一株耐低溫抗鹽堿異養硝化菌株CS-6的除氮特性研究

中圖分類號：X172 文獻標志碼：A 文章編號：1004—6755（2025）07-0017-04

Denitrogenate characterization studies by a strain of heterotrophic nitrifying bacteria CS-6 resistant to low temperature resistant and salt alkali resistant *

JIANG Wenwen1， TIAN Xiangli2，WANG Guodong1，GUO Enmian1 ， XIN Zhaozhe1，TAN Jiabo1 （1.School of Marine Science and Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266lo9，China; 2.Fisheriescollege，OceanUniversityof China，Qingdao 266oo3，China）

Abstract：Low temperature，high salinityand other environments conditions willaffect the nitrification activity of microorganisms and reduce the removal of ammonia nitrogenand nitrite nitrogen inwater.A heterotrophic nitrifying bacterium CS^-6 was isolated from the biofilters of coldwater fish recirculating aquaculture system and identified as Bacillus by 16S rRNA. The nitrogen removal characteristics of the later were studied. The results show that Strain CS ?-6 can achieve removal rates of 100% and 91.67% for ammonia nitrogen and nitrite nitrogen，respectively，within 72 hours.The removal rates for ammonia nitrogen and nitrite nitrogen can reach up to 100% and 99% ， respectively，at low temperatures of 15^°C ，salinity ranging from 0‰ to 50‰ ， and pHlevels between 6 and 9. This indicates excelent cold resistance and salt一tolerance properties，demonstrating that Strain CS -6 has high water purification efficiency and broad application potential.

Key words：low temperature;halo一alkali tolerance;heterotrophic nitrifying bacteria;aquaculture water treatment

水產養殖活動產生的殘餌以及養殖動物的排泄物會導致養殖水體中的氨氮和亞硝酸氮升高[1]，高濃度的氨氮和亞硝酸氮會對養殖動物產生毒害[2]，因此，有效降低養殖水體中的氨氮和亞硝酸氮，維持良好的養殖水質環境，是保證養殖安全的基本要求。

生物除氮因具有無二次污染、無殘留等特點，成為目前水產養殖中廣泛應用的除氮方法之二[3]。異養硝化細菌因可以有效去除水體的氨氮和亞硝酸氮，近年來被廣泛研究[3]。通常硝化過程的最適溫度為 ，溫度降低會導致硝化效率隨之下降。但對于許多冷水魚類如大西洋鮭魚（Salmosalar）、大菱鲆（Scophthalmusmaximus）等，養殖溫度在 16^°C 左右[5]，常導致許多異養硝化細菌無法充分發揮硝化活性，影響對水體氨氮和亞硝酸氮的控制。另外，許多異養硝化細菌對鹽度、pH值等變化敏感，也會影響硝化性能[6。因此，篩選耐低溫、適應鹽堿變化的異養硝化菌株顯得尤為迫切。

本研究從冷水魚循環水養殖系統生物濾池中分離篩選出一株異養硝化菌株，通過對其進行除氮特性檢測，發現菌株具有較高的硝化特性，并且對低溫和高鹽堿條件均具有良好適應性。研究結果對于豐富異養硝化菌種資源庫，并為未來該菌株在實際養殖過程中的開發和應用提供了重要的科學依據。

1材料與方法

1.1 菌株來源

用于進行菌株篩選的樣品取自山東省日照市冷水魚循環水養殖系統生物濾池的生物濾料。

1.2 培養基

富集培養基：1g KNO₂ ， MgSO₄ 0.1g， .2H₂O0.26g，K₂HPO40.5g，CaCO₃ 1g FeSO₄ ： 7H₂O 0.183g ，葡萄糖 0.3g ，酵母膏0.03g ，蒸餾水 1000mL 。

分離培養基：1g KNO₂ ， MgS₄ 0.1g， ： 2H₂OO.26g，K₂HPO₄O.5g，CaCO₃ 1g ，FeSO4. 7H₂O 0. 183g ，葡萄糖 0.3g ，酵母膏0.03g ，瓊脂粉 15g ，蒸餾水 1000mL 。

