慢性疲勞綜合征不同年齡組人群腸道菌群特征分析

【關(guān)鍵詞】疲勞綜合征，慢性；年齡組；腸道菌群；不動桿菌屬；丹毒絲梭菌屬；16S rRNA 【中圖分類號】R746.9R378.2【文獻標(biāo)識碼】A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2024.0288

【Abstract】Background Chronic fatigue syndrome（CFS）is a chronicdebilitating disease of unknown etiology associated with intestinal microecologicaldysregulationanddisturbancesinbacterialmetabolism，andtherearesignificant diferences inthecompositionoftheintestinalfloraand intestinalpermeabilitybetweenpatientswith CFSandhealthy populations，buttheharacteristicsoftheintestinalflorasuggestiveofCFSpoulationsofdirentageshaverarelyeenreorted. ObjectiveToexplorethecharacteristicsofintestialfloraofCFSpatientsindiferentagegroups，andtoprovidesientiicbasis forriskpreventionandcontrolofCFSindiferentagestages.MethodsCSpatientsfromoutpatientclinicsofSichuanIntegrative MedicineHospitalbetweenFebruary2021andOctober2O21wereselectedasthestudysubjects，anddividedintothrgroups： 20cases intheyoung group（18-34yearsold），20casesin themidde-aged group（35-55yearsold），and2Ocases inthe old-agedgroup（56-Oyearsold）.Basicinformationofthecases wascolected，stoolspecimens werecolected，andSrRNA high-throughputsequencingwasusedtodetecttheintestinalflora，andbioinformaticsandstatisticalanalysiswereperfored. ResultsDiffrencesinspeciescompositionandrelativeabundance wereobservedinCFSpatientsofdiferentages，withhigherPielou_eindexofintestinalfloraintheold-aged group，withstatisticallsignifiantdiferencescomparedtothemiddle-aged group （ Plt;0.05 ），and significant separation of the aggregated flora in the middle-aged group from the other two groups （ Plt;0.01 ）. Coprococcus，Megamonas，Dialister，and Acinetobacter were thecore floraof the young group，and Ruminococus was thecore flora of the old group.Therelative abundanceof Pseudomonadales，Moraxellaceae，and Acinetobacter in the young group was higher than the middle-aged and old-aged groups （ Plt;0.05 ）.The relative abundance of Erysipelatoclostridium and Sellimonas in the middle-aged group was higher than the young and old-aged groups （ Plt;0.05 ）.The relative abundance of Eggerthellaceae and Bilophila in the old-aged group was higher than the young and the middle-aged group （ Plt;0.05 ）.Conclusion There are dierencesintediversityandcompositionoftheintestinalfloraofCSpatientsindiferentagegroups，anditasiitiallfound thatAcinetobacterandErysipelatoclostrdiumcanbeusedastekeyflora todiferetiatetheintestialforaofold-aged，middle aged and young CFS patients.

【Key Words】Fatigue syndrome，chronic；Age groups； Intestinalflora；Acinetobacter；Erysipelatoclostridium；16SrRNA

腸道微生物群對維系人體健康具有重要的作用。研究表明，腸道微生態(tài)失衡與癌癥［2]、消化系統(tǒng)［3]免疫［4]、精神[5]等疾病有著密切的關(guān)系。慢性疲勞綜合征（chronic fatiguesyndrome，CFS）是一種病因不明的慢性衰弱性疾病，常見癥狀有睡眠不足、認知障礙、直立不耐受和疼痛等。這些癥狀在較長一段時間內(nèi)持續(xù)或反復(fù)出現(xiàn)，并導(dǎo)致機體功能水平顯著降低[6]。胃腸道感染或者炎癥性腸病患者，其發(fā)生CFS的風(fēng)險明顯增加［7-8］。健康人群和CFS 患者之間的腸道菌群組成和腸道通透性存在顯著差異，CFS與腸道微生態(tài)失調(diào)和獨特的細菌代謝紊亂相關(guān)[9]。隨著年齡增長，尤其伴隨飲食變化，腸道菌群本身也會發(fā)生相應(yīng)改變，不同年齡段腸道菌群多樣性會增加[10]，在自閉癥[1]、重度抑郁癥[12]和非酒精性脂肪性肝病[13]等疾病中已證實，不同年齡段的人發(fā)生同樣疾病時其腸道菌群組成可能會因為年齡不同而出現(xiàn)差異。CFS發(fā)病群體廣泛，在兒童、青少年、中年及老年各年齡階段均可能患病[14-16]，且不同年齡段出現(xiàn)了不同的疾病表型[17-18]，但不同年齡段CFS患者的腸道菌群是否具有差異特征，目前鮮見報道，本研究旨在探索不同年齡段CFS患者腸道菌群的特征，為不同年齡段CFS風(fēng)險防控提供科學(xué)依據(jù)。

