p53調控TGF-β1誘導的翼狀肉成纖維細胞增殖、轉分化的研究

中圖分類號：R772；R730 文獻標志碼：A DOI：10. 19907/j. 0490-6756.250041

HAN2，CHEN2，LIU Jia-Lin2，GUOSheng-Hong2 （1.The Afiliated Hospital ， 832OO3，China; 2. Medicine，832Oo3，China）

Abstract： This study aimed to investigate whether p53 mediates the role mammalian target rapamycin （mTOR） signaling in transforming growth factor beta 1（TGF-βl）-induced proliferation and transdiferentiation human pterygium fibroblasts （HPFs）. Primary HPFs were isolated and cultured from human pterygium tissues. Following pre-activation with 10ng/mL TGF- _?β1 for 48h ，p53was either silenced via lentiviral transduction or activated using 10μmol/L Nutlin-3. Cell viability was assessed by CCK-8 assay，migra tion capacity by wound-healing assay，and expression levels proliferation cell nuclear antigen（PCNA），α -smooth muscle actin （ α -SMA），p53，p-mTOR，and mTOR by quantitative polymerase chain reaction （qPCR） and Western blotting. TGF- _?β1 stimulation significantly enhanced HPFs viability and migration，and upregulated PCNA and α -SMA expression. Compared to TGF-βl treatment alone，p53 knockdown markedly further increased cell viability and migration，upregulated PCNA and p-mTOR/mTOR expression levels，but downregulated α -SMA expression. Conversely，Nutlin-3-mediated p53 activation significantly reduced cell viability and migration，downregulated PCNA and p-mTOR/mTOR expression levels，yet upregulated α -SMA expression levels relative to the TGF-βl group. These results indicate that p53 critically regulates TGF-β1-driven proliferation and transdiffrentiation in HPFs through mTOR signaling.Notably， p53 exerts diferential regulatory effects onproliferation and transdiferentiation，highlighting its functional plasticity within the fibrotic microenvironments.

Keywords：Pterygium fibroblast；p53；mTOR；Proliferation；Transdifferentiation

1引言

翼狀裔肉是一種常見的慢性增殖性疾病，它是以局部球結膜纖維血管組織增生并侵犯到角膜為特點的慢性炎癥性疾病.臨床上，翼狀裔肉表現(xiàn)為翼狀結膜增厚，遷移到角膜邊緣，通常從鼻側開始，可侵犯并覆蓋角膜中央和視軸.隨著病情的發(fā)展可以導致眼部異物感、眼紅、刺痛、干燥、角膜散光、視力下降12.目前關于翼狀努肉的手術方式有很多種，其中有部分手術方法，如翼狀裔肉單純切除，翼狀裔肉切除 + 羊膜移植等，由于纖維血管增生3，常存在術后復發(fā)率高與修復困難等缺點4，目前主流的手術方式為翼狀肉切除十帶角膜緣干細胞的結膜瓣移植術4.各種外部刺激可激活人翼狀肉成纖維細胞（human pterygium fibroblasts，HPFs），被激活的成纖維細胞進而發(fā)生增殖，轉分化為肌成纖維細胞.肌成纖維細胞能表達a -平滑肌肌動蛋白（alpha smoothmuscleactin，α-SMA），沉積病理性細胞外基質（extracellularmatrix，ECM），是導致纖維化的主要因素[5.以上病理改變過程涉及到p53、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetrapamycin，mTOR）及轉化生長因子 βl（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）等多種因子和信號通道[6.7]．因此，對HPFs的發(fā)病機制展開深入研究是十分必要的.

TGF-β1作為纖維化的主要誘導因子，在HPFs的形成中起關鍵作用[8.9].TGF-β1激活肌成纖維細胞，上調眼內ECM的合成[9.10].有報道稱，TGF-β1在翼狀裔肉組織中的表達水平高于正常結膜組[11].且與原發(fā)翼狀裔肉相比，復發(fā)性HPFs培養(yǎng)中TGF-β1表達更高12.翼狀肉中肌成纖維細胞的存在和TGF-β1的過表達提示TGF-β1參與了翼狀裔肉的發(fā)病和進展．本研究中，TGF-β1用于誘導HPFs的纖維化活化.

p53/mTOR信號參與了多種纖維化與炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展[13.14].p53的功能障礙與mTOR的過度激活通常是一些增殖性疾病的特征.調節(jié)p53和mTOR之間的平衡是細胞增殖和存活的保證.有研究表明，p53能在多個水平上參與對mTOR信號的調控：（1）p53直接調控mTOR.已知的mTOR復合體1（mechanistictarget rapamycincomplex1，mTORC1）的多個負性調節(jié)分子均為p53的下游靶基因，如DNA損傷反應調節(jié)基因1（regulated in development and DNA damage re-sponsesl，Redd1）[15]，肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）[16.17]，AMPKβ[18]，結節(jié)性硬化癥蛋白復合體 2（tuberous sclerosis complex 2，TSC2）[18].磷酸酶PTEN，能將PIP3去磷酸化為PIP2，從而抑制PI3K/AKT信號通路，它包含p53結合位點，并能夠被p53反式激活[19]，在基因毒性應激下，p53還可通過AMPK、TSC2上調Sestrinl、Sestrin2表達，進而抑制mTORC1活性[16]；（2）p53下游的微小RNAs（microRNAs，miRNAs）可通過轉錄后調控mTOR信號通路，其中 miR-34a/b/c 是p53最主要的靶基因[20]；（3）胞質中的p53可能通過蛋白之間的相互作用來調控AMPK-mTOR軸抑制自噬[21].但是p53調控mTOR信號在TGF-β1誘導的HPFs增殖、轉分化中的作用目前尚不清楚.

