高產蝦青素紅法夫酵母發酵工藝及培養基優化

中圖分類號TS202.3文獻標識碼A文章編號 0517-6611（2025）12-0129-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.12.029

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Fermentation Process and Culture Medium Optimization for High Astaxanthin Producing by Phaffia rhodozyma ZHU Chao-yang，TIAN Shao-yang，LI Hui-ying etal（Luoyang Chihonbiotechnology Co.，Ltd.，Luoyang，Henan 47100

AbstractObjective]TostudytheefectsoffermentationconditionsandmedumfomulationontheproductionofastaxanthinbyPaffa rhodozma.MethdIntiallyinglefctoxpeintseoducedtvestigatettsofliiotempeaturendu quently，eachpotisiceatiadiiallstedoghglectxpetsialli tionalcomponentswreaddedorremovedfrothebasicfermentationmedim，andachodfcationwastestedseparately.Resultftera 120h fermentation process，the biomass increased from 22.0 to 38.4g/L ，while the astaxanthin yield rose from 38.5 to 150.1mg/L. [Conclusion]The optimal cultivation condition is 20% ， pH5.0.A nd the optimal medium formula is glucose 30.0g/L ， yeast extract 3.0g/L ，peptone 1.0g/L ， hydrolyzed soybean meal 4.5g/L ，corn steep powder 3.0g/L ，ammonium sulfate 5.5g/L ，MgSO4 ·7H2O 0.1g/L ;the cultivation time is 120h ：

Key wordsAstaxanthin; Phafa rhodozyma ; Culture medium optimization;Fermentation process optimization

蝦青素（Astaxanthin）是一種類胡蘿卜素[1]，化學名稱為^3，3′ -二羥基- ?β，β^′- 胡蘿卜素 ^-4，4′ -二酮，分子式為 C₄₀H₅₂ 0₄^[2] ，其廣泛存在于甲殼綱動物（如蝦、蟹）等、魚類（如鮭魚、紅鱒魚）及鳥類（如火烈鳥、紅鸚和火雞等）中[3]。其不僅賦予這些生物鮮艷的顏色，還具有很強的抗氧化能力[4-5]，增強宿主免疫功能[6]，抗炎，保護心血管系統，延緩衰老[7]，抑制腫瘤發生[8-9]等多方面的生物學功能，因此在飼料、化妝品、功能食品和醫藥等領域具有廣闊的應用前景[10-13] 。

目前，天然蝦青素可以通過大規模使用微血球藻（Haematococcuspluvialis）紅法夫酵母（Phaffiarhodzyma）或類胡蘿卜素生產菌（Paraccoccuscarotinifaciens）進行天然合成[14]。紅法夫酵母具有能夠利用多種糖作為碳源進行異養代謝，培養時間短，無需光照，能夠在發酵罐中實現高密度培養等優勢，具有廣闊的工業開發前景[15]。筆者以紅法夫酵母作為研究對象，通過單因素試驗方法，在 30L 中試發酵罐中進行發酵培養基成分及工藝條件的優化，探討影響紅法夫酵母發酵過程的關鍵營養組分及其重要培養控制參數，旨在為該級別工藝優化提供參考依據和理論支持。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株。紅法夫酵母（Phaffia rhodozyma）CICC33064為經紫外、硫酸二乙酯、 ⁶⁰Coγ 射線等誘變劑多次誘變篩選出的1株高產蝦青素菌株 PR20-301。

1.1.2主要試劑。葡萄糖購自河北德瑞淀粉有限公司；玉米漿干粉和蛋白脈購自上海緣肽生物技術有限公司；硫酸銨購自江蘇科倫多食品配料有限公司；酵母膏購自安琪酵母股份有限公司；豆粕購自中儲糧油脂有限公司；堿性蛋白酶購自南寧龐博生物工程有限公司。

1.1.3種子培養基。種子培養基：葡萄糖 25.00g/L ，酵母膏10.00g/L，KH₂PO₄0.25g/L，MgSO₄?7H₂O 0.10g/L

1.1.4基礎發酵培養基。基礎發酵培養基：葡萄糖30.00g/L ，玉米漿干粉 3.00g/L ，硫酸銨 3.00g/L KH₂PO₄ 0.25g/L，MgSO₄?7H₂O0.10g/L ，泡敵 0.50g/L 。

1.1.5破壁萃取液。二甲亞砜（DMSO）與丙酮混合液V：V=5：1 。

1.1.6主要設備。 30L 四聯發酵罐由上海百倫生物科技有限公司生產。

1.1.7主要檢測儀器。723PC型可見光分光光度計由上海舜宇恒平科學儀器有限公司生產；SBA-40E生物傳感分析儀由濟南延和生物科技有限公司生產；FA1204B電子天平由上海天美天平儀器有限公司生產；高速離心機由上海安亭科學儀器廠生產。