1對象與方法

1.1 研究對象

由3位主治醫(yī)師共同對2021年2—10月四川省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院的CFS病例進行篩查，根據(jù)患者年齡將其分為3組：青年組（18～34歲）、中年組（35～55歲）和老年組（56～80歲）［19-20]。在符合CFS診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者中，隨機從各年齡組中選擇20例，共選取60例CFS患者作為研究對象，并對其進行回顧性分析。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合CFS診斷標(biāo)準(zhǔn)[21]；（2）年齡18～80歲，男女不限；（3）無嚴(yán)重認知障礙，可正確理解量表內(nèi)容；（4）自愿參加本試驗，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）本身可引起慢性疲勞的原發(fā)病;（2）被診斷為情緒失調(diào)及各類精神障礙；（3）合并嚴(yán)重的肝腎損害者；（4）女性妊娠試驗陽性，或哺乳期女性，或有妊娠計劃者；（5）近1個月內(nèi)使用過引起疲勞癥狀的藥物（包括阿莫西林膠囊、羅紅霉素片等）；（6）近1個月內(nèi)使用過抗疲勞的藥物；（7）近1個月內(nèi)參與過任何其他臨床試驗的受試者；（8）不能或不愿意配合定期隨訪、執(zhí)行干預(yù)計劃者；（9）研究者認為不宜納入本研究的受試者。本研究已通過四川省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批件號：2019KY-011）。

1.2 研究方法

1.2.1疲勞自評量表（Fatigue Self-Assessment Scale，F(xiàn)SAS）：以FSAS評分作為判定疲勞類型、程度及特征的工具，評定CFS疲勞類型及程度（包括總體疲勞、軀體疲勞、精神疲勞及疲勞后果4個因子）和特征（包括疲勞對睡眠/休息的反應(yīng)、疲勞的情境性2個因子）22]各項疲旁因子標(biāo)準(zhǔn)分值范圍均為0～100分，分值越高，軀體疲勞、精神疲勞越明顯，疲勞后果越嚴(yán)重，總體疲旁越明顯，睡眠／休息不能緩解疲勞的特征和疲勞的情境性特征越明顯。

1.2.2糞便樣本采集及DNA提取：由醫(yī)生指導(dǎo)受試者使用專用糞便無菌采集管采集新鮮糞便（約 5g ），將采集到的患者糞便置于 -80°C 冰箱保存。使用QIAGEN強力糞便DNA提取試劑盒（PowerFecal RNAIsolationkit）提取患者糞便樣本中微生物總DNA。使用瓊脂糖凝膠電泳法檢測各糞便樣本DNA的完整度。

1.2.3文庫構(gòu)建及高通量測序：對糞便樣本16SrRNA基因V4特異性基因片段進行擴增[23]，使用引物F515： 5^′ -ACTCCTACGGGAGGCAGCA- ?3^′ ；R806：5^′. -GGACTACHVGGGTWTCTAAT- ?3^′ ，引物序列 5^′ 端加MiSeq平臺測序接頭，進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）擴增。擴增完成后，使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收擴增產(chǎn)物；使用Illumina的 TruSeqDNAPCR-FreeLibraryPreparationKit進行文 庫構(gòu)建；使用Qubit@ 2.O Fluorometer 和 Agilent Bioanalyzer2100system對構(gòu)建好的文庫進行質(zhì)量檢測；最后，在NovaSeq6OOO 平臺上完成測序。將IlluminaNovaSeq 測序得到的所有reads的原始數(shù)據(jù)拼接起來，對數(shù)據(jù)進行嵌合體過濾等降噪處理并過濾掉豐度 lt;5 的序列，對數(shù)據(jù)進一步質(zhì)量控制，從而得到后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)。

1.2.4生物信息學(xué)分析：運用Qiime2分析平臺[24]對IlluminaNovaSeq測得的有效數(shù)據(jù)進行分析，首先，使用DADA2軟件[25]過濾掉低質(zhì)量（ 被認為是有顯著性差異的微生物。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用 GraphPad 8.0 軟件繪制統(tǒng)計圖，使用R軟件（4.2版本）中的“boxplot”“barplot”和“ggplot2”等軟件包繪制圖形[26]。采用 SPSS 26.0軟件，對計量資料進行正態(tài)和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD- 檢驗；對于不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，以 M （ P₂₅ ！ P₇₅ ）表示，兩組間和多組間比較分別采用Mann-Whitney U 檢驗和Kruskal-Wallis H 檢驗，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗；計數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用 χ² 檢驗。以 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1一般資料