前期試驗工作已發(fā)現(xiàn)mTOR在翼狀努肉中高表達，且mTOR信號通路在HPFs的增殖、轉分化中發(fā)揮了重要作用[22.23].本研究旨在闡明p53介導mTOR在TGF-β1誘導的HPFs增殖、轉分化中的作用，為翼狀裔肉的靶向治療提供一種有前途的治療策略.

2 材料與方法

2.1材料

2.1.1翼狀肉樣本來源翼狀肉選自2023/5-2023/12在診斷為原發(fā)性翼狀裔肉，且接受翼狀裔肉切除術 + 自體角膜緣干細胞移植術的患者21例，年齡 49～76 歲，男性8例，女性13例.本研究嚴格按照《赫爾辛基宣言》執(zhí)行，通過倫理委員會審批（No：KJ2023-354-01）.所有患者均知情并簽署知情同意書.

2.1.2主要儀器和試劑全自動酶標儀（AmericanThermoScientific公司），離心機/超凈臺（美國Thermo ElectronCorporation），高速低溫離心機（AmericanThermoScientific公司），移液器（美國Eppendorg公司），水浴鍋（北京光明醫(yī)療儀器廠），GEL-DOC2000凝膠成像儀（美國BioRad公司），電轉儀（美國BioRad公司），電泳儀（美國BioRad公司），實時熒光定量PCR儀（美國BioRad公司），逆轉錄儀（中國TaKaRa公司），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS），DMEM/F12培養(yǎng)基（美國GIBCO公司）， （1× PBSSolution（美國GIBCO公司），胎牛血清（美國GIBCO公司），慢病毒載體（shRNA/shNC）（蘇州吉瑪基因股份有限公司），CCK-8液（日本同仁技術有限公司），TGF-β1（美國MedChemexpress生物科技公司），Nutlin-3（美國MedChe-mexpress生物科技公司），Trizol（美國Thermo公司），氯仿替代物（武漢賽維爾生物科技有限公司），RNA逆轉錄試劑盒（美國Thermo公司），實時熒光定量PCR試劑盒FastSYBRMixture（北京康為生物科技有限公司），Vimentin抗體（ThermoFisher Scientific，1： 250，MA5-11883），Cytokeratin抗體（Thermo Fisher Scientific；1：25O，MA5-32118），IgG（Abcam，1：200，ab150077），DAPI（Abcam;1：5000，ab104139），TGF-β1抗體（SantaCruzBiotechnology，1：1000，sc-52893），p53抗體（Bioswamp，1：1000，PAB30082），mTOR抗體（Bioswamp，1： 1000，PAB30674），p-mTOR 抗體（Boster，1：1000，BM4840），PCNA 抗體（Bio-swamp，1：1000，PAB37099）， a -SMA抗體（Ab-cam，1：1000，ab240678），GAPDH抗體（Proteintech，1： 1000，60004-1-Ig）.

2.2方法

2.2.1HPFs的分離與培養(yǎng)將手術切除的翼狀肉組織保存于含有 100U/mL 青霉素 .100mg/L 鏈霉素的磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered solution，PBS）中， 2h 內運輸?shù)綗o菌超凈臺上，在超凈臺上用PBS沖洗翼狀肉組織3遍，并將其剪成約 1mm×1mm×1mm 大小的組織塊，平鋪于細胞培養(yǎng)皿底部.待 30min 組織塊貼壁后向培養(yǎng)皿中加入含有 100U/mL 青霉素、 100mg/L 鏈霉素及 10% FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，將培養(yǎng)Ⅲ放置于 37^°C，5%CO₂ 細胞培養(yǎng)箱中，每 2～3d 換液一次，待細胞密度生長到 80%～90% 時采用胰蛋白酶消化傳代，取 3～6 代細胞用于后續(xù)實驗.

2.2.2細胞鑒定將HPFs細胞接種于培養(yǎng)Ⅲ中，待細胞密度達到 80% 后吸除培養(yǎng)基，PBS洗滌，使用 4% 多聚甲醛在室溫環(huán)境下固定細胞15min.PBS洗滌， 0.5% 曲拉通X-100室溫通透細胞30min .PBS洗滌， 5% 牛血清白蛋白（bovinese-rumalbumin，BSA）在室溫下封閉1h.棄去封閉液，分別加入 5%BSA 用 5% BSA稀釋的vimentin抗體（1：250）、用 5%BSA 稀釋的pancytokeratin抗體（1：250），在 4^°C 孵育過夜.PBS洗滌，添加A1-exaFluor488（用 5%BSA 稀釋）標記IgG二抗（1：200），并在室溫避光下培養(yǎng)1h.PBS洗滌，加入DAPI避光孵育 10min .PBS洗滌，使用熒光顯微鏡觀察并獲得圖片．

2.2.3 CCK-8法檢測HPFs的細胞活力于96孔板中接種HPFs，每孔 5×10³ 個的細胞密度來設置，每組設置3個復孔.待HPFs貼壁后吸除孔內培養(yǎng)基，先將HPFs使用 10ng/mL TGF-β1預處理^48h 后，再分別使用慢病毒轉染敲低p53，以及使用 10μmol/L Nutlin-3處理TGF-β1誘導的HPFs^48h ，然后吸除培養(yǎng)基，并用PBS沖洗一遍后，將CCK8試劑 10μL 與DMEM/F12培養(yǎng)基 90μL 混勻后加入各個干預孔.最后，利用酶標儀測定每孔在 450nm 波長處的吸光度值.

