靶點的鑒定

通過SwissTarget Prediction數據庫共鑒定出100個BBP作用靶點；從GeneCards和OMIM數據庫中獲取13 795個與肺纖維化密切相關的靶點。對這些靶點進行合并去除重復靶點，最終得到91個BBP誘導肺纖維化的潛在靶點，見圖2。

2.3" PPI網絡的構建和核心靶點的篩選

與BBP誘導的肺纖維化相關的PPI網絡有91個節點和256條邊，平均節點度為5.36。通過網絡分析對網絡節點的拓撲特征進行全面評估，重點包括度值和中位中心性等參數，見圖3A。節點的大小和顏色由相應基因的度值決定，紅色色調越深，節點越大，表示度值越高。PTGS2、TRPV1、HTR2A、DRD1、SLC6A2、CYP3A4、GRM5和JAK2等基因的度值最高，直觀地表現為圖中節點較大，紅色較深。MCODE算法有助于識別核心模塊，圖3B顯示由16個節點和41條邊組成的最重要模塊。根據度值將排在前8位的基因與核心模塊基因相交后，PTGS2和CYP3A4最終被確定為BBP誘導肺纖維化的關鍵基因，見圖3C。

2.4 "潛在靶標的GO分析

將上述潛在靶點進行GO分析，共確定945個有統計學意義的生物學過程（biological process，BP）、58個細胞成分（cellular component，CC）和114個分子功能（molecular function，MF）。根據富集分數進行排序，圖4展示最重要的10個BP、10個CC及10個MF。

2.5" 潛在靶標的KEGG分析

在BBP誘導的肺纖維化中，49條KEGG通路被確定為有統計學意義。表2展示富集分數排名前10的信號通路。

2.6 "BBP誘導肺纖維化的毒性網絡分析

如圖5所示，藍色表示核心靶點，粉紅色表示BBP，紫色表示信號通路。該圖囊括與BBP誘導肺纖維化有關的核心靶點和信號通路。核心靶點主要參與脂肪代謝、鈣信號轉導和cGMP通路相關的關鍵調控過程。

2.7" 分子對接

分子對接結果表明PTGS2和CYP3A4與BBP之間存在很強的結合相互作用，結合能低于零，表明它們之間有較強的親和力。圖6顯示PTGS2與BBP的結合能為–1.84kcal/mol，BBP可與PTGS2中的氨基酸殘基末端區域結合，主要為VAL–34、TRY–348、PHE–205、TYR–385、GLY–526、LEU–534和GLY–533。BBP與CYP3A4的結合能為–1.68kcal/mol，主要與CYP3A4氨基酸殘基ASN–197相互作用。

3" 討論

傳統毒理學主要通過細胞實驗或動物實驗等分子生物學手段對毒物的毒性進行評估。盡管傳統方法可準確反映毒物在體內的吸收、分布與代謝過程，但難以確定疾病、臨床癥狀及毒物之間的潛在因果

關系。網絡毒理旨在通過構建和分析計算機中的網絡模型全面深入地了解環境暴露毒物的毒性作用和機制^[6]。網絡毒理學不僅考慮多個靶點及其相互作用，還能為毒性評估提供全面信息，有助于制定更有效的安全措施和風險管理策略。

本研究采用網絡毒理學策略挖掘BBP和肺纖維化的靶點，發現BBP誘導的肺纖維化靶點91個，其中PTGS2的度值最高，且是核心模塊中的Hub基因，意味著它與BBP誘導的肺損傷存在相關，可能為肺纖維化的治療和藥物開發提供理論依據。PTGS2，又稱環氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX–2），是參與細胞急性炎癥反應的主要分子之一，在生理條件下表達水平低^[7-9]。Wang等^[10]研究表明COX–2可參與肺泡的炎癥反應及肺纖維化的早期過程。此外，相關研究也指出COX–2的特異性抑制劑可有效減輕小鼠肝臟和腎臟的纖維化程度^[11-13]?；诖?，采用COX–2抑制劑聯合一線抗纖維化藥物的治療方案，有望在不引發嚴重副作用的前提下，更有效地遏制纖維化患者的病情發展。

