南唐欽陵墓室腐蝕壁畫絲狀藍(lán)藻的形態(tài)分析與分子鑒定

中圖分類號：Q949.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1000-2367（2025）04-0118-06

墓室、洞窟經(jīng)考古挖掘后，由于室內(nèi)高濕環(huán)境加上游客增多，空氣及灰塵中的藻類及真菌孢子常在這些室內(nèi)的巖畫、壁畫繁殖滋生，遮蓋壁畫、巖畫上的圖案，使其無法辨認(rèn)，嚴(yán)重?fù)p害這些壁畫、巖畫的考古研究價(jià)值和觀賞價(jià)值[1-2].由于不同壁畫制作材料及保存環(huán)境不同，滋生的藻類及其他微生物的種類也不同，因此近年來洞窟、墓室等這些特殊生境中的藻類備受關(guān)注[3].這些特殊生境中的藻類以氣生藍(lán)藻為優(yōu)勢種類，這些藻種的分離與鑒定對于文物保護(hù)研究及豐富藍(lán)藻的多樣性具有重要意義.

傳統(tǒng)的藍(lán)藻分類系統(tǒng)是根據(jù)藻種的形態(tài)特征，采用植物學(xué)命名法則進(jìn)行命名和描述的，但由于有些藻種缺乏典型的形態(tài)鑒定特征，因此給藍(lán)藻鑒定工作帶來很大的困難.而隨著現(xiàn)代分子分析技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究利用16SrDNA基因測序?qū)λ{(lán)藻進(jìn)行分類[4-5]，通過分子分析證明藍(lán)藻并非單系，而是多系的，因此以系統(tǒng)發(fā)育分類為基礎(chǔ)，結(jié)合形態(tài)學(xué)和生態(tài)特征的多相法在藍(lán)藻分類中得到廣泛應(yīng)用[6-7]，已成為藍(lán)藻分類學(xué)修訂的基礎(chǔ)和最佳方法.從2014年到 2022年，多相法的應(yīng)用已促進(jìn)了80多個(gè)新屬的新分類群的建立[8].

南唐兩座陵墓是中國五代十國時(shí)期最大的帝王陵墓群，對研究唐宋時(shí)期的建筑、帝王陵墓制度和藝術(shù)都具有重要意義.自發(fā)掘以來，由于人為活動(dòng)的影響，墓室壁畫上滋生大面積的苔蘚、藻類、真菌等，對壁畫的觀賞、研究造成嚴(yán)重的損害.XING 等[9]等人通過宏基因組學(xué)方法對南唐兩座陵墓之一的壁畫樣本進(jìn)行了分析.結(jié)果表明該壁畫以變形菌門、放線菌門和藍(lán)藻門占優(yōu)勢.本研究從該墓室腐蝕壁畫樣本中分離了1株絲狀藍(lán)藻，進(jìn)行16SrDNA基因序列的分析，并結(jié)合形態(tài)學(xué)和生境分析，確定該藻株為藍(lán)藻門細(xì)點(diǎn)絲藻目（Oculatellales）細(xì)點(diǎn)絲藻科（Oculatellaceae）阿爾伯塔（Albertania）屬的種類.在 AlgaeBase 中，阿爾伯塔（Albertania）屬目前共有6種.

材料與方法

1.1 樣品的采集

樣本采集于南京市南唐欽陵墓室墻壁，采集時(shí)間為2020年8月，墓室潮濕，具有冷凝水.

1.2 藻種的分離

將采集的樣本放在6孔的無菌細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入適量的BG11的培養(yǎng)基，放在 25°C ，光照強(qiáng)度為1 000lx ，光周期 12h：12h 的光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 2～4 周后，在孔板中取1滴樣品，采用毛細(xì)管分離方法，挑取單根藻絲，反復(fù)清洗后，放入48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng) 30d ，可得到純培養(yǎng)物，再將純化的藻種轉(zhuǎn)接到裝有 5mL 滅菌的 BG11培養(yǎng)基的螺口試管中，保存于中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫，編號為FACHB-3649.

1.3 形態(tài)觀察

取少量藻絲在型號為OLYMPUSBX53的顯微鏡上進(jìn)行觀察，采用型號為DP80的CCD進(jìn)行圖像采集，拍照及數(shù)據(jù)分析通過其附帶的圖像分析軟件Cell Sens Standard（V1.14）進(jìn)行.隨機(jī)選取50根藻絲測量和統(tǒng)計(jì)藻細(xì)胞的長和寬.

1.4 超微結(jié)構(gòu)觀察

取 1.5mL 藻液離心后，用無菌培養(yǎng)基清洗2次，用戊二醛-俄酸固定后，用系列乙醇逐級脫水，脫水后的樣品由中國科學(xué)院水生生物研究所分析測試中心進(jìn)行包埋切片染色處理，最后在 HitachiHT-7700 型透射電鏡下觀察、拍照.