2.2.4劃痕實驗將HPFs接種于6孔板中.培養(yǎng) 24h 后，每個孔的細胞個數(shù)達到 10⁵ 個/孔，細胞密度達到 90% 的融合度，用 100μL 無菌移液管在預先準備的標記處垂直于培養(yǎng)皿底部刮拭.隨后，用PBS洗滌劃痕孔3次，并按照第2.2.3節(jié)中所述方法干預細胞，選擇一個固定點，在添加選定濃度的藥物處理后選定分別于 ^0h 和后續(xù)合適的時間拍攝劃痕照片.使用ImageJ軟件測量每張圖像中的細胞遷移面積.數(shù)據(jù)以 ^0h 劃痕面積量化，以100% 為標準．

2.2.5shRNA重組表達載體的構建將設計好的序列導入慢病毒載體，經過克隆及工具細胞轉染等，收獲病毒顆粒后經純化、濃縮及滴度檢測后保存?zhèn)溆?（慢病毒載體包裝過程由蘇州吉瑪基因股份有限公司完成）

shRNA基因序列對照 ）：

sh-NC：TTCTCCGAACGTGTCACGT（Re

portnumber：R2023-SH5010） sh-p53-Homo-738： GAAATTTGCGTGTG

GAGTATT（Reportnumber：R2023-SH5009） sh-p53-Homo-1105： ACCACTGGATGGAG

AATATTT（Reportnumber：R2023-SH5008） sh-p53-Homo-1265： CAGTCTACCTCCCG

CCATAAA（Report number：R2023-SH5007）

2.2.6細胞慢病毒轉染細胞鋪板：將貼壁細胞以 10×10⁴， /孔鋪到六孔板中.搖勻六孔板， 37^°C ，5%CO₂ 過夜，以備次日轉染.病毒的稀釋： 2mL 稀釋液，以 5μg/mL Polybrene的濃度，向稀釋液中添加 40μL 的慢病毒原液.吸走細胞培養(yǎng)液，將稀釋后的病毒液加入其中，并設立對照（blank，negative），在 37^°C，5%CO₂ 條件下培養(yǎng)過夜.24h后將轉染細胞的病毒液移走，使用 2mL 新鮮常規(guī)完全培養(yǎng)液代替，在 37% （20 CO₂ 條件下培養(yǎng)過夜.再繼續(xù)培養(yǎng) 2～3d ，用熒光顯微鏡檢測GFP陽性率，以此來判定細胞轉染效率．

2.2.7實時熒光定量PCR（quantitativePCR）各組HPFs經第2.2.3節(jié)中所述方法干預后使用Trizol提取總RNA.使用NanoDrop1OO0UV分光光度計測定RNA濃度和OD260/OD280比率；每個逆轉錄反應約使用 1μg RNA（thermo反轉錄試劑盒）.根據(jù)thermo反轉錄試劑盒的說明，將RNA逆轉錄為cDNA，根據(jù)SYBRGREENPCRmastermix試劑盒的說明進行后續(xù)實時熒光定量PCR反應.使用 2^-ΔΔCT 法計算目標基因的相對表達量．引物序列見表1.

2.2.8WesternBlotting各組HPFs經第2.2.3節(jié)中所述方法干預后用PBS浸洗3次.棄PBS后用RIPA裂解液冰上裂解細胞 30min，4^°C12000r/ min 離心 15min 后收集上清液.以BCA（ThermoFisherScientific）法對蛋白定量，向上清液中添加適量體積的PBS及蛋白上樣緩沖液，以達到 2{μg/ μL 的最終蛋白質濃度，蛋白質在 100^°C 條件下變性 10min ，然后于 -80^°C 保存.行 12% SDS-PAGE電泳，上樣量為 20μL，80V 電泳 30min 后改為100V繼續(xù)電泳"^1h"采用濕轉的方式 （100mA，1h） 將蛋白電轉到PVDF膜上（MerckMillipore，Bilerica，MA，USA）.TBST洗膜3次， 5% 脫脂牛奶封閉 2h TBST洗膜3次，分別加入用抗體稀釋液稀釋的 a -SMA抗體（1：100O），PCNA抗體（1：1000），mTOR抗體（1：1000）， Δp -mTOR抗體（1：1000），p53抗體（1：1000），GAPDH抗體（1：1000）， 4^°C 孵育過夜.TBST洗膜3次，將IgG二抗（1：5000）使用抗體稀釋液稀釋后，在室溫條件下孵育"^2h".TBST洗膜3次，滴加ECL后進行顯色.使用ImageJ計算各個條帶的灰度值.