細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）家族的主要成員CYP3A4廣泛分布于肝、肺、胃腸等多種器官中，參與體內多種物質代謝。同時CYP450也是人體內最重要的Ⅰ期藥物代謝酶，75%～90%的常用臨床藥物被CYP450代謝^[14-15]。CYP3A4基因多態性決定其與疾病的發生、發展、治療等過程密切相關。在臨床用藥實踐中，即使同一種藥物，在不同種族或同一種族的不同個體之間，其臨床反應也存在顯著差異。這種個體對藥物的不同反應，往往預示個體不同的臨床結局。因此，深入研究CYP3A4的特性及其在藥物代謝中的作用，對優化治療策略、提高治療效果具有極為重要的意義。

筆者對潛在靶點進行富集分析，結果揭示與肺纖維化密切相關的信號通路，即G蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptor，GPR）信號途徑、鈣離子信號途徑及環腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號通路。GPR已被公認為成纖維細胞活化和纖維化進展的潛在驅動因素^[16-18]。GPR41是GPR家族成員之一，研究發現GPR41的缺陷可通過調節Sma和Mad相關蛋白2/3和胞外信號調節激酶1/2磷酸化以抑制成纖維細胞的分化和由此產生的肺纖維化，是肺纖維化發展的關鍵蛋白，靶向GPR41的藥理學可能為治療肺纖維化提供一種新的方法^[19]。本研究中的兩個核心靶標均富集在GPR信號通路中，筆者猜測核心靶標可能通過GPR參與BBP誘導的肺纖維化。cAMP由腺苷酸環化酶響應刺激性G蛋白的激活或通過阻斷抑制性G蛋白產生，并被磷酸二酯酶降解，是一種特征明確的第二信使，可激活蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）的磷酸化并進一步調節細胞信號通路^[20]。cAMP增加可抑制成纖維細胞增殖和細胞外基質合成，表現出明顯的抗纖維化作用^[21-22]。Hong等^[23]發現cAMP/PKA通路的上調可通過抑制內質網應激誘導的Ⅱ型肺泡上皮細胞中NLRP3炎癥小體激活緩解肺纖維化。BBP在肺纖維化疾病中表現出的毒性效應是多種信號通路之間復雜的相互作用和協同作用共同導致的。

在毒理學領域，分子對接技術的應用有助于深入研究毒性分子與蛋白質等大分子之間的相互作用機制。本研究結果證實兩個核心靶點在BBP誘導的肺纖維化中起重要作用，它們均以較低的結合能穩定地結合到BBP的活性口袋。

然而，本研究也存在一定的局限性：首先，本研究結果是基于計算機模型的預測，未來須進行實驗驗證和流行病學調查，以證實基于網絡的“計算機模擬”分析的結果；其次，最終篩選出的核心靶點可能來源于其他毒物或同系物，后續的實驗可通過設置單一暴露模型、同系物對比及劑量–效應關系等進行驗證。盡管如此，網絡毒理學和分子對接模型在對大量未充分研究的新環境毒物的評估方面仍有一定的促進作用，并提供毒理學評估和見解，從而闡明預防和治療策略，以減輕新環境毒物誘導損傷的有害影響。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻]

[1]"" GAO D W， WEN Z D. Phthalate esters in the environment： A critical review of their occurrence， biodegradation， and removal during wastewater treatment processes[J]. Sci Total Environ， 2016， 541： 986–1001.

[2]"" HENDERSON A L， COLAIáCOVO M P. Exposure to phthalates： Germline dysfunction and aneuploidy[J]. Prenat Diagn， 2021， 41（5）： 610–619.

[3]"" WANG C W， CHEN S C， WU D W， et al. Effect of dermal phthalate levels on lung function tests in residential area near a petrochemical complex[J]. Environ Sci Pollut Res Int， 2021， 28（21）： 27333–27344.

[4]"" RICHELDI L， COLLARD H R， JONES M G. Idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Lancet， 2017， 389（10082）： 1941–1952.

[5]"" RAGHU G， SELMAN M. Nintedanib and pirfenidone. New antifibrotic treatments indicated for idiopathic pulmonary fibrosis offer hopes and raises questions[J]. Am J Respir Crit Care Med， 2015， 191（3）： 252–254.

[6]"" HUANG R， OKYERE S K， SHAO C， et al. Hepatotoxicity effects of Ageratina adenophora， as indicated by network toxicology combined with metabolomics and transcriptomics[J]. Ecotoxicol Environ Saf， 2023， 267： 115664.