1.5 藻細(xì)胞DNA的提取及PCR擴(kuò)增、測序

取 2mL 培養(yǎng)的純藻種，用無菌水清洗 2～3 次后，DNA提取采用植物組DNA提取的試劑盒，用于擴(kuò)增16SrDNA 的引物為F1： 5^′ -TTGATCCTGGCTCAGGATGA- 3^′ ， 1480 ： 5^′ - AGTCCTACCTTAGGCATC-CCCCTCC- 3^′[10] ，由武漢艾康健生物科技有限公司合成，PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系為 50μL ，包含引物 1μL ，mix反應(yīng)液 25μL ，模板 1μL ，無菌去離子水 22μL ，PCR擴(kuò)增條件， 94^°C 預(yù)變性 變性 30s 55°C 退火 30s，72^°C 延伸 2min，35 個(gè)循環(huán)， 72°C 延伸 5min ，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，檢測后的樣品送武漢艾康健生物科技有限公司進(jìn)行測序.

1.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

將測序后獲得的序列通過 NCBI上的 blast 進(jìn)行比對，并從Genbank 中下載近緣序列，在 http：/www.phylogeny.fr/網(wǎng)站進(jìn)行在線比對及提取保守序列.提取的保守序列使用MEGA7.0進(jìn)行最適模型評估，用于貝葉斯分析（BI）和最大似然法（ML）分析，ML法模型為 K2+G+I ，步展值設(shè)為1000，空位或缺失位點(diǎn)均當(dāng)作配對刪除（Pairwise deletion）處理，貝葉斯分析采用MrBayesv 3.2.6運(yùn)行10 000 000代，每100 代取樣，剔除 25% 老化樣本，至平均標(biāo)準(zhǔn)偏差低于0.01，根據(jù)剩余的樣本構(gòu)建進(jìn)化樹，分枝支持率用貝葉斯后驗(yàn)概率表示.ML和BI2個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹均以Microcystis為外類群.

2 結(jié)果與分析

2.1 阿爾伯塔（Albertania）屬的形態(tài)特征

該屬的藻種為絲狀體，在固體斜面上形成黑褐色斑塊藻落，在光學(xué)顯微鏡下（圖1），可觀察到藻絲體直，或彎曲盤繞，具鞘，無色，緊貼著絲狀體，無明顯收縊，藻絲常隨機(jī)出現(xiàn)斷裂，有的具假分枝，細(xì)胞長短于寬，長約 1.7μm ，寬約 2.57μm ，頂端具1個(gè)圓形的細(xì)胞，不產(chǎn)生異形胞和厚壁孢子，其繁殖主要通過產(chǎn)生藻殖段.

通過透射電鏡的切片觀察（圖2），也可以看出該屬種的細(xì)胞呈圓柱形，末端細(xì)胞圓形，通過藻殖段進(jìn)行繁殖，鞘厚，胞內(nèi)具 8～14 條側(cè)生類囊體（圖2）.

2.2 分子系統(tǒng)分析

通過上述引物擴(kuò)增FACHB-3649 藻株的16SrDNA基因，獲得長度為1275bp的序列片段，其與阿爾伯塔（Al-bertania）屬其他藻株16SrRNA的序列相似度為96.86%～98.06% （表1），與 Albertania alaskaen-sis T27、Albertania alas-kaensis Lll、AlbertaniaalaskaensisKV23這3個(gè)藻株相似度最高，達(dá)到 98.06% ，與模式種AlbertaniaskiophilaSA373相似度達(dá)到 97.34% .基于ML和貝葉斯系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建方法，以 Microcystis aeruginosa（NRO74314.1）作為外類群，選取Oculatella 等7個(gè)屬53條序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，從圖3可以看出在系統(tǒng)發(fā)育樹中，F(xiàn)ACHB-3649與阿爾伯塔屬藻株聚為一個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化分支，與Oculatella屬親緣關(guān)系較近，形成姐妹分支，其他幾個(gè)屬則單獨(dú)成簇，與阿爾伯塔（Alber-tania）屬親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，從系統(tǒng)進(jìn)化樹也可以看出FACHB-3649與Albertania skiophila SA373、Alber-taniasp.BACAO713形成的分支進(jìn)化關(guān)系緊密，其ML自展值和貝葉斯后驗(yàn)概率分別為 94% 和1，這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了FACHB-3649屬于阿爾伯塔（Albertania）屬.

注：以ML法構(gòu)建的系統(tǒng)樹為基礎(chǔ).節(jié)點(diǎn)數(shù)字顯示大于50/50%的ML自展值和貝葉斯法后驗(yàn)概率。

