電針干預改善大腦中動脈栓塞大鼠腦部缺血機制的研究

Electroacupunctureinterventiononmechanismofcerebralischemiainratswithmiddlecerebralarteryoccusion （MCAO）

YANG Yunrongl，FENG Hui’，GUAN Huazong2

'RehabilitationDeparment，uuiCentralHospital，anghai，hina;Depatmentfrevntieedicine，aa Hospital Afiliated to Shanghai UniversityofTraditional Chinese Medicine，Shanghai2ooo5o，China.

[Abstract]Objective：ToobservetheeffectofelectroacupunctureontheexpressionofHtrA1inastrocyteswithinthe hippocampaltissueofratswithacutecerebralinfarction.Methods：Twenty-fourmaleSDratswereselectedandrandomly divided intothesham-operation，model，andelectroacupuncturegroups，with8ratsineachgroup.Themodel and electroacupuncturegroupsunderwentrightmidlecerebralarteryoclusion（MCAO）modelingviatheintraluminal filament occlusionmethod.Thesham-operationgroupreceivedidenticalsurgical exposurewithout filamentinsertion.Twenty-fourhours aftersuccesful modeling，ratsintheelectroacupuncturegroupreceivedelectroacupuncture treatmentatBaihui（GV2o）and Shenting（GV24）using dense-disperse waveswithalternating frequencies of2/15 Hz andacurrent intensityof 1.5–2 mA. Cerebralblodflowchangesastrocyteexpressionandactivationstatus，HrAlmRNAlevels，HtrAlproteinexpressonlevels， and TNF- α ，IL- 1β ，and IL-6 levels of three groups were measured and compared seven days after the operation.Results： WesternblotingshowedthatHtrA1expressioninthemodelgroupwassignificantlyincreasedcomparedtothesham-operation and electroacupuncture groups（both Plt;0.05 ）.Quantitative real-time PCR （qRT-PCR）showed that HtrA1 mRNA expression level in the electroacupuncture group was significantly lower than that in the model group（ Plt;0.05 ）.ELISA showed that the model group had the elevated levels of TNF- α ，IL- 1β ，and IL-6 compared to the sham-operation group （all Plt;0.05 ），while the electroacupuncture group had the reduced levels of TNF- α，lL^-1lβ ，and IL-6 compared to the model group（all Plt;0.05 ）. Conclusions：lectroacupuncturecanleviateijuryproerologicalfuctioancerebralbloodflondpst inflammatoryresponseandthemechanismmaybeassociatedwiththeinibitionof HtrA1proteinexpressionandsuppressonof astrocyte polarization.

[Keywords] Electroacupuncture;Astrocytes;Cerebral ischemia reperfusion;Cerebral infarction

腦卒中已成為全球范圍內造成殘疾甚至死亡的主要疾病之一[1]，其中，缺血性腦卒中（cerebral ischemicstroke，CIS）是最常見的類型，也是最具神經破壞性的疾病之一[2]。臨床常采用溶栓法治療CIS，用于恢復大腦血液供應，但治療過程中易造成缺血再灌注損傷[3]。大腦中動脈栓塞（middle cerebral arteryocclusion，MCAO）模型是一種常用的大鼠腦缺血模型，用于研究CIS[4]。該模型通過在大鼠大腦中動脈上進行永久性結扎或部分結扎，使大腦發生缺血性損傷，模擬腦卒中的病理生理過程[5]。抑制CIS患者早期神經炎癥反應，促進神經功能恢復，可顯著減輕缺血性腦損傷，減輕患者家庭及社會負擔[6-8]。研究表明，電針可明顯改善腦缺血患者的神經功能與炎癥狀況[9-10]，但對其生物分子層面的研究并不深入。

