LsSAT2在大豆毛狀根中的異源表達分析

大豆（Glycinemax）與山黧豆（Lathyrus sa-tius）等豆科作物均具有較高的蛋白含量，含有的必需氨基酸組分較為平衡，是人類和禽畜所需的重要植物蛋白來源[1-3]。在蛋白質(zhì)氨基酸中，含硫氨基酸（甲硫氨酸、半胱氨酸）在細胞代謝和抗氧化防御等多種生理過程和維護人體免疫系統(tǒng)功能等方面具有重要作用[4]。然而，豆科作物的含硫氨基酸含量通常較低，這也是制約大豆和山黧豆營養(yǎng)價值的關鍵因素[5]。研究表明，含硫氨基酸缺乏與山黧豆神經(jīng)活性物質(zhì) β -N-草酰-L-α，β-二氨基丙酸（ β -N-oxalyl-L α?αα ， β -diaminopropi-onicacid， β -ODAP）的生物合成密切相關[6-8]，是導致山黧豆神經(jīng)中毒的重要因素[9-10]

含硫氨基酸的積累起始于硫在植物中的同化作用。在硫同化途徑中，絲氨酸乙酰基轉移酶（serineacetyltransferase，SAT）催化絲氨酸（Ser）與乙酰輔酶A合成O-乙酰絲氨酸（O-acetylser-ine，OAS），并進一步生成半胱氨酸（Cys）和甲硫氨酸（Met）;該過程是植物硫代謝調(diào)控的樞紐[11]。SAT主要定位于細胞質(zhì)、線粒體、葉綠體等細胞器，為Cys在細胞各區(qū)室的發(fā)生奠定了基礎[12]

在細胞質(zhì)中，Cys對植物免疫起至關重要的作用；在線粒體中，Cys可以參于氰化物的解毒、根毛發(fā)育以及抵抗病原體[13]。蛋白互作和酶活分析等試驗表明，山黧豆LsSAT2可通過與 β -腈基丙氨酸合成酶（ β -cyanoalanine synthase， β -CAS）形成線粒體半胱氨酸合成酶調(diào)控復合物（cysteine reg-ulatorycomplex，CRC），從而起到 β ODAP生物合成調(diào)控分子開關的作用[14]。 LsSAT2 在山黧豆毛狀根中的過表達確實引起了 β -ODAP含量的降低[15]。但是，LsSAT2不是催化 β? -ODAP生物合成的末端酶，而是通過調(diào)控硫代謝途徑關鍵化合物Cys等的含量影響 β -ODAP生物合成[16]。大豆是豆科作物研究的模式生物，其含硫化合物代謝通路與山黧豆可能具有一定的保守性。為進一步分析LsSAT2對含硫化合物合成的調(diào)控作用，本研究基于大豆毛狀根遺傳轉化體系進行了LsSAT2 的異源表達，通過液質(zhì)聯(lián)用檢測了Ls-SAT2 過表達對于含硫氨基酸等代謝物含量的影響，利用IP-MS分析了LsSAT2潛在的蛋白互作網(wǎng)絡，為進一步理解LsSAT2在含硫化合物代謝及 β -ODAP生物合成調(diào)控中的作用奠定了基礎。

1材料與方法

1.1 試驗材料

大豆（Williams82）、家山黧豆、發(fā)根農(nóng)桿菌（K599）、大腸桿菌克隆菌株（Top10）等均由山黧豆種質(zhì)資源利用與創(chuàng)新實驗室保存并提供。

1.2植物過表達載體的構建

以實驗室保存的山黧豆萌發(fā)6d種子cDNA為模板，根據(jù)特異性引物（F：GTCGACTC-TAGAGGATCCGGTACCATGTTTGTTCTT-GTTCTTGGTCGTT，R：CGAGCTCACTAGT-CTCGACTACTTATCGTCGTCATCCTTGTA-ATCGATAACATAATCAGACCAATCCGAA）進行LsSAT2基因擴增。利用同源重組，將擴增得到 LsSAT2 片段連接至線性化的pCAM-BIA1300-UBQ10載體上；并利用化學轉化法轉化至大腸桿菌Top10。測序正確的陽性重組子pCAMBIA1300-LsSAT2轉化至發(fā)根農(nóng)桿菌K599。