2.2.9統(tǒng)計分析每一次實驗至少進行3次獨立重復實驗．一項獨立實驗的細胞來自同一批同一人.使用GraphPadPrism1O軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和作圖.數(shù)據(jù)以均值士標準偏差（SD）表示．運用獨立樣本t檢驗來進行兩組間數(shù)據(jù)的比較，運用單因素方差分析進行多組間的比較，以Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計學意義.

3結果

3.1HPFs的細胞培養(yǎng)與鑒定

組織塊培養(yǎng)第3～5d開始出現(xiàn)少量長梭形細胞從組織塊邊緣長出.傳代至第3代后，細胞為形態(tài)均一的長梭形（圖1a）.細胞免疫熒光染色（圖1b）：在HPFs內，Vimentin蛋白主要分布于胞漿，呈綠色熒光，呈束狀或纖維狀排列，而cytokeratin蛋白呈陰性.結合細胞形態(tài)、vimentin蛋白和cytokeratin蛋白染色結果，初步判定原代細胞是HPFs.

（a）翼狀肉成纖維細胞（HPFs）；（b）免疫熒光檢測角蛋白、波形蛋白的表達情況.

3.2調控p53影響TGF-β1誘導的HPFs增殖、遷移

CCK-8測定結果顯示：在加入不同濃度的TGF-β1誘導 12h，24h，48h 后，各組細胞活力隨著TGF-β1誘導時間的延長而增強，呈時間依賴性.在 10ng/mL TGF-β1處理 48h 后，HPFs的細胞活力顯著增強（ Plt;0.0001 （圖2a），表明TGF-βl處理可以促進HPFs增殖.

通過qPCR結果顯示，在3組不同位點敲低組中，sh-p53-Homo-738的敲低效果最好，故選用該敲低位點進行后續(xù)實驗（ Plt;0.0001） （圖2b）.我們通過CCK-8實驗先檢測了在TGF-β1誘導的HPFs中敲低p53后的細胞活力改變，CCK-8實驗結果顯示：與單純TGF- _β1 處理組比較，敲低p53后，細胞活力顯著增強 （Plt;0.0001） （圖2c）.而通過Nutlin-3來解除MDM2-p53軸對于p53的活性抑制，重新激活p53的生長抑制和促凋亡活性后，與單獨TGF-β1處理組相比，細胞活力明顯降低 Plt; 0.0001）（圖2d），且結合文獻報道[24.25]，故選用10μmol/L 濃度的Nutlin-3進行后續(xù)信號分子的檢測.

劃痕結果顯示，與對照組相比， 10ng/mL TGF-β1作用 48h 后，HPFs的遷移能力明顯增強，表現(xiàn)為細胞前沿遷移面積明顯擴大（ ?Plt;0.05） ；與單純TGF-β1處理組比較，敲低p53后，細胞的遷移能力顯著增強 （Plt;0.05） ；與單獨TGF-β1處理組相比，再使用Nutlin-3處理后，細胞的遷移能力也顯著減弱 （Plt;0.05） （圖2e）.

3.3p53介導mTOR參與了TGF-β1誘導的HPFs的增殖與轉分化過程

為了探討p53是否通過調控mTOR在TGF-βl誘導的HPFs增殖、轉分化的潛在功能，接下來我們通過qPCR和Westernblotting分析了調控p53后，相應分子的mRNA以及蛋白的改變. qPCR 結果顯示：與對照組相比， 10ng/mL TGF-β1處理 48h 后，PCNA（ ?Plt;0.05） 、 a -SMA （ Plt;0.0001 ）的mRNA表達量明顯上調；與單純TGF-β1處理組比較，敲低 p53 后，PCNA的mRNA表達量顯著上調?Plt;0.0001） ，而 α -SMA的mRNA表達量顯著下調 （Plt;0.0001） ; 10μmol/L Nutlin-3處理TGF- _β1 誘導后的HPFs，與單獨TGF-β1處理組比較，PCNA的mRNA表達明顯下調 ?Plt;0.05） 1，a -SMA的mRNA表達顯著上調 ?Plt;0.0001） （圖3a，3b）.Westernblotting結果進一步表明，與對照組相比， 10ng/mL TGF-β1作用 ^48h 后，PCNA（Plt;0.0001 ） Ω_?α -SMA（ Plt;0.001） 的表達顯著上調（圖3d）;與單純TGF-β1處理組比較，敲低p53后，PCNA （Plt;0.0001）.p.mTOR/mTOR（Plt;0.0001） 的蛋白表達顯著上調， p53（Plt;0.0001） ） α -SMA P lt;0.001? 的蛋白表達量呈顯著下調（圖3c，3d）.10μmol/L Nutlin-3處理TGF-β1誘導后的HPFs，與單獨TGF- ^?β1 處理組比較，PCNA（ Plt;0.0001）._F ！mTOR/mTOR（ Plt;0.001） 蛋白表達明顯下調，p53（Plt;0.0001 ） α -SMA（ Plt;0.0001? 的蛋白表達顯著上調（圖3c，3d）.