星形膠質細胞（astrocytes，AS）是大腦中最豐富的細胞，也是主要的神經膠質細胞之—[11-12]。AS在中樞神經系統損傷后活化并改變其細胞特性，成為反應性星形膠質細胞（reactiveastrocytes，RAS）。RAS為促炎型膠質細胞，能應對多種神經受損，被視為一種表征中樞神經系統存在結構性疾病的病理指示。高溫需求絲氨酸蛋白酶A1（hightemperaturerequirementserineproteaseA1，HtrA1）是前腦AS的新標志物，在神經膠質生成過程中 HtrAI 基因的缺失加速了AS的分化[13]。電針可改善MCAO模型大鼠神經功能可能與誘導AS激活有關[1o]。基于此，本研究擬采用電針治療右側MCAO模型大鼠，觀察其療效及電針后AS的極化情況。

1材料與方法

1.1 實驗動物

選取成年雄性SD大鼠24只（交通大學醫學院實驗動物中心提供），體質量 250～320g ，每籠4只，于 23^°C，12h 光/暗循環的環境飼養，自由獲取水和食物。鼠飼養及實驗過程遵守《中國實驗動物管理條例》。本研究獲得交通大學基礎醫學院生物與醫學倫理委員會審批（批號：2019027）。

1.2 儀器與試劑

采用一次性無菌針灸針（華佗牌一次性針灸針，規格 0.25mm×13mm ，蘇州醫療用品廠有限公司）、HANS-200E韓氏穴位神經刺激儀（南京濟生醫療科技有限公司）、ABIStepOnePlus實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction，PCR）儀（美國應用生物系統公司）、Zeiss熒光共聚焦顯微鏡（德國卡爾蔡司）、高通量組織研磨器SCIENTE-48（寧波新芝公司），以及天根反轉錄試劑和熒光定量PCR試劑盒、賽默飛HtrA1抗體、賽默飛BCA蛋白定量試劑盒、注射用六氟化硫微泡（聲諾維）等。

1.3分組及干預方法

24只大鼠隨機分為假手術組、模型組和電針組各8只。假手術組僅分離右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈及翼腭動脈，不進行線栓阻塞，直接縫合。模型組及電針組均建立MCAO模型，并于血流阻塞2h 后拔除線栓，實現再灌注。模型組常規飼養，不接受電針治療。電針組術后 24h ，選取百會穴、神庭穴施以疏密波電針干預，頻率 2/15Hz ，電流強度 1.5～ 2mA ，強度逐漸加到大鼠耳朵輕微抖動、不嘶叫，刺激時間 30min 。

1.4 檢測指標

1.4.1神經功能缺損評估3組大鼠分別在術后24h （電針干預前）和術后7d行改良神經嚴重程度評分（modified neurological severity score，mNSS）。mNSS評分主要包括運動（6分）感覺（2分）、反射（4分）和平衡（6分）4個方面的得分，得分越高代表損傷越嚴重。

1.4.2腦血管彩色多普勒超聲檢測術后7d麻醉大鼠、剃除雙側大腦顱頂區域被毛，于冠狀縫向顱骨后部 4mm ，距矢狀縫兩側 3mm 處使用牙科鉆打開兩側顱骨暴露腦組織，將激光多普勒探頭用生物速凝膠固定于硬腦膜，在尾部打入對比劑（注射用六氟化硫微泡， 0.01mL/100g，3.5mL/h） ，調試儀器檢測并記錄大鼠腦部血流。

1.4.3蛋白質印跡法檢測超聲檢測后，取大鼠缺血半暗帶 10mg ，放射免疫沉淀分析裂解液裂解后，離心取上清液。采用二喹啉甲酸法檢測蛋白濃度。取 25μg 蛋白十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將蛋白轉印至聚偏二氟乙烯轉印膜上。 10% 脫脂奶封閉 1.5h，HtrA1（1：1000） 和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（ （1：2000） 抗體 4^°C 冰箱搖床過夜孵育，Tris緩沖鹽溶液 + 吐溫20清洗3遍后，鼠抗和兔抗 （1：2000） 室溫孵育 ^2h 。Tris緩沖鹽溶液 + 吐溫20清洗后，采用增強化學發光法檢測蛋白條帶并拍照。