1.3發(fā)根農(nóng)桿菌介導的大豆毛狀根誘導

挑選飽滿、無病斑的大豆種子，采用 3% 次氯酸處理并于1/2MS固體培養(yǎng)基、 25°C 光照條件下培養(yǎng)7d，光周期為 ^16h 光照/ ^′8h 黑暗。以生長7d的大豆子葉為外植體，采用切根一裹菌轉化方法，用發(fā)根農(nóng)桿菌K599菌糊侵染大豆子葉切口并置于1/2MS固體培養(yǎng)基（含 100μmol/L 乙酰丁香酮）于 25°C 避光培養(yǎng)。以空載K599侵染作為陰性對照。培養(yǎng)期間，利用 1/2MS 液體培養(yǎng)基（含 500mg/L Cef）清洗外植體 5～6 次進行除菌后轉移至新的1/2MS固體培養(yǎng)基（含500mg/LCef，pH5.6） 暗培養(yǎng)。

1.4轉基因大豆毛狀根的鑒定

取繼代培養(yǎng)30d的大豆毛狀根 0.2g ，液氮研磨至粉末，利用 400μL 總蛋白提取液（ ΔpH 7.5，含 140mol/LNaCl，10mol/LNa₂HPO₄ ·12H₂O，1. 8mol/LKH₂PO₄，2. 7mol/LKCl 10% 甘油， 1% Triton-X-100）充分提取后，于4°C，12000r/min 離心 10min 。所獲上清經(jīng)SDS-PAGE電泳分離目標蛋白，用 0.25% 麗春紅染色并觀察條帶。用電轉法于 280mA 轉膜75min ，使目標蛋白轉移到NC膜上。經(jīng)TBST漂洗、 5% 脫脂奶粉封閉后，與Flag標簽一抗（購自全式金公司） 4^°C 過夜孵育。用TBST進一步漂洗NC膜后，與羊抗鼠二抗（購自全式金公司）在常溫下孵育 2.5h ，用特超敏ECL（Servicebio）化學發(fā)光即用型底物對NC膜顯色 1min ，用化學發(fā)光成像系統(tǒng)（ChemiDocXRS + ，Bio-Rad）觀察并拍照。

1.5利用LC-MS法檢測 LsSAT2 基因異源表達大豆毛狀根株系的OAS、Cys、Met含量

稱取OAS、Cys、Met標準品溶解于 50% 乙醇水溶液（含 0.1mol/L 鹽酸）配制標準混合液，用 50% 甲醇分別稀釋為 500，250，125，62，5， 31.25，15.625ng/mL 。用 0.22μm 濾膜過濾后上機檢測，以氨基酸濃度為橫坐標 （x ）、峰面積響應值為縱坐標 （y） 繪制標準曲線。

稱取 0.2g 大豆毛狀根，液氮研磨至粉末狀，加入 3mL50% 乙醇水溶液（含 0.1mol/L 鹽酸）混勻， 4^°C 條件下旋轉孵育 30min 。 12 000r/min 離心 10min 后取上清，用 0.22μm 濾膜過濾并用三重四級桿復合線性離子阱液質(zhì)聯(lián)用儀（美國ABSCIEX公司）檢測。色譜檢測條件為：色譜柱采用IntertsilOSD-4C18（島津公司），柱溫箱25°C ，流速 0.3mL/min ，流動相A為 0.5% 甲酸水溶液，流動相B為甲醇。質(zhì)譜檢測條件為：采用電噴霧電離源（ESI，離子化電壓 5.5kV ，離子源TurboIonSpray探針的加熱器氣體溫度為600^°C ，噴霧氣（GS1）和輔助加熱氣（GS2）分別為413.69kPa ，氣簾氣為 241.32kPa 。采用多反應監(jiān)測MRM掃描方法對氨基酸進行碎裂和掃描，具體參數(shù)見表1。

表1待測氨基酸的質(zhì)譜參數(shù)