1.2方法

1.2.1種子培養方法。用接種環取2＼～3環斜面菌種接種于裝液量為 50mL 的 500mL 三角瓶中， 20°C 搖床轉速為190r/min ，培養時間 24h 。

1.2.2發酵培養方法。按照 10% 接種量，將培養好的種子接種于裝液量為 16.5L 的 30L 發酵罐中，按照試驗方案設定的溫度、攪拌速度和通氣量等參數培養。

1.2.3豆粕水解方法[16-17]。將豆粕粉碎至80目，按照料水比 1：10 將粉碎后的豆粕加入水中，用 1mol/LNaOH 溶液調節 pH 至9.0，在水浴鍋中保持溫度 65^°C ，并滴加NaOH溶液維持 pH8.9～9.1 水解 10h 。

1.2.4發酵培養物中葡萄糖檢測方法。采用SBA-40ES型生物傳感分析儀進行檢測[18-19]。其工作原理為：葡萄糖 + 固定化酶O₂+H₂O 葡萄糖酸 +O₂+H₂O₂ 。將樣品中葡萄糖含量稀釋至 0～1000mg/L，pH 保持6＼～8，由定量進樣針吸取25μL 樣品注人反應池，含有樣品的底物在樣品室內迅速按照一定比例混合均勻，底物透過酶膜圈的外層與固定化酶層接觸并反應，反應放出的 H₂O₂ 再透過酶膜圈的內層與白金-銀電極接觸，并產生電流信號，該電流信號與底物濃度成線性比例關系，經微機計算后可直接顯示并打印結果。

1.2.5發酵培養物中生物量檢測方法。取清潔干燥的 5mL 離心管，稱重記錄離心管重量 M₀ （精確至 _0.0001g） ，取 4mL 發酵液注人離心管中， 8000r/min 離心 5min ，倒去上清液。用純化水重懸洗滌沉淀3次，然后將沉淀放入 105°C 烘箱中烘干至恒重，烘干后稱量離心管和干菌體的總重量 M_r （精確至 _0.0001g ，發酵液中生物量計算為：生物量 （g/L）=250×（M₁-M₀）。

1.2.6發酵培養物中蝦青素快速檢測方法[20-21]。取發酵液4mL（V₁） 至 5mL 離心管中， 8000r/min 離心 10min ，棄去上清液。加人 4mL 破壁萃取液，輕輕攪拌打散使酵母細胞全部懸浮，置于超聲波清洗機中超聲 5min 后 8000r/min 離心。上清液倒入 50mL（V₂） 容量瓶中，底部細胞再次用 4mL 破壁萃取液重懸，重復萃取至菌體呈灰白色，最后用三氯甲烷定容至 50mL ，于波長 487nm 處檢測吸光度值 A 。

總類胡蘿卜素總量 （μg/mL）=A?V₂/（E?V₁） 式中：A為吸光度； V₂ 為類胡蘿 h 素溶液體積， mL;V₁ 為所耗發酵液體積， mL;E 為消光系數（0.16）。

2 結果與分析

2.1溫度和 pH 對紅法夫酵母發酵的影響采用基礎發酵培養基，在 30L 發酵罐中控制不同培養溫度進行 ^48h 發酵培養，通過考察不同溫度下培養物中的生物量變化，確定最佳培養溫度，結果如圖1所示。從圖1可見，當發酵培養溫度控制為 20% 時生物量最大，達 8.5g/L ，低于或高于20% 時細胞生長均受抑制，特別是當溫度高于 22^°C 后，生物量急劇下降，當培養溫度為 28^°C 時生物量僅為 0.5g/L ，說明較高的溫度不適合紅法夫酵母的生長。

當發酵溫度為 20% ，通過控制不同 pH 進行 120h 發酵培養，研究不同 pH 下生物量和蝦青素產量，結果如圖2所示。從圖2可見，當發酵培養 pH 控制為5.0時蝦青素產量最大，達 38.5mg/L 。值得注意的是當 ΔpH 為5.5和6.0時有較高的生物量， pH5.5 時，生物量達到最大值，為 22.0g/L ，但蝦青素產量并沒有 pH5.0 時高，說明酵母細胞生長和蝦青素合成的最佳 pH 不一致。因此，采用 pH5.0 進行發酵培養。

2.2培養基中初始葡萄糖濃度和培養過程中葡萄糖濃度對紅法夫酵母發酵的影響從圖3可見，當初始葡萄糖濃度為30.0g/L 時，生物量和蝦青素產量最大，分別達到 20.5g/L 和39.6mg/L 。在此基礎上，控制培養過程中葡萄糖含量，從圖4可見，培養過程中控制葡萄糖濃度為 20.0g/L 時，生物量和蝦青素產量達到最大，生物量達 22.3g/L ，蝦青素達42.3mg/L_o