60例CFS患者中，男16例、女44例，平均年齡（ 44.5±19.0 ）歲。3組患者性別及總體疲勞、軀體疲勞、精神疲勞、疲勞后果、疲勞對睡眠/休息的反應(yīng)、疲勞的情境性評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ Pgt;0.05 ）；3組患者年齡比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ Plt;0.05 ），見表1。

2.2腸道菌群分析

2.2.1物種多樣性分析： α 多樣性是指生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)或某種特定環(huán)境下的物種多樣性。3組患者均勻度Pielou_e指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ Plt;0.05 ）；3組患者Shannon指數(shù)、Observed_ASVs指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ Pgt;0.05 ）；其中老年組患者Pielou_e指數(shù)高于中年組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ Plt;0.05 ），見表2。

β 多樣性代表不同環(huán)境群落間的綜合多樣性（即物種差異性）。PCoA1和PCoA2分別占整體分析數(shù)據(jù)的 12.63% 和 9.61% ，3組患者聚集菌群結(jié)構(gòu)有明顯區(qū)分，表明3組間物種組成差異較大，中年組聚集的菌群與另外兩組存在差異（ Plt;0.01 ），見圖1。樣本主成分及組成結(jié)構(gòu)的Bray-Curtis距離分析（圖2）結(jié)果顯示，3組患者聚集菌群存在差異（ R²=0.071 ， P=0.001 ）。

2.2.2腸道菌群ASVs的分布：對3組患者腸道菌群ASVs進行分析，其中，青年組有1226個ASVs，中年組有1820個ASVs，老年組有1052個ASVs，3組之間共有384個ASVs。青年組和中年組間共有485個ASVs，青年組和老年組之間共有470個ASVs，中年組和老年組之間共有476個ASVs（圖2A）。核心菌群一般是指在大多數(shù)（ ?50% ）受調(diào)查個體樣本中存在的微生物類群，篩選出3組的核心菌群，發(fā)現(xiàn)青年組有4個核心菌屬，分別為糞球菌屬（Coprococcus）、巨單胞菌屬（Megamonas）、戴阿利斯特桿菌屬（Dialister）、不動桿菌屬（Acinetobacter），老年組則有1個核心菌屬，為瘤胃球菌屬（Ruminococcus）（圖2B）。

表13組CFS患者一般資料比較Table1Comparison of general data of CFS patients in 3 groups

注：“為 χ² 值，為 H 值，余檢驗統(tǒng)計量值為 F 值；‘表示與青年組比較 Plt;0.05 ，‘表示與中年組比較 Plt;0.05 。

表2CFS患者腸道菌群的 α 多樣性分析［M（ P₂₅ ， P₇₅ ）] Table2Analysis of alpha diversity of intestinal flora in CFS patients

注：“表示與中年組比較 Plt;0.05 。

圖1不同年齡段CFS患者腸道菌群的β多樣性分析 Figure1Beta diversity analysis of intestinal flora in CFS patients of different age groups

圖2不同年齡段CFS患者腸道菌群的ASVs分布Figure2Distribution of ASVsin the intestinal flora of CFSpatients ofdifferent ages

注：A為3組慢性疲勞綜合征（CFS）患者共有或獨有擴增子序列變異（ASVs），B為3組CFS患者腸道核心菌群。

2.2.3腸道菌群群落組成分析：CFS患者中，相對豐度較高的前10個門分別是厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、廣古菌門（Euryarchaeota）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）（圖3A）。各年齡組優(yōu)勢門類均為厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、擬桿菌門。綠彎菌門和芽單胞菌門在老年組中未發(fā)現(xiàn)，而在青年組和中年組中均有發(fā)現(xiàn)。青年組疣微菌門相對豐度高于中年組和老年組；老年組厚壁菌門相對豐度高于中年組，擬桿菌門相對豐度高于青年組，酸桿菌門相對豐度顯著低于中年組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（ Plt;0.05 ）（圖3B）。另外，3組厚壁菌門/擬桿菌門（Firmicutes/Bacteroidetes，F(xiàn)/B）比值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ Pgt;0.05 ）（圖3C）。