4討論

多種細胞因子有助于HPFs的纖維化進展．目前證據(jù)表明，翼狀裔肉中的上皮細胞在增殖和凋亡之間的平衡發(fā)生了改變，導致間質活化成纖維細胞過度生長、新生血管形成、炎癥細胞浸潤以及彈性蛋白和膠原蛋白的異常ECM積累9，故HPFs是翼狀努肉產生纖維化和ECM成分的主要細胞類型.然而，翼狀努肉纖維化的機制在很大程度上仍未被探索，并且缺乏有效的治療方法.根據(jù)既往研究，我們發(fā)現(xiàn)HPFs在受到TGF-β1刺激后，能促進其增殖、遷移并向肌成纖維細胞轉化[26]，這依賴于mTOR等多種信號分子的激活[6.23.27，28].在本研究中，從翼狀裔肉組織中分離出原代成纖維細胞，并基于前期 mTOR 在翼狀裔肉中的研究基礎，首次評估了p53介導mTOR在TGF-β1誘導的HPFs增殖、轉分化中的作用，這為抑制翼狀裔肉的纖維化提供了潛在的治療靶點.

（a）CCK-8檢測不同濃度TGF 作用不同時間（12h、24h、48h）后HPFs的細胞活力的變化；（b）慢病毒轉染敲低p53后，qPCR檢測不同敲低位點的敲低效率；（c）在TGF-β1誘導的HPFs中敲低p53后，CCK-8檢測細胞活力的改變；（d）CCK-8檢測不同濃度Nutlin -3（0μmol/L，2.5μmol/L.5μmol/L，10μmol/L，20μmol/L）/ 處理TGF-β1誘導的HPFs48h后細胞活力的改變；（e）劃痕實驗檢測各組中細胞遷移能力的改變. n=3，ns ：無統(tǒng)計學差異； ^*Plt;0.05 ^**Plt;0.01 ^***Plt;0.001 ****Plt;0.0001 業(yè)

（a）CCK-8 detected changes inviabilityHPFsafter treatment with TGF-β1 （5ng/mL ， 10ng/mL ， 15ng/mL ，and 20ng/mL） for12， 24and4speiel；）fctifreoclts；）-8eedgilli fterp53kckoinGF-βdedHs;d）CCK-8eteedteagscellitiF-dudHtreatediln3 at different concentrations 0μmol/L_?2.5μmol/L_?5μmol/L_?10μmol/L_?20μmol/L_?）for 4μL_? 48h ；（e）Thecell migrationability different treatment groups was detected by wound healing assay. n=3 ， ns ：not significant; ^*Plt;0.05 ^**Plt;0.01 . ^***Plt;0.001 ·****Plt;0.0001

紫外線（ultraviolet，UV照射被認為是冀狀肉的主要原因.紫外線可以通過對細胞的直接光毒性作用、產生活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）來破壞、改變細胞的DNA、產生炎癥因子來誘導翼狀憫肉的發(fā)病過程[29.30].近年來，慢性紫外線暴露誘導的皮膚纖維化機制研究呈現(xiàn)快速增長趨勢，其中p53/mTOR信號軸因在細胞自噬與纖維化調控網絡中的樞紐作用，已成為該領域分子機制探索的核心靶.Strozyk等研究發(fā)現(xiàn)，p53與AKT/mTOR通過動態(tài)拮抗調控UV應激下的細胞凋亡、自噬、衰老等，兩者的動態(tài)拮抗失衡是皮膚癌發(fā)生的關鍵分子開關[31].p53/mTOR信號通路在許多纖維化疾病中的作用已被報道.蒼術多糖通過抑制 p53/mTOR 通路以減輕自噬的過度激活，進而減少非酒精性脂肪性肝炎的細胞損傷和纖維化的發(fā)生[32].在Gata1低表達小鼠模型中，TGF-β1信號異常通過激活 p53/mTOR 通路加劇骨髓纖維化，表現(xiàn)為成纖維細胞活化增強、骨硬化及血管增生；抑制TGF-β1可下調p53/mTOR信號活性，減少膠原沉積、恢復正常造血功能及降低脾髓外造血負荷，從而逆轉纖維化進程[14].值得一提的是，文獻報道稱p53/mTOR通路也參與了干細胞的調節(jié).例如，p53-mTOR調控網絡通過細胞凋亡、自噬等過程確保干細胞的穩(wěn)態(tài)與生長調控[33].在前期研究中，Zhao等報道翼狀裔肉中mTOR表達較正常結膜增高，且p70S6K表達與臨床嚴重程度呈正相關，雷帕霉素可降低HPFs中α-SMA的表達[28].而本研究基于前期研究的基礎上，我們發(fā)現(xiàn)，p53通過mTOR參與介導了TGF- ?β 1誘導的HPFs增殖、轉分化過程，且在此過程中，敲低p53誘導的HPFs增殖或轉分化能被雷帕霉素抑制.這證實了mTOR在翼狀肉增殖、轉分化中的重要作用．同時，也提示我們，靶向p53mTOR軸來調控HPFs的增殖和轉分化似乎是一種很有前景的治療策略，這值得進一步探究.