2.3培養基中不同氮源對紅法夫酵母發酵的影響基礎發酵培養基中的氮源成分有2種，分別為玉米漿干粉和硫酸銨，其中，玉米漿干粉作為有機氮源，而硫酸銨則是無機氮源。首先，通過單因素試驗確定玉米漿干粉的較優添加量；其次，在固定玉米漿最佳添加量的前提下，再通過單因素試驗確定硫酸銨添加量。由于玉米漿干粉作為一種有機氮源，其營養成分相對單一，可能缺乏一些生長因子和維生素等關鍵成分而限制微生物的生長和代謝。因此，筆者進一步研究了其他幾種有機氮源一一酵母膏、蛋白脈及豆粕水解液的添加對發酵過程的影響，試驗結果見圖5＼～9。

由圖5、圖6可見，玉米漿干粉添加量為 3.0g/L 時，蝦青素產量和生物量達到最大值，分別為 43.2mg/L 和 23.5g/L 在此基礎上，硫酸銨添加量為 5.5g/L 時，發酵液中的生物量和蝦青素產量達到最大值，分別為 25.6g/L 和 48.2mg/L_o 分別再增加其添加量也不能提高蝦青素產量和生物量含量，反而有一定抑制作用，說明每種氮源添加量并不是越多越好。

由圖7＼～9可見，有機氮源酵母膏、蛋白肺和豆粕水解液的加入可以提高紅法夫酵母的生物量和蝦青素產量。加入酵母膏后再加入蛋白脈和豆粕水解液也能提高酵母的生物量和蝦青素產量，說明多種來源的復合有機氮源對紅法夫酵母發酵有促進作用。綜上，酵母膏添加量為 3.0g/L ，蛋白陳添加量為 1.0g/L ，豆粕水解液添加量為 4.5g/L 時，其生物量和蝦青素產量最高，分別為 31.2、33.5、38.8g/L 和112.6、125.9，134.1mg/L。

2.4 KH₂PO₄ 添加量對紅法夫酵母發酵的影響由圖10可見， KH₂PO₄ 的加入對生物量有一定的促進作用，但對蝦青素產量有抑制作用。這反映了 KH₂PO₄ 對菌體生長有益，而對菌體次級代謝產物蝦青素的積累反而不利。因此，筆者選擇去掉 KH₂PO₄ 。

2.5發酵動力學曲線使用優化后的發酵培養基：葡萄糖30.0g/L ，酵母膏 3.0g/L ，蛋白陳 1.0g/L ，豆粕（經水解）4.5g/L ，玉米漿干粉 3.0g/L ，硫酸銨 5.5g/L，MgSO₄?7H₂O 0.1g/L ，進行 ^144h 的連續補料發酵，從 24h 開始每隔 ^12h 取樣檢測培養物中生物量和蝦青素產量，結果見圖11。從圖11可見，在 56h 之前，生物量增長較快，之后增長變慢，細胞生長進入平臺期，到 120h 時生物量最大，達 38.4g/L，120h 之后生物量開始緩慢下降，說明細胞進入衰退期。蝦青素產量從 36h 開始快速合成，但 56～68h 合成速度變緩， 68～ 120h 又出現快速合成，到 120h 蝦青素產量最大，達到150.1mg/L ，之后開始降低。由此可見，蝦青素的合成和細胞的生長密切相關，但又不完全依賴于細胞的生長，屬于典型的次級代謝發酵。

3結論與討論

在發酵工業中，將一個菌株從實驗室規模培養轉化為生產規模培養是復雜的過程，通常包括搖瓶小試、發酵罐小試、中試，直至最終的生產級放大。然而，由于不同規模培養體系的差異，每階段都難以完全復制前一階段的工藝參數，因此需要借鑒前期參數并進行獨立優化。特別是從搖瓶過渡到發酵罐階段時，由于試驗設備數量有限，難以實施復雜的正交和響應面試驗設計，這使得單因素試驗成為這一階段工藝優化的一種高效且精確的方法。該研究在 30L 發酵罐規模上探討了影響紅法夫酵母發酵生產蝦青素過程中的關鍵營養成分及主要培養控制參數。首先，對發酵控制參數中的溫度和pH進行了單因素優化，試驗結果顯示，最適培養溫度為 20% ，最適發酵 pH 為5.0。對基礎發酵培養基中的各組分進行了單因素試驗，進一步優化了培養基配方。在優化后的基礎發酵培養基的基礎上添加或去除特定營養組分并逐個進行試驗。經過一系列優化后，得到了一組能夠顯著提升蝦青素產量的培養基和培養方法。經 120h 的發酵培養，酵母細胞的生物量從優化前的 22.0g/L 提高到了優化后的38.4g/L ，蝦青素產量也從優化前的 38.5mg/L 顯著增加至優化后的 150.1mg/L， 。該研究結果為該級別工藝優化提供了重要的參考依據和理論支持。

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