Table1Massspectrumparametersof aminoacidstobedeterminated

1.6LsSAT2基因異源表達大豆毛狀根株系的IP-MS分析

經(jīng)Westernblot鑒定后，選取大豆轉基因毛狀根株系 LsSAT2-3 用于IP-MS分析。利用抗Flag免疫磁珠（購自ABclonal公司）富集Ls-SAT2-Flag目標蛋白及其互作蛋白，獲得的蛋白樣品經(jīng)Westernblot鑒定后用胰酶消化（ 37^°C 溫育 12～16h ，采用三合一超高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀（納流毛細管液相色譜儀Easy-nLC1200，Ther-mo Fisher Scientific）及三合一質(zhì)譜儀 OrbitrapFusionLumos，ThermoFisherScientific）進行分析。納流毛細管液相色譜檢測條件為：流動相A為 0.1% 甲酸水溶液，流動相B為含 0.1% 甲酸的乙腈－水混合溶劑 $（ V _ { ＼Zagger ＼ Z } ： V _ { ＼ X } = 8 0 ： 2 0 ）$ ，流速300nL/min 。質(zhì)譜條件為：離子源為電噴霧離子源（ESI；檢測方式為多反應監(jiān)測（MRM）；離子源溫度 600^°C ；離子對的駐留檢測時間（dwelltime）為 100ms ；電壓 70eV ；全掃描模式，掃描范圍質(zhì)荷比 375～1500（m/z） ；四極桿溫度 150°C ，傳輸線溫度 240^°C ；溶劑延遲 7min，14.3～15.5 min質(zhì)譜燈絲關閉。使用ProteomeDiscovered2.2數(shù)據(jù)庫檢索目標蛋白。以UniprotKB下載的大豆蛋白質(zhì)序列作為數(shù)據(jù)庫，利用Uniprot軟件進行搜索比對，利用String數(shù)據(jù)庫分析上述蛋白的互作網(wǎng)絡，利用Cytoscape軟件對蛋白互作網(wǎng)絡進行進一步分析和美化。為了進一步分析LsSAT2互作蛋白的生物學和功能特性，利用STRING在線工具進行了功能富集分析，錯誤發(fā)現(xiàn)率（FalseDiscoveryRate， FDR）lt;0.05 被設定為GO和KEGG分析截至值。然后利用 R_gg^- plot包對獲得的基因GO/KEGG功能富集結果進行可視化分析。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS26.0進行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均表示為“平均值±標準差”，每組試驗至少設計3個生物學重復。利用單因素方差分析（one-wayanalysisofvariance，ANOVA）進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1LsSAT2基因異源表達大豆毛狀根株系的誘導及鑒定

分別用攜帶pCAMBIA1300-LsSAT2質(zhì)粒及相應空載質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌K599菌糊侵染大豆子葉外植體，在避光共培養(yǎng)9d左右即在大豆子葉切口處可見毛狀根（圖1）。毛狀根的誘導率約為 42.5% 。

提取繼代培養(yǎng)30d的大豆毛狀根總蛋白，用Flag標簽抗體進行Westernblot鑒定。結果表明，在轉空載大豆毛狀根中未檢測到條帶，而所測8個 .LsSAT2 異源表達的大豆毛狀根株系均在43ku 呈現(xiàn)特征條帶（圖2）。表明成功獲得 LsSAT2 異源表達的大豆毛狀根株系。

圖1培養(yǎng)30d的大豆毛狀根（A）及局部放大圖（B）

Fig.1Soybeanhairy roots cultured for 30 days （A） and partial enlargement view （B）

2.2 OE-LsSAT2毛狀根株系的OAS、Cys、Met含量變化

取OELsSAT2-3和OELsSAT2-6轉基因系，利用LC-MS/MS檢測OAS、Cys、Met含量。結果表明，相比陰性對照（轉空載的大豆毛狀根），OE LsSAT2–3 和OE LsSAT2-6 毛狀根中的OAS、Cys、Met含量均呈增加趨勢（圖3）。這說明山黧豆和大豆的絲氨酸乙酰合成酶催化功能具有一定的保守性， LsSAT2 在大豆毛狀根中的異源表達產(chǎn)物可以催化底物Ser與乙酰輔酶A合成OAS，進而生成Cys和Met。

2.3LsSAT2基因異源表達大豆毛狀根株系的IP-MS分析

取1 ELsSAT2-3 大豆毛狀根用于IP-MS分析。利用Flag磁珠進行免疫沉淀，并用Flag標簽抗體對獲得的蛋白樣品進行Westernblot分析。結果顯示， OELsSAT2–3 株系經(jīng)免疫沉淀所獲樣品富集了異源表達的LsSAT2，其大小與毛狀根總蛋白（Input）中檢測到的LsSAT2蛋白大小一致（ ，可以用于進一步的LC-MS/MS分析（圖4）。