（a）qPCR檢測不同處理組中PCNA的mRNA表達情況;（b）qPCR檢測不同處理組 α -SMA的mRNA表達情況;（c）Westernbloting檢測不同處理組p53蛋白的表達情況；（d）Westernblotting檢測不同處理組PCNA、 α -SMA、p-mTOR/mTOR蛋白的表達情況. n=3，ns ：無統(tǒng)計學差異； ^*Plt;0.05 ^**Plt;0.01 ^***Plt;0.001 ****Plt;0.0001

Fig.3p53-mediated mTOR is involved in the proliferation and transdiffrentiation TGF-β1-induced HPFs

（a）qPCRdetects the mRNA expressionPCNA indiferenttreatment groups；（b）qPCRdetects the mRNA expression α -SMAindifferentreatmntgros;Westelotietectsteproteepresas5iinttreamntosd）Westoigde tects the protein expression changes PCNA，α-SMA，and p-mTOR/mTOR in diffrent treatment groups. n=3 ， ns ：not significant; ^*Plt; 0.05; **Plt;0.01 ***Plt;0.001 ****Plt;0.0001

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)調控p53后，p53的表達與PCNA呈負相關，與 a -SMA呈正相關，這似乎是有爭議的.p53作為一種常見的腫瘤抑制因子，可誘導衰老和細胞凋亡，這似乎與翼狀裔肉不受抑制的生長相矛盾.有學者推測，這可能與p53受到某些結合蛋白的調控，如MDM2，從而抑制了其表達活性有關[34].也有學者認為，氧化應激和炎癥是與翼狀努肉密切相關的病理生理過程.ROS積累可引發(fā)氧化應激，涉及凋亡、壞死和自噬等多種生物過程[35].長期紫外線照射會造成大量ROS累積，引起p53基因的突變，導致細胞凋亡失控[35.36].研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物細胞中，p53是抑制TGF- ?β 誘導的細胞增殖的重要因子，缺乏p53時，會導致這種抑制作用出現(xiàn)障礙，以及在某些細胞類型中無法有效啟動CDK抑制劑 p21^waF1 的表達[37].此外，也有研究表明， p53 通過與受體激活的smad絡合而成為TGF- β 信號通路中的一個輔助調節(jié)因子，與TGF- β 協(xié)同調節(jié)腎臟纖維化過程[38].故TGF- ?β 與p53在機體生理和病理活動中可能存在一定的聯(lián)系．

越來越多的證據(jù)證實，p53參與EMT和纖維化[39，40].進一步研究表明，TGF-β驅動的纖維化通過smad依賴或非smad途徑介導，并由輔助受體和相互作用網絡調節(jié).TGF-β1/Smad信號通路是調節(jié)纖維化的重要途徑，TGF-β1是最有效的促纖維化細胞因子.TGF-β1主要受Smads超家族調控.Smad2/3的磷酸化是通過激活膜特異性絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，然后與常見型Smad4結合形成寡聚物，并將其轉運到細胞核內啟動TGF-β1的表達，導致 α -SMA、Collagenl、FN等纖維化相關基因水平升高[41，42].值得注意的是，TGF-β1/Smad通路介導了細胞表型轉換，而 α -SMA的表達則受到Smad2和Smad3的協(xié)同調控，而Smad3在這一過程中發(fā)揮了關鍵作用.對Smad3基因敲除小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)中，Smad3缺失導致成纖維細胞無法被TGF-β1趨化，不能自分泌TGF-β1[43]，同時被TGF-β1刺激后 α -SMA的表達也不增加[44].TGF-β還可激活不依賴Smads的其他信號級聯(lián)反應，如MAPK通路等[45].由此，我們推斷Nutlin-3處理后，胞核中p53的激活不能抑制TGF-β1/Smad級聯(lián)反應導致的 α -SMA的上調，或是Nutlin-3處理后p53的激活可能不依賴于Smads.既往研究報道，MMC和Nutlin均能顯著抑制翼狀肉細胞的增殖.與MMC相比，Nutlin能特異性抑制翼狀肉細胞的增殖和遷移.這種行為可能歸因于Nutlin對MDM2-p53相互作用.Nutlin對細胞增殖的抑制作用依賴于野生型p53的激活，通過激活p21等下游靶基因.另外，細胞中MDM2被抑制后需要一段時間來積累足夠的p53分子來觸發(fā)細胞凋亡[25].故我們推測，Nutlin-3特異性抑制增殖但可能不干擾TGF-β誘導的促纖維化信號，且p53激活途徑可能獨立于Smad通路.以上內容提示，p53的生物學效應高度依賴微環(huán)境及相互作用網絡調控.

無論是敲低p53還是Nulin-3處理，其本質都是對野生型p53調控，然而，關于p53調控的復雜性不僅限于野生型.翼狀裔肉中本身存在著大量突變p53基因[46]，在成纖維細胞中，突變的p53可以改變腫瘤細胞分泌組并導致CAF亞群的變化，從而調節(jié)免疫細胞的招募和組織．一項研究表明，結直腸腫瘤細胞中的p53R273H會誘導外泌體miR-21-3p和miR-769-3p增加，這些外泌體被成纖維細胞攝取并激活TGF- ?β -Smad信號通路，從而有助于免疫抑制性TME和EMT，表明p53突變可以重新編程成纖維細胞以改變腫瘤免疫微環(huán)境47.故可能在TGF-β1誘導HPFs中，突變型p53（而非野生型p53）通過TGF- ?β -Smad軸直接驅動成纖維細胞活化，并可能通過免疫微環(huán)境調控間接增強纖維化表型，導致 a -SMA表達與p53水平呈正相關．這一現(xiàn)象反映了突變型p53的獨特功能對纖維化過程的特異性調控.