氮基礎降解溶液： 1.575g 葡萄糖， 0. 053 5g ΔNH₄Cl 0.069gNaNO₂，0.085gNaNO₃，1000mL 蒸餾水。

1.3 菌株分離與鑒定

取生物填料 2g ，以震蕩方式洗脫填料上的生物膜制得菌懸液。按照 10% 的體積比將菌懸液接種到富集培養基中，于 15°C，160r/min 的條件下培養富集。富集結束后涂布于分離培養基中培養，挑取單菌落在分離培養基上劃線純化。純化后的菌株接種至氮基礎降解溶液中，篩選出具有較高無機氮去除能力的菌株 CS^-6 。

菌株 CS^-6 采用水煮法提取DNA，使用27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCTAG-3和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）

通用引物進行PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送至青島擎科天成生物技術有限公司進行測序分析。

1.4菌株 cos-6 對不同形態氮的去除能力測定

將處于對數生長期的菌株 CS-6 調整菌液濃度為 10⁶ 后，按照 10% 的接種比例接種至氮基礎降解溶液中，在 15^°C ，轉速為 160r/min 條件下，間隔 24h 取樣，連續測定 ^120h 內氨氮（NH₄⁺-N） 、亞硝酸氮、硝酸氮和總氮的濃度，計算去除率。總無機氮的濃度為氨氮、亞硝酸氮和硝酸氮濃度之和。

1.5不同環境條件對菌株CS-6氨氮和亞硝酸氮去除能力及生長的影響

分別研究不同溫度、鹽度和 ΔpH 值條件下對菌株 CS^-6 的生長性能及其氨氮和亞硝酸氮去除能力，每個處理設置3個重復。溫度分別為10%15%.20%.25%.30%.35% ;鹽度分別為 0‰ 、 10‰ 、 20‰ 、 30‰ 、 40‰ 、 50‰ pH 值分別為6、7、8、9。

試驗前，先將菌株 CS^-6 預培養至對數生長期，調整菌液濃度為 10⁶ ，然后按照 10% 的接種比例接種至降解液中。在試驗的第0天和第3天測定不同處理條件下降解溶液中的氨氮和亞硝酸氮濃度以及細菌的生長情況 （OD₆₀₀ ），并計算去除率。

1.6 測定方法

氨氮采用靛酚藍法測定，亞硝酸氮采用重氮一偶氮光度法測定，硝氮依據Schnetger等[7]的方法進行測定，總氮采用消解法測定，細菌的OD₆₀₀ 值使用酶標儀SYnergy2測定。

1.7 數據處理

將所測得的PCR產物序列與NCBI中已登錄的 序列進行核昔酸同源性比較，使用MEGA7.0軟件構建菌株的系統發育樹。

去除率的計算公式如下：

n=（C₀-C_n）/C₀×100%

式中： n 為去除率， %;C₀ 為初始的氮濃度，mg/L;C_n 為試驗結束時的氮濃度， mg/L 。

試驗數據使用SPSS23.0.0進行單因素方差分析（ANOVA），再使用Duncan檢驗進行均值的多重比較，以 Plt;0.05 為差異顯著水平。試驗數據采用Origin9.1軟件進行繪圖。

2 結果與討論

2.1菌株CS-6的鑒定結果

篩選得到的菌株CS一6的菌落為乳白色，圓形，表面光滑凸起，邊緣整齊，易挑起。經16SrRNA序列比對后鑒定為芽孢桿菌（Bacillussp.），見圖1。

2.2菌株CS-6對不同形式氮的去除效果

將菌株 CS^-6 接種到基礎氮降解溶液后，在試驗期間，對氨氮和亞硝酸氮均有顯著去除效果，最高去除率分別為 100% 和 91.67% ，見圖2。在試驗的 ^48h ，氨氮的去除率達到 100% ，亞硝酸氮的去除率達到 91.67% ，并一直持續至試驗結束。菌株 CS^-6 對總無機氮的去除率在第 48～96h 達到最高，為 28.46% 。