圖2LsSAT2異源表達大豆毛狀根株系的Westernblot鑒定

圖3液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定OAS、Cys、Met含量Fig.3 Content of OAS，Cys，MetdeterminedbyLC-MS/MS

圖4OELsSAT2-3大豆毛狀根株系的IP富集及WB鑒定

Fig.4IPenrichmentandWBidentification ofLsSAT2 ectopic-expressingsoybeanhairyroot lines

取上述免疫沉淀樣本，經(jīng)SDS-PAGE分離、膠內(nèi)酶解處理、LC-MS/MS分析后，利用Uniprot軟件進行搜索比對，獲得616個蛋白與LsSAT2存在潛在的互作關系。GO分析表明，這些蛋白主要定位于胞質(zhì)內(nèi)蛋白復合體上，包含催化蛋白、各種分子結合蛋白、環(huán)狀和雜環(huán)化合物結合蛋白等，通過細胞內(nèi)相關代謝途徑以及相關分子生物合成途徑進行調(diào)控。KEGG分析結果表明，上述蛋白主要集中在新陳代謝途徑、次生代謝物的生物合成途徑、碳代謝途徑及氨基酸代謝途徑等（圖5）。

對上述獲得的616個蛋白進行蛋白一蛋白互作網(wǎng)絡分析（PPI）及節(jié)點蛋白分析。結果表明，與LsSAT2互作的蛋白涉及糖酵解、泛素化修飾等生物學過程。LsSAT2與半胱氨酸合成酶、色氨酸合成酶、同化亞硫酸鹽還原酶、ATP合成酶、絲氨酸羥甲基轉移酶等可能存在蛋白互作關系（圖6、表2）。

3討論

含硫營養(yǎng)的缺乏是制約大豆、山黧豆等豆科作物營養(yǎng)價值的關鍵因素[8]。諸多研究表明，利用含硫氨基酸合成及代謝途徑的關鍵基因如硫酸鹽轉運蛋白（Sulfate transporters）[17]、三磷酸腺苷硫酸化酶（ATP sulfurylase）[18]、O-乙酰絲氨酸硫氫化酶（O-acetylserinesulfhydrylase，OASS）[19]、胱硫醚合酶（Cystathionine synthase）[2o]、鈣調(diào)磷酸酶B蛋白（Calcineurin B-likeprotein[21] SAT^[22] 等進行遺傳轉化是改善豆科作物含硫營養(yǎng)的可行方案。例如， GmSultr1：2b 在大豆品種‘南農(nóng)88-1'和‘Jack中的過表達導致含硫氨基酸含量的顯著提升[23]；胞質(zhì)GmOASS在轉基因大豆植株的活性增加了 4～10 倍，半胱氨酸水平增加 58%～74%^[19] ： ATPS 在大豆中的過表達導致半胱氨酸和甲硫氨酸含量最多可提高 52% 和 19%^[24] 。本研究基于大豆毛狀根遺傳轉化體系進行了山黧豆 LsSAT2 的異源表達，結果顯示大豆轉基因毛狀根株系中的半胱氨酸和甲硫氨酸含量均顯著高于對照。這表明山黧豆LsSAT2確實參與了含硫氨基酸的合成調(diào)控。

含硫營養(yǎng)的缺乏與 β -ODAP的攝人過量是導致山黧豆中毒的并行因素[25-26]。本研究將Ls-SAT2 在大豆毛狀根中進行異源表達引起了含硫氨基酸含量的上調(diào)，說明SAT的功能在大豆和山黧豆中具有一定的保守性。因此，LsSAT2可做為山黧豆含硫氨基酸含量調(diào)控的靶點。在山黧豆

圖6LsSAT2互作蛋白的PPI網(wǎng)絡（A）和20個節(jié)點蛋白（B）

Fig.6PPI network（A）and 20 hub genes（B） of LsSAT2 interacting proteins

中， β -ODAP的生物合成和硫代謝途徑密切關聯(lián)[5-6]， β -ODAP與Cys 的合成對于其共同前體OAS具有競爭作用[，當Cys合成增強時會降低β -ODAP的合成效率。實際上，當 LsSAT2 在山黧豆毛狀根過表達時確實引起了 β -ODAP含量的下調(diào)及含硫氨基酸含量的上調(diào)[15]。因此，Ls-SAT2是山黧豆硫代謝與 β -ODAP合成途徑的關鍵酶[7-8]