[7]"" SHANMUGAM N， FIGAROLA J L， LI Y， et al. Proinflammatory effects of advanced lipoxidation end products in monocytes[J]. Diabetes， 2008， 57（4）： 879–888.

[8]"" DUBOIS R N， ABRAMSON S B， CROFFORD L， et al. Cyclooxygenase in biology and disease[J]. FASEB J， 1998， 12（12）： 1063–1073.

[9]"" ALEXANIAN A， SOROKIN A. Cyclooxygenase 2： Protein- protein interactions and posttranslational modifications[J]. Physiol Genomics. 2017， 49（11）： 667–681.

[10] WANG Y， WEI Y， HE N， et al. Evaluation of cyclooxygenase-2 fluctuation via a near-infrared fluorescent probe in idiopathic pulmonary fibrosis cell and mice models[J]. J Mater Chem B， 2021， 9（31）： 6226–6233.

[11] FEITOZA C Q， GON?ALVES G M， SEMEDO P， et al. Inhibition of COX 1 and 2 prior to renal ischemia/ eperfusion injury decreases the development of fibrosis[J]. Mol Med， 2008， 14（11-12）： 724–730.

[12] KIM S M， PARK K C， KIM H G， et al. Effect of selective cyclooxygenase-2 inhibitor meloxicam on liver fibrosis in rats with ligated common bile ducts[J]. Hepatol Res， 2008， 38（8）： 800–809.

[13] REDING T， BIMMLER D， PERREN A， et al. A selective COX-2 inhibitor suppresses chronic pancreatitis in an animal model （WBN/Kob rats）： Significant reduction of macrophage infiltration and fibrosis[J]. Gut， 2006， 55（8）： 1165–1173.

[14] LEE J， BEERS J L， GEFFERT R M， et al. A review of CYP-mediated drug interactions： Mechanisms and in vitro drug-drug interaction assessment[J]. Biomolecules， 2024， 14（1）： 99.

[15] ZHOU S F， LIU J P， CHOWBAY B. Polymorphism of human cytochrome P450 enzymes and its clinical impact[J]. Drug Metab Rev， 2009， 41（2）： 89–295.

[16] KAMAL F A， TRAVERS J G， SCHAFER A E， et al. G protein-coupled receptor-G-protein βγ-subunit signaling mediates renal dysfunction and fibrosis in heart failure[J]. J Am Soc Nephrol， 2017， 28（1）： 197–208.

[17] HAAK A J， DUCHARME M T， DIAZ ESPINOSA A M， et al. Targeting GPCR signaling for idiopathic pulmonary fibrosis therapies[J]. Trends Pharmacol Sci， 2020， 41（3）： 172–182.

[18] PUENGEL T， DE VOS S， HUNDERTMARK J， et al. The medium-chain fatty acid receptor GPR84 mediates myeloid cell infiltration promoting steatohepatitis and fibrosis[J]. J Clin Med， 2020， 9（4）： 1140.

[19] REN Z， PAN X， LI J， et al. G protein coupled receptor 41 regulates fibroblast activation in pulmonary fibrosis via Gαi/o and downstream Smad2/3 and ERK1/2 phosphorylation[J]. Pharmacol Res， 2023， 191： 106754.

[20] ZACCOLO M， ZERIO A， LOBO M J. Subcellular organization of the cAMP signaling pathway[J]. Pharmacol Rev， 2021， 73（1）： 278–309.

[21] INSEL P A， MURRAY F， YOKOYAMA U， et al. cAMP and Epac in the regulation of tissue fibrosis[J]. Br J Pharmacol， 2012， 166（2）： 447–456.

[22] MAGENHEIMER B S， ST JOHN P L， ISOM K S， et al. Early embryonic renal tubules of wild-type and polycystic kidney disease kidneys respond to cAMP stimulation with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator/Na（+）， K（+）， 2Cl（-） Co-transporter- dependent cystic dilation[J]. J Am Soc Nephrol， 2006， 17（12）： 3424–3437.

[23] HONG Q， ZHANG Y， LIN W， et al. Negative feedback of the cAMP/PKA pathway regulates the effects of endoplasmic reticulum stress-induced NLRP3 inflammasome activation on type Ⅱ alveolar epithelial cell pyroptosis as a novel mechanism of BLM-induced pulmonary fibrosis[J]. J Immunol Res， 2022， 2022： 2291877.

（收稿日期：2025–03–14）

（修回日期：2025–06–12）