3討論與結(jié)論

阿爾伯塔（Albertania）屬是 ZAMMIT等[1]在對馬耳他拉巴特地下墓穴的光自養(yǎng)生物膜研究中，根據(jù)分子進(jìn)化發(fā)育特征及藻絲形態(tài)特征，并結(jié)合生境分析，將其從聚球藻目細(xì)鞘絲藻科中分離出來的新屬.根據(jù)2014年KOMAREK等提出的藍(lán)藻分類的8目系統(tǒng)中，聚球藻目 Synechococcales 分成11科：Synecho-coccaceae、Merismopediaceae、Prochloraceae、Coelosphaeriaceae、Acaryochloridaceae、Chamaesiphonaceae、Heteroleibleiniaceae、Leptolyngbyaceae、Pseudanabaenaceae、Romeriaceae 和 Schizotrichaceae.其中細(xì)鞘絲藻科Leptolyngbyaceae 是最大的一個(gè)科，包括 Leptolyngbya、Oculatella等14 個(gè)屬[12-14].近十年來，根據(jù)棲息地特征以及DNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，細(xì)鞘絲藻科的分類不斷修訂中.2018年 MAI等[14]將細(xì)鞘絲藻科劃分為4個(gè)單系類群，其中有2個(gè)重新定義的科（Prochlorotrichaceae 和Leptolyngbyaceae）以及2個(gè)新提出的科（Oculatellaceae 和 Trichocoleaceae），其中細(xì)點(diǎn)絲藻科（Oculatellaceae）是細(xì)鞘絲藻科（Leptolyngbyaceae）的姐妹分類群，包含了多種來自土壤和潮濕巖石的亞氣生分類群，這個(gè)科中的一些類群是從細(xì)鞘絲藻科中分離出來的.而在最新的藍(lán)藻分類學(xué)中，STRUNECKY等[8根據(jù)藍(lán)藻基因組及16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育分析，將藍(lán)藻分為 Gloeobacterales、Thermostichales、Aegeococcales、Acaryochloridales、Pseudanabaenales、Gloeo-margaritales、Prochlorotrichales、Synechococcales、Nodosilineales、Oculatellales、Leptolyynbyales、Geitler-inematales、Desertifilales、Oscilloriales、Coleofasciculales、Spirulinales、Chroococcales、Gomontiellales、Chroococcidiopsidales 和 Nostocales，共 20目，細(xì)點(diǎn)絲藻科（Oculatellaceae）是細(xì)點(diǎn)絲藻目（Oculatelales）唯一的科，包含17屬，阿爾伯塔（Albertania）屬是其中的一個(gè)屬.

阿爾伯塔（Albertania）屬的藻種基本是氣生的種類，常在潮濕弱光的土壤或者巖石、壁畫表面形成帶顏色的生物膜，其地理分布廣泛，已報(bào)道的有6種，其中模式藻株Albertania skiophila 這個(gè)種來自馬耳他拉巴特以及意大利的地下墓穴光合生物膜[1]，Albertania egbensis 和Albertania latericola 這兩個(gè)種則來自尼日利亞的一個(gè)院子的磚頭上[15]，Albertania obscura 這個(gè)種來自葡萄牙亞速爾群島的一個(gè)天然火山洞穴的巖石上形成的生物膜[16]，Albertania pratti這個(gè)種則來自美國黃石公園的火洞湖岸邊未被水淹沒的區(qū)域[17]，Albertaniaalaskaensis這個(gè)種則是來自美國阿拉斯加小溪邊的柳樹根上[18].

本研究對墓室腐蝕壁畫分離的這株絲狀藍(lán)藻的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征及16S rDNA序列進(jìn)行分析，并結(jié)合該屬的生境特征，從而確定這株藍(lán)藻的分類地位.這是阿爾伯塔（Albertania）屬在我國首次報(bào)道，對于豐富藍(lán)藻多樣性研究以及后續(xù)開展腐蝕壁畫保護(hù)性研究具有重要的意義.

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Morphological analysis and molecular identification of filamentous cyanobacteria from deteriorated wall paintings of Qinling Tomb in the Southern Tang Dynasty

Zheng Linglingl， Zhang Qi¹ ，Li Tianli ¹ ， Xing Wei2，Cai Fangfang3，Yu Gongliangl ，Song Lirong （1.Instituteof Hydrobioglogy，Chinese Academy of Sciences，Wuhan 43o072，China；2.Colege of Life Sciences， University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 101408，China；3.School of Animal Science and Nutritional Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 43oo48，China）

Abstract：A filamentous cyanobacteria strain was isolated from deteriorated wall paintings of Qinling Tomb in the Southern Tang Dynasty.The habitatof the strain was similar with Albertania（Oculatelales，Oculatellceae）genus.Through morphologicalandmolecularphylogeneticanalysis，theresultsshowed that：（1）Thefilamentswere straight，orcurvedand coiled，sheathed，withoutobviousrestraint.Thesheathwascolorless，tightlyatachedtothetrichomes.Thecelswereshorter thanwide，noheterocytesorakinetes，8-14lateral thylakoids inthecellThese morphological characteristicsweresimilarto the genus Albertania ;（2）The l6S rDNA sequence of the strain was 98.06% similarity to the genus Albertania and the phylogenetic nalyses basedon16S rDNA sequence showed that the strain was clustered with Albertania.The morphologicaland molecular phylogeneticevidence supported the strain tobeamemberof Albertaniagenus.The genus Albertania is the newly recordedgenusin China.This wasthe firsttimetoisolatecyanobacteria from tomb habitats in China，whichwasofgreat significance for the protection of cultural relics and the enrichment of the diversity of cyanobacteria.

Keywords：wall painting；Albertania ;cyanobacteria; taxonomy;new record