山黧豆LsSAT2的活性受到其互作蛋白的顯著影響，如LsSAT2通過其羧基末端的C10肽與LsCAS形成CRC復合物調(diào)控二者酶活[7-8]，LsAAE3則與LsCAS競爭LsSAT2羧基末端[15]。本研究利用IP-MS分析表明，LsSAT2 與半胱氨酸合成酶、色氨酸合成酶、同化亞硫酸鹽還原酶、ATP合成酶、絲氨酸羥甲基轉移酶等存在復雜的蛋白互作關系。

表2轉LsSAT2大豆中PPI網(wǎng)絡的20個hub蛋白

Table 2 Top20 hub proteins in PPI networks of soybean hairy roots overexpressingLsSAT2

綜上所述，本研究獲得了 LsSAT2 基因異源表達的大豆毛狀根株系，轉基因株系中的O-乙酰絲氨酸及半胱氨酸、甲硫氨酸的含量顯著上調(diào)。LsSAT2互作蛋白參與了植物次生代謝以及碳代謝，氨基酸代謝及糖酵解等新陳代謝途徑及相關分子生物合成等途徑。結果為SAT活性調(diào)控的深入理解和山黧豆種質(zhì)資源的遺傳改良提供了新的思路。

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Analysis of Ectopic Expression of LsSAT2 in Hairy Roots of Soybean

TANG Yanni1 ，SHANG Tianxue1 ，MIAO Zhibo1 ，ZHANG Xueping ¹ ， CAO Ning2，LIAN Rongfang2，WANG Lei and XU Quanle1 （1.College of Life Sciences，Northwest Aamp;F University，Yangling Shaanxi 71210o，China; 2.Dingxi Academy of Agricultural Sciences，Dingxi Gansu 743ooo，China；3.School of Ecology and Environment， NorthwesternPolytechnicalUniversity，Xi'an 7loo72，China）

Abstract The neuroactive β -N-oxalyl-L- α β -diaminopropionicacid（ β -ODAP）is the causative agent to cause lathyrism，and the deficiency of sulfur-containing amino acid in Lathyrus satious is closely correlated with β -ODAP biosynthesis and lathyrism. To analyze the functions of serine acetyltransferases in sulfur metabolism，LsSAT2 in L . sativus was ectopically expressed in soybean. Subsequently，the content of O-acetyl serine，cysteine and methionine in soybean hairy root lines overexpressing LsSAT2 was examined via LC-MS. Proteins interacting with LsSAT2 were also identified and characterized via IP-MS. The results showed that a hairy root transformation system in soybean was established successfully using Agrobacterium rhizogenes K599，and soybean hairy root lines ectopically expressing LsAT2 were obtained. The contents of O-acetyl serine，cysteine and methionine in transgenic hairy root lines were significantly increased. The proteins interacting with LsSAT2，including catalytic proteins and various molecular binding proteins，were mainly located in the cytoplasmic protein complex and were involved in secondary metabolites and carbon metabolism，as well as in amino acid metabolism and glycolysis. These results provide valuable insight into the regulatory mechanisms of β -ODAP biosynthesis mediated by LsSAT2 and further improvement of L . sativus germplasm.

Key wordsLath yrus satious ;Hairy root of soybean;Serine acetyltransferase;Ectopic expression;Sulfur-containing amino acids;Dencichine

Received2024-11-29 Returned 2025-02-19

Foundation itemThe Natural Science Foundation of Shaanxi Province （No.2O23-JC-YB-152）; China Agriculture Research System-Food Legumes （No.CARS-08-Z21）;the Project of Henan Provincial Department of Education （No.25Bl80ol3）;the Science and Technology Innovation Project of Northwest Aamp;F University（No.202401360Bl）.

First authorTANG Yanni，female，master student. Research area： plant stress molecular biology. E-mail：15109614945@163.com

Corresponding authorWANG Lei， male， postdoctoral fellow. Research area： plant stress molecular biology. E-mail： wangl805@ nwpu. edu. cn

XU Quanle，male，Ph.D，associate professor.Research area：innovation and utilization of grass pea germplasm.E-mail：xuql03@163.com

（責任編輯：成敏Responsibleeditor：CHENGMin）