本研究雖取得具有說服力的實驗結果，但仍存在若干局限性需予闡明.需指出的是，本論文尚未探究TGF-β1處理后，p53在轉錄、活性等方面的變化；且慢病毒敲低p53或Nutlin-3激活p53后，尚缺乏回補實驗來驗證p53下游效應的特異性．未來需完善p53轉錄、活性的檢測，補充Nutlin- 3+ p53敲低的回補實驗，并結合多組學分析排除脫靶效應.總的來說，本研究證實了HPFs響應TGF-βl的刺激，通過p53來介導mTOR信號參與了TGF-β1誘導的HPFs增殖、轉分化過程，并揭示p53可能通過非Smad依賴的分支信號途徑促進HPFs轉分化現(xiàn)象.上述發(fā)現(xiàn)不僅深化了對翼狀肉發(fā)病機制中關鍵分子的認知，更為開發(fā)靶向p53-mTOR信號軸的精準治療策略提供了潛在干預靶標.

參考文獻：

[1] ChuWK，ChoiHL，BhatAK，etal.Pterygium： New insights[J].Eye（Lond），2020，34（6）：1047.

[2] Zavala J，Hernandez-Camarena J C，SalvadorG?lvezB，etal.Extracellularmatrix and fibroblast injection produces pterygium-like lesion in rabbits[J]. BiolRes，2018，51（1）：15.

[3] Sun N， Zhang H. Pyroptosis in pterygium pathogenesis[J].BiosciRep，2018，38（3）：BSR20180282.

[4] Van Acker SI，Van denBogerd B，Haagdorens M， et al.Pterygium-the good，the bad，and theugly[J]. Cells，2021，10（7）：1567.

[5] HinzB.Formation and function the myibroblast during tissue repair[J].J Invest Dermatol，2OO7，127 （3）：526.

[6] KimKW，ParkSH，KimJC.Fibroblastbiologyin pterygia[J].ExpEyeRes，2016，142：32.

[7] LiuW，Lin T，GongL.ZD6474attenuatesfibrosis and inhibits neovascularization in human pterygium by suppressing AKT-mTOR signaling pathway[J].J OculPharmacol Ther，2023，39（2）：128.

[8] FanJ，Wei S，ZhangX，etal.Resveratrol inhibits TGF-βl-induced fibrotic efects in human pterygium fibroblasts[J].Environ Health Prev Med，2023， 28：59.

[9] ShuDY，Lovicu FJ.Myibroblast transdifferentiation：The dark force in ocular wound healing and fibrosis[J].ProgRetinEyeRes，2017，60：44.

[10]Rokohl A C，HeindlLM，Cursiefen C.Pterygium： pathogenesis，diagnosis and treatment[J].Ophthalmologe，2021，118（7）：749.

[11]BianchiE，ScarinciF，Grande C，et al.Immunohistochemical prile VEGF，TGF- ?{ and PGE₂ in human pterygium and normal conjunctiva：experimental study and review the literature[J]. Int J Immuno pathol Pharmacol，2012，25（3）：607.

[12]KriaL，Ohira A，Amemiya T.Growth factors in cultured pterygium fibroblasts： Immunohistochemical and ELISA analysis[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol，1998，236（9）：702.

[13]Ma Z，Tang X，Gao Y，et al. Combined extracts epimedii folium and ligustri lucidi fructuswith budesonide attenuate airway remodeling in the asth matic rats by regulating apoptosis and autophagy[J]. Evid Based Complementary Altern Med，2020，2020 （1）：2319409.

[14]ZingarielloM，MartelliF，CiaffoniF，etal.Characterization the TGF-βl signaling abnormalities in the Gatallow mouse model myelibrosis[J]. Blood，2013，121（17）：3345.

[15]Elisen L W，Ramsayer KD，Johannessen C M，et al.REDD1，a developmentally regulated transcriptional target p63 and p53，links p63 to regulation reactive oxygen species[J]. Mol Cell，2002，10 （5）：995.

[16]Co N N，IglesiasD，Celestino J，et al.Loss LKB1 in high-grade endometrial carcinoma：LKBl is a novel transcriptional target p53[J].Cancer， 2014，120（22）：3457.

[17]Xie B，Nagalingam A，Kuppusamy P，et al.Benzyl Isothiocyanate potentiates p53 signaling and antitumor effects against breast cancer through activation p53-LKB1 and p73-LKB1 axes[J]. Sci Rep，2017， 7： 40070.

[18]Feng Z，Hu W，de Stanchina E，et al.The regulation AMPK betal，TSC2，and PTEN expression by p53：stress，cell and tissue specificity，and the role these gene products in modulating the IGF-1- AKT-mTOR pathways[J].Cancer Res，2O07，67 （7）： 3043.

[19]Stambolic V，MacPherson D，Sas D，et al.Regulation PTEN transcription by p53[J].Mol Cell， 2001，8（2）： 317.

[20]HermekingH. p53 enters the microRNA world[J]. Cancer Cell，2007，12（5）：414.

[21]Cui D，QuR，Liu D，et al.The cross talk between p53 and mTOR pathways in response to physiological and genotoxic stresses[J]. Front Cell Dev Biol， 20219.775507

[22] Liu Y，Xu H，An M. mTORC1 regulates apoptosis and cell proliferation in pterygium via targeting au tophagy and FGFR3[J].Sci Rep，2017，7（1）： 7339.