2.2.4差異菌群分析：對不同年齡段CFS患者腸道菌群進行LEfSe分析，LDA圖（圖4A）、菌群的 P 值和LDA值（圖4B）和進化圖（圖4C）如下所示，當(dāng)滿足 Plt;0.05 且lg Ω[LDA]?2 時被認為是標(biāo)志物種，青年組假單胞菌目（Pseudomonadales）、莫拉菌科（Moraxellaceae）、不動桿菌屬的相對豐度較高，與中年組和老年組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ Plt;0.05 ）。中年組丹毒絲梭菌屬（Erysipelatoclostridium）、Sellimonas屬的相對豐度較高，與青年組和老年組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ Plt;0.05 ），老年組埃格特菌科（Eggerthellaceae）、嗜膽菌屬（Bilophila）相對豐度較高，與青年組和中年組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ Plt;0.05 ）。

進一步用randomforest模型分析3組之間的關(guān)鍵差異菌群（圖5），值越大說明物種的重要性越強。重要性高的物種依次為不動桿菌屬、丹毒絲梭菌屬、魏斯菌屬（Weissella）、霍爾德曼菌屬（Holdemanella）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、伯克霍爾德菌科下的未識別屬、瘤胃球菌（Ruminococcaceae）、巨單胞菌屬、阿克曼菌（Akkermansia）、糞球菌屬、Sellimonas屬、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）下的未識別屬、阿德勒克羅伊茨菌（Adlercreutzia）、巨球形菌屬（Megasphaera）、厭氧繩菌科（Anaerolineaceae）下的未識別屬、羅斯菌屬（Rothia）史雷克菌屬（Slackia）、片球菌屬（Pediococcus）巴恩斯菌屬（Barnesiella）、普雷沃菌屬（Prevotella）、Aminicenantales目下的未識別屬、嗜血桿菌屬（Haemophilus）、亞硝化球菌科（Nitrososphaeraceae）下的未識別屬、柯林斯菌（Collinsella）、屎豆屬菌（Faecalitalea）、酸桿菌目（Acidobacteriales）下的未識別屬、真桿菌屬（Eubacterium）、硫單胞菌屬（Sulfurimonas）和摩根菌屬（Mogibacterium）。不動桿菌屬和丹毒絲梭菌屬可作為區(qū)別老年、中年及青年CFS患者腸道菌群的關(guān)鍵菌群。

注：“表示 Plt;0.05 ，表示 Plt;0.01 ；A表示3組CFS 患者門水平上腸道菌群物種組成，Others表示除這10個門以外其他所有門相對豐度之和，B表示3組CFS患者腸道菌群相對豐度前10的門類，C表示3組CFS患者的厚壁菌門/擬桿菌門（Firmicutes/Bacteroidetes，F(xiàn)/B）比值。

圖3不同年齡段CFS患者門水平上腸道菌群物種組成圖

igure3Species composition of the intestinal floraatthe portallevel inCFS patientsof diffrent ages ma

3討論

CFS 發(fā)病率和患病率逐年上升「27]，對健康相關(guān)生活質(zhì)量［28]和經(jīng)濟［29]具有深遠的負面影響，腸道微生態(tài)失衡和代謝產(chǎn)物的異常會導(dǎo)致腸功能紊亂，還會導(dǎo)致腸黏膜的通透性增強，從而損害屏障功能，推動CFS的發(fā)生和發(fā)展。

3.1CFS不同年齡群體腸道菌群差異性

本研究基于16SrRNA高通量測序技術(shù)研究不同年齡段CFS患者的腸道菌群組成結(jié)構(gòu)及多樣性。結(jié)果表明，不動桿菌屬和丹毒絲梭菌屬可作為區(qū)別青年、中年及老年CFS患者腸道菌群的關(guān)鍵菌群。同時，青年組有4個核心菌屬，分別為糞球菌屬、巨單胞菌屬、戴阿利斯特桿菌屬、不動桿菌屬，瘤胃球菌屬為老年組核心菌屬。巨單胞菌屬屬于厚壁菌門，在肥胖人群中豐度顯著增加[30]，在 19.2% 的早期結(jié)腸癌患者中數(shù)量也非常豐富「31]。本研究結(jié)果表明，各年齡段分別存在不同的核心菌屬，可能在不同年齡段CFS疾病的發(fā)生、發(fā)展中起作用。另外，老年組的厚壁菌門和擬桿菌門相對豐度高于另外兩組，F(xiàn)/B比值相較于青年組下降，F(xiàn)/B比值的下降被認為是腸道生態(tài)失調(diào)，常見于炎癥性腸病[32]，表明CFS老年人群相較于青年人群更易出現(xiàn)腸道生態(tài)失調(diào)。

圖4不同年齡段CFS患者腸道菌群的LEfSe分析Figure 4 LEfSe analysis of intestinal flora in CFS patientsof different ages