1.4.4免疫熒光染色取材后將切片漂洗滴加一抗膠質纖維酸性蛋白（GFAP）（1：200）， 4^°C 孵育過夜。次日二抗孵育1h，漂洗后貼片滴加含 4^′ ，6-二基-2-苯基咪啶（DAPI）的封片液， 4^°C 過夜晾干。在每張免疫熒光染色切片中隨機選取3個視野 （×20） ，使用ImageJ1.8.0軟件計算免疫熒光染色蛋白平均表達光密度值。

1.4.5實時熒光定量PCR使用trizol法從大鼠腦組織或培養細胞中分離總RNA。使用賽默飛逆轉錄酶，用 1μg 總RNA生成cDNA，并用于定量實時熒光定量PCR。PCR在Realplex2熱循環儀中進行。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內部對照，在各組之間進行比較，對基因表達水平進行標準化。所有實時熒光定量PCR研究至少行3個獨立實驗。

1.4.6ELISA檢測將腦組織勻漿后，加入裂解液，以 30 000r/min 離心速度在 4^°C 下離心 15min ，分裝，-20^°C 保存。采用ELISA試劑盒檢測上清液中炎癥因子腫瘤壞死因子 σ_α（TNF-αε） ）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）蛋白濃度。

1.5統計學分析

采用SPSS26.0軟件對數據進行分析。采用GraphPadPrism8.3.0軟件繪制相應圖表。計量資料以 表示，2組數據比較行獨立樣本 Φ_t 檢驗，3組比較行單因素方差分析，3組間兩兩比較行LSD檢驗。以 Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1模型組與電針組 mNSS 評分的比較

缺血再灌注后 24h 和7d，采用 mNSS 評分法進行評估： ① 術后 24h （電針組干預前），模型組與電針組mNSS評分差異無統計學意義（ P=0.965 ）；② 術后7d，電針組mNSS評分顯著低于模型組（ P= 0.003）（圖1）。

圖1模型組與電針組mNSS評分的比較注： mNSS 評分為改良神經嚴重程度評分

2.2 術后7d3組大鼠腦部血流的改變

術后7d，假手術組大鼠雙側腦血流雖不對稱但較豐富；模型組與假手術組比較，雙側血流下降，患側（右側）較健側（左側）更低；電針組電針干預后雙側血流優于模型組（圖2）。

圖2術后7d3組大鼠腦部血流影像注：圖2a為假手術組，圖2b為模型組，圖2c為電針組。紅色代表血流朝向探頭方向，藍色為遠離探頭方向，粉色框中為患側與健側對比區域

2.3術后7d3組大鼠缺血半暗帶 HtrAl 表達水平 的比較

術后7d，與假手術組相比，模型組HtrA1表達水平顯著升高（ （Plt;0.01） ；與模型組相比，電針組顯著降低 （Plt;0.01） 。從轉錄層面來看，與蛋白趨勢一致（圖3）。