[23]Zhao XR，ZhangMC，XieHT，etal.Expression mTOR in primary pterygium and its correlation with α-smooth muscle actin[J]. Eur J Ophthalmol， 2017，27（6）： 664.

[24]Hashimoto T，Ichiki T，Ikeda J，etal.Inhibition MDM2 attenuates neointimal hyperplasia via suppression vascular proliferation and inflammation[J]. Cardiovasc Res，2011，91（4）： 711.

[25]Cao D，Chu WK，Ng TK，et al.Cellular proliferation and migration human pterygium cells： mitomycinversus small-molecule inhibitors[J].Cornea， 2018，37（6）：760.

[26]Chen K，Lai K， Zhang X，et al. Bromfenac inhibits TGF-βl-induced fibrotic effects in human pterygium and conjunctival fibroblasts［J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2019，60（4）：1156.

[27] Hou A，Law K P，Tin M Q，et al. In vitro secretomics study pterygium-derived fibroblastsby iTRAQ-based quantitative proteomics strategy [J]. Exp Eye Res，2016，153：14.

[28]Zhao XR，ZhangMC，XieH T，et al.p7OS6K activation promotes the transdifferentiation fibroblasts to myibroblasts in pterygium tissue growth on the cornea[J].BiotechnolLett，2018，40（2）：437.

[29]Cimpean A M， Sava M P，Raica M. DNA damage in human pterygium：One-shot multiple targets[J]. Mol Vis，2013，19：348.

[30]Zhou WP，Zhu YF，ZhangB，et al.The role ultraviolet radiation in the pathogenesis pterygia（Review）[J].Mol Med Rep，2016，14（1）：3.

[31]Strozyk E，Kulms D. The role AKT/mTOR pathway in stress response to UV-irradiation：Implication in skin carcinogenesis by regulation apoptosis，au tophagy and senescence[J]. Int JMol Sci，2013，14 （8）：15260.

[32]PiD，Liang Z，Pan M，et al.Atractylodes lancea rhizome polysaccharide alleviates MCD diet-induced NASH by inhibiting the p53/mTOR pathway [J]. IntJMol Sci，2024，25（20）：11112.

[33]Yilmaz A，Peretz M，Aharony A，et al.Defining essential genes for human pluripotent stem cells by CRISPR-Cas9 screening in haploid cells [J].Nat Cell Biol，2018，20（5）：610.

[34]Cao D，Ng T K，Yip YWY，et al.p53 inhibition byMDM2 in human pterygium[J].Exp Eye Res， 2018，175：142.

[35]Ahmad A，Ahsan H.Biomarkers inflammation and oxidative stress in ophthalmic disorders[J].J Immunoassay Immunochem，2020，41（3）：257.

[36]TanDT，TangWY，LiuYP，et al.Apoptosis and apoptosis related gene expression in normal conjunctiva and pterygium[J].BrJOphthalmol，2O00，84 （2）：212.

[37]Dupont S，Zacchigna L，Adorno M，et al. Convergence p53 and TGF-beta signaling networks[J]. CancerLett，2004，213（2）：129.

[38]HigginsCE，Tang J，Mian BM，et al.TGF-β1 - p53cooperativity regulates a pribrotic genomic programin the kidney：Molecular mechanisms and clinical implications［J].FASEBJ，2O19，33（10）： 10596.

[39]Chen Y，He Z，Zhao B，et al.Downregulation a potential therapeutic target NPAS2，regulated by p53，alleviatespulmonaryfibrosisbyinhibiting epithelial-mesenchymal transition via suppressing HES1[J].Cell Signal，2023，109：110795.

[40]Kim S，You D，Jeong Y，et al. TP53 upregulates α -smooth muscle actin expression intamoxifenresistant breast cancer cells[J].Oncol Rep，2019， 41（2）：1075.

[41]Frangogiannis N. Transforming growth factor- β in tissuefibrosis[J].JExp Med，2O2O，217（3）： e20190103.

[42] Verrecchia F，Mauviel A.Transforming growth factor-beta and fibrosis[J].WorldJGastroenterol， 2007，13（22）：3056.

[43]KanamaruY，NakaoA，TanakaY，etal.Involve ment p3oo in TGF-beta/Smad-pathway-mediated alpha2（I） collagen expression in mouse mesangial cells[J].NephronExpNephrol，2003，95（1）：e36.

[44]WilkesMC，Le EB.Transforming growth factor βactivation c-abl isindependent receptor internalizationand regulated byphosphatidylinositol 3-kinaseand PAK2 in mesenchymal cultures[J].JBiol Chem，2006，281（38）：27846.

[45] Derynck R，ZhangYE.Smad-dependentand Smadindependent pathways in TGF-beta family signalling[J].Nature，2003，425（6958）：577.

[46] Wang Y S，Zheng X F.Research progress on the pathogenesis primary pterygium[J].Eye Sci， 2024，39（1）：53.[王宇珊，鄭曉汾.原發(fā)性翼狀 肉發(fā)病機制的研究進展［J].眼科學報，2024，39 （1）：53.]

[47]EfeG，Rustgi AK，Prives C.p53 at the crossroads tumor immunity[J].Nat Cancer，2O24，5 （7）：983.

（責任編輯：白林含）