注：不同字母表示不同時間差異顯著（ Plt;0.05） 。

異養硝化的途徑可分為兩種，一種是氨氮經氨單加氧酶（AMO）氧化為羥胺 ΔNH₂OH ，再經羥胺氧化酶（HAO）將羥胺氧化為亞硝酸氮、硝酸氮，這期間有亞硝酸氮或硝酸氮生成；另一種途徑是羥胺直接轉化為 N₂O，N₂^Λ，Γ9] ，這期間沒有亞硝酸氮和硝酸氮生成。本研究篩選獲得的異養硝化菌株 CS^-6 在 120h 的試驗中，對氨氮和亞硝酸氮有顯著的去除效果，最高去除率分別可達100% 和 91.67% 。但對硝酸氮去除不顯著，說明得到的異養硝化菌株 CS-6 的異養硝化途徑可能為第一種。

2.3溫度對菌株CS-6去除氨氮和亞硝酸氮能力及生長的影響

菌株 CS-6 對氨氮和亞硝酸氮的去除表現出較廣的溫度適應范圍，從 對氨氮或亞硝酸氮均有去除，并且對低溫有良好的耐受性，在15°C 條件下，氨氮和亞硝酸氮去除率分別為100% 和 91.91% ，見圖3。目前已報道的大多數關于水產養殖環境異養硝化細菌的研究，菌株硝化活性的最適溫度通常在 。菌株CS^-6 在 15°C 條件下仍具有較高硝化性能，表明該菌株具有良好的溫度生長耐受性。

圖3溫度對菌株CS-6氨氮和亞硝酸氮降解的影響2.4鹽度菌株CS-6去除氨氮和亞硝酸氮能力及生長的影響

在不同鹽度范圍內也都表現較好的耐受性。在鹽度 0‰ 的范圍內，對氨氮和亞硝酸氮的去除率均達到最高，去除率分別達到 100% 和93.15% 。在鹽度為 50‰ 時，菌株 CS-6 對氨氮和亞硝酸氮仍具有去除性能，見圖4。

鹽度過高時會造成細胞外部滲透壓過大，導致細胞失水，從而影響微生物的生長代謝甚至導致死亡[11]。菌株CS一6的硝化特性卻表現出較寬的鹽度適應范圍 （0%0～50%） ，說明菌體中與硝化作用相關的酶的對鹽度具有較好的適應性和耐受性。

圖4鹽度對菌株CS-6的氨氮和亞硝酸氮降解的影響2.5 pH值對菌株CS-6去除氨氮和亞硝酸氮能力及生長的影響

pH值是影響微生物生長和性能發揮的重要環境因素之一，可以引起微生物細胞膜電荷的變化，還會影響微生物的營養物質吸收及代謝過程酶的活性[12]。通常硝化細菌的生長條件偏堿性，酸性的環境會嚴重抑制反應的發生[11]。菌株CS^-6 則表現出良好的酸堿耐受性，在所有 ΔpH 值范圍內，對氨氮去除率均高于 96.33% ，對亞硝酸氮的去除率也都高于 92% ，見圖5。這說明菌株對酸性和堿性環境都具有良好的適應性。

3結論

菌株CS一6具有高效的氮去除特性，對氨氮和亞硝酸氮的去除率分別可達 100% 和91. 67% 。CS^-6 也具有良好的耐低溫特性，在 15^°C 條件下，對氨氮和亞硝酸氮的去除率分別可達 100% 和91.91% 。在鹽度 0%0～50%0.pH 值為 6～9 的范圍內，CS一6對氨氮和亞硝酸氮也具有較好去除能力，表現良好的鹽堿耐受性。綜上顯示， CS-6 對低溫和高鹽堿均具有良好的耐受性，在水產養殖環境調控過程中，具有良好的應用前景。

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（收稿日期：2025-04—25）