2.4術后7d3組大鼠ASGFAP陽性活化的比較

各組大鼠冰凍切片采用GFAP熒光染色，采用AS標志物GFAP標記活化的AS。與模型組相比，電針組干預后顯著抑制了AS活化（ Plt;0.01 （圖4，5）。

2.5術后7d3組大鼠炎癥因子水平的比較

模型組炎癥因子TNF- ∝ IL-1β、IL-6均明顯高于假手術組和電針組（均 Plt;0.05 （圖6）。

3討論

電針療法是將中醫學治療手段和現代電刺激治療相結合的方法，電針是在針刺腧穴“得氣”后，將針連接電針治療儀，與電刺激有機結合通過毫針作用于人體一定部位[14]，臨床治療范圍較廣。其治療腦卒中療效顯著[15]。多項研究表明電針干預在腦卒中相關后遺癥中發揮了顯著作用[16-21]。電針治療可改善急性CIS神經功能損傷，療效優于單純西醫治療[16.21-22]。針灸療法和/或結合康復方案，可顯著提高CIS患者的生活質量，較單純康復治療更有效。電針是治療CIS的一種重要的非藥物性療法，常用來治療缺血再灌注損傷，其療效的發揮與調控AS極化及激活密切相關[16，21-22]。楊靜等[23]研究表明， 2/15Hz 和 2/30Hz 的疏密波能激發腦缺血的耐受性，從而產生腦保護效果。這一發現與電針預處理對大鼠缺血再灌注后炎性因子及細胞凋亡的影響研究結果相吻合，后者也證實了采用特定頻率 （2/15Hz 的疏密波可誘導腦缺血耐受，減輕腦損傷。缺血再灌注后大鼠會出現神經行為學缺損癥狀，如患側前后肢屈曲、肌張力增高、抓握力下降，甚至行走時向一側不自主轉圈。本研究證實電針可顯著改善腦卒中后大鼠的神經功能。

圖3術后7d3組大鼠缺血半暗帶的高溫需求絲氨酸蛋白酶 A1（HarA1 表達水平注：圖3a為蛋白質印跡法HtrAl 的蛋白條帶；圖3b為實時熒光定量PCR的 HtrAl 蛋白條帶的柱狀圖；圖3c為實時熒光定量PCR的HtrA1mRNA相對表達量柱狀圖

圖43組大鼠星形膠質細胞（AS）的GFAP與DAPI免疫熒光雙標染色注：GFAP為膠質纖維酸性蛋白，DAPI為4'，6-二胱基-2-苯基咪啶。紅色為GFAP陽性表達，藍色為DAPI陽性表達，Merge為GFAP與DAPI的合并圖。箭頭所示為活化AS

圖5免疫熒光統計直方圖注：GFAP為膠質纖維酸性蛋白圖63組缺血再灌注后炎癥因子比較注：圖6a示白介素-6（的蛋白濃度，圖6b示腫瘤壞死因子- Δ∝（TNF-α） 的蛋白濃度，圖6c示白介素-1β（IL-1β）的蛋白濃度

本研究ELISA檢測結果顯示：缺血再灌注后7d，模型組大鼠神經功能損傷嚴重，腦部血流較假手術組減少，同時缺血半暗帶中炎癥因子TNF- σ?α∝ 、IL-1β、IL-6表達明顯高于假手術組，可能與缺血再灌注損傷有關，還可能阻礙神經功能的恢復。而電針干預后，電針組大鼠神經功能恢復良好，腦部血流較模型組增多，缺血半暗帶中炎癥因子TNF- ∝ 、IL-1β、IL-6明顯低于模型組，表明電針在缺血再灌注的過程中具有抑制炎癥的作用。

與神經元相比，AS的缺血耐受性更強[10.13]，其通過參與調節離子穩態、維持血-腦脊液屏障、減輕興奮性毒性及促進缺血后神經組織的再生與修復，為重建神經功能完整性提供可能的途徑，可作為CIS治療的潛在靶標[22，24]。 HtrAl 屬于絲氨酸蛋白酶家族，是一種熱休克誘導的蛋白質，在高溫下充當蛋白酶，以幫助在熱休克期間去除未折疊的蛋白質。HtrA1下調促進細胞運動，而其表達增強時減弱細胞運動[22，24]。腦損傷誘導RAS中 HtrAl 的表達，內皮細胞和免疫細胞增殖增加。

綜上所述，電針干預可有效下調MCAO模型大鼠梗死區 HtrAl 蛋白的表達，可能與電針抑制AS激活及炎癥因子的表達有關。

[參考文獻]

[1]GUZIK A，BUSHNELL C. Stroke epidemiology and risk factormanagement[J].Continuum（Minneap Minn）， 2017，23（1，Cerebrovascular Disease）：15-39.

[2]SUNT，CHEN S，WUK，et al.Trends in incidence and mortality of stroke in China from 199O to 2019[J]. Front Neurol，2021，12：759221.

[3]BARTHELS D，DAS H.Current advances in ischemic stroke research and therapies[J].Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis，2020，1866（4）：165260.

[4]LIY，ZHANG J.Animal models of stroke[J].Animal Model Exp Med，2021，4（3）：204-219.