注：A表示3組差異菌群LDA圖（ log[LDA]?2.0 ）；B表示3組差異菌群氣泡圖，不同氣泡顏色代表不同分組，氣泡大小代表 P 值C表示3組差異菌群進化圖，從內(nèi)部到外部呈圓形，表示從門到屬（或種）的分類學(xué)等級。

LEfSe分析展示了不同年齡群體的差異菌群。青年組假單胞菌目、莫拉菌科、不動桿菌屬、伯克霍爾德菌科下的未識別菌屬相對豐度顯著高于中年組和老年組，青年組的這些標(biāo)志物種均屬于變形菌門，其中不動桿菌屬是青年組的獨特核心菌屬。不動桿菌屬是當(dāng)前醫(yī)院感染中最主要的機會致病菌，以醋酸鈣鮑曼不動桿菌復(fù)合體為代表的病原菌能在院內(nèi)長時間生存，并通過與患者的接觸、診療器械的共享等途徑進行傳播，造成部分患者的感染，甚至是死亡[33］。老年組中埃格特菌科和嗜膽菌屬的相對豐度顯著高于另外兩組。嗜膽菌屬與結(jié)直腸癌相關(guān)[34]，埃格特菌科屬于放線菌門，與新型冠狀病毒感染（COVID-19）輕度疾病相比，在COVID-19重度疾病中顯示出更高豐度［35］。不動桿菌屬作為青年組獨特核心菌屬，也是引起青年人群患CFS的優(yōu)勢菌屬，老年CFS患者則應(yīng)關(guān)注埃格特菌科和嗜膽菌屬。

3.2關(guān)注CFS中年人群

既往研究表明，中年人群具有更高的CFS發(fā)病風(fēng)險[36]， ∝ 和 β 多樣性分析顯示，中年組腸道豐富度和均勻性顯著低于老年組（ Plt;0.05 ），且中年組聚集菌群與另外兩組存在顯著差異（ Plt;0.05 ）。LEfSe分析顯示，

中年組丹毒絲梭菌屬和Sellimonas屬相對豐度顯著高于青年組和老年組。有研究表明，潰瘍性結(jié)腸炎合并抑郁/焦慮患者的 Sellimonas 屬相對豐度較高［37]，丹毒絲梭菌屬則與結(jié)腸疾病相關(guān)，是一種潛在的病原體「38]，且丹毒絲梭菌屬還可作為區(qū)別青年、中年及老年CFS患者腸道菌群的關(guān)鍵菌群。

3.3局限性與改進之處

本研究的門診患者均來自西南地區(qū)，且對患者使用藥物情況及疾病等影響腸道菌群的因素進行了排除篩選，但對患者的飲食習(xí)慣并未進行嚴(yán)格的分析。同時，腸道菌群在不同個體之間存在比較大的差異，同一個體的不同年齡段腸道菌群也會有所不同，本研究未能避免由于飲食結(jié)構(gòu)等因素造成的不同個體之間的腸道菌群差異。在未來的研究中應(yīng)制訂更嚴(yán)格的納入及排除篩選流程，尤其是對腸道菌群有影響的因素，包括飲食習(xí)慣等。除此之外，本研究內(nèi)容主要圍繞CFS患者的腸道菌群方面，為了更加明確從菌群變化到CFS患者之間的因果性，可以收集同一患者治療前后的樣本，對比治療前后CFS患者的菌群變化差異，由于同一患者的菌群在一定時間內(nèi)具有穩(wěn)定性，可更加明確了解腸道菌群與CFS之間的關(guān)聯(lián)。此外，可以利用動物模型及糞菌移植技術(shù)等方法，更直觀地驗證腸道菌群的影響。

綜上所述，通過比較不同年齡段CFS患者的腸道菌群，本研究發(fā)現(xiàn)不同年齡段CFS患者的疾病表現(xiàn)和腸道菌群存在差異，影響不同年齡段人群患有CFS的腸道菌群不同，不動桿菌屬和丹毒絲梭菌屬可作為區(qū)別老年、中年及青年CFS患者腸道菌群的關(guān)鍵菌群，有待進一步驗證。

作者貢獻：徐乙莎負責(zé)文章構(gòu)思，數(shù)據(jù)結(jié)果分析處理，文章撰寫；李春梅負責(zé)樣本采集；王城城負責(zé)調(diào)查對象選取；郭維負責(zé)數(shù)據(jù)處理；甘雨濃負責(zé)統(tǒng)計學(xué)分析；張宇負責(zé)樣本保存及處理；張文負責(zé)DNA提取；余蔥蔥負責(zé)文章的質(zhì)量控制及監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

徐乙莎D https：//orcid.org/0009-0002-0722-4528

余蔥蔥D https：//orcid.org/0009-0002-3261-8764

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