[5]蔣蘭，傅新民，孫夢飛，等．大腦中動脈閉塞性急性缺血 性卒中血管內治療后不良預后的危險因素分析及預測模 型開發[J].中國卒中雜志，2025，20（4）：418-427.

[6]ZHAO Y，ZHANG X，CHEN X，et al. Neuronal injuries in cerebral infarction and ischemic stroke：from mechanisms to treatment（Review）[J].Int J Mol Med，2022， 49（2）：15.

[7]HILKENSN A，CASOLLA B，LEUNGTW，et al.Stroke [J].Lancet，2024，403（10446）：2820-2836.

[8]FEIGIN V L，BRAININ M，NORRVING B，et al. World strokeorganization：global stroke fact sheet 2O25[J]. Int J Stroke，2025，20（2）：132-144.

[9］張思琪，楊添淞，馬帥，等．電針“百會\"\"神庭\"對腦缺血 再灌注不同時間點大鼠炎癥因子的影響[J].針灸臨床 雜志，2023，39（7）：79-84.

[10]顧津夷，張小卿，王一鶴．基于miR-21探討針刺對 PI3K/AKT信號通路腦缺血再灌注大鼠腦區星形膠質細 胞影響[J].遼寧中醫藥大學學報，2024，26（3）：155- 159.

[11]FREEMAN M R. Specification and morphogenesis of astrocytes[J]. Science，2010，330（6005）：774-778.

[12]GUILLAMON-VIVANCOS T，GOMEZ-PINEDO U， MATIAS-GUIU J. Astrocytes in neurodegenerative diseases （I） ：function and molecular description[J]. Neurologia，2015，30（2）：119-129.

[13]CHEN J，VAN GULDEN S，MCGUIRE T L，et al. BMP-responsive protease HtrA1 isdifferentiallyexpressed in astrocytes and regulates astrocytic development and injury response[J]. J Neurosci，2018，38（15）： 3840-3857.

[14］林錦文，齊詩儀，王世豪，等.基于眼電信號關聯維數特 征探討針灸“治神\"對得氣針感的影響[J].中醫藥 雜志，2025，59（3）：12-17.

[15」邱思淦，張雪楓，古來撒爾·艾克拜爾，等.針灸神經調控領域的研究現狀[J].世界中醫藥，2024，19（6）：878-886.

[16」張平，楊樸，陳國強，等.電針聯合語言康復訓練治療卒中后言語障礙患者的效果[J.中國民康醫學，2024，36（1）：79-81.

[17］吳小慧，焦楊.電針治療腦卒中后肢體偏癱臨床觀察[J].光明中醫，2024，39（2）：329-331.

[18］郭清娟，武佳麗，張晶晶，等．經顱交流電刺激聯合電針對腦卒中注意障礙患者的影響[J/OL].康復學報，2025：1-7[2024-07-25]. http：kfxb.publish.founderss.cn.

[19」吳丹，漆仲文，張偉，等．腦缺血/再灌注損傷后線粒體結構與功能穩態失衡機制的研究進展［J].中國醫藥導報，2021，18（31）：42-45.

[20]降錦洲，余方向，劉喆宇，等．腦卒中后手痙攣康復治療的研究進展[J].中國老年學雜志，2025，45（7）：1750-1754.

[21］李兆珍，張丹參．腦缺血再灌注損傷相關機制的研究進展[J].神經藥理學報，2020，10（6）：60-63.

[22]馬育軒，臧亨利，朱藝霞，等.針藥結合干預缺血性腦中風研究進展[J].針灸臨床雜志，2023，39（10）：107-111.

[23]楊靜，熊利澤，王強，等．不同刺激參數及其組合對電針誘導大鼠腦缺血耐受效應的影響[J].中國針灸，2004，24（3）：62-66.

[24］關云飛，翟哲，蘇培偉，等．針刺調控星形膠質細胞治療缺血性腦損傷研究進展[J].山東中醫雜志，2023，42（6）：646-651.

（收稿日期 2024-07-28）