黃精丸的配伍提取液對學習記憶障礙大鼠海馬齒狀回區干細胞影響的研究

【摘要】背景阿爾茨海默病（AD）是一類以學習記憶障礙為主的神經退行性疾病，給家庭和社會造成了沉重負擔。中醫藥在防治AD方面具有重要潛力，當前應積極從中醫藥寶庫中挖掘有效治療方藥。目的探討古代名方黃精丸的配伍提取液（CHP）對D-半乳糖聯合東茛蓉堿所致學習記憶障礙大鼠海馬齒狀回（DG）區干細胞增殖的影響。方法2023年1—12月選取90只雄性SD大鼠，隨機分成正常對照組、AD模型組、多奈哌齊組、黃精丸配伍低、中、高劑量組，每組15只。制備CHP，通過皮下注射 1% D-半乳糖液 + 東茛蓉堿制備AD大鼠模型，多奈哌齊組給予0.5mg?kg^-1?d^-1 多奈哌齊灌胃，黃精丸配伍低、中、高劑量組分別給予1、3、 劑量的黃精丸配伍提取液灌胃，共干預8周。通過跳臺實驗檢測學習、記憶能力。取材后采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）檢測大鼠海馬細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、巢蛋白（Nestin）mRNA表達水平，采用免疫印跡法（Western blot）檢測大鼠CyclinD1、Nestin蛋白表達水平。通過5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）免疫組化、免疫熒光檢測免疫陽性細胞數量。結果跳臺實驗結果顯示AD模型組較正常對照組大鼠反應時間延長，跳臺學習成績與跳臺記憶成績的錯誤次數增多，潛伏時間縮短；多奈哌齊組及CHP各劑量組較AD模型組大鼠跳臺學習成績的反應時間及錯誤次數、跳臺記憶成績的錯誤次數均減少，潛伏時間增加（ Plt;0.05 ）。RT-qPCR結果顯示AD模型組較正常對照組的大鼠海馬CyclinD1、Nestin mRNA表達水平降低，多奈哌齊組及CHP 各劑量組較AD模型組大鼠海馬CyclinD1、Nestin mRNA表達水平均升高，CHP高劑量組CyclinD1、NestinmRNA表達水平高于正常對照組（ Plt;0.05 ）。Westernblot結果顯示AD模型組較正常對照組的大鼠海馬CyclinD1、Nestin蛋白表達水平降低，多奈哌齊組及CHP各劑量組較AD 模型組的大鼠海馬CyclinD1、Nestin蛋白表達水平均升高，CHP高劑量組CyclinD1、Nestin蛋白表達水平高于正常對照組（ Plt;0.05 ）。BrdU 免疫組化、免疫熒光結果顯示AD模型組較正常對照組的大鼠海馬DG區陽性細胞數量均明顯減少；多奈哌齊組及CHP各劑量組較AD模型組的大鼠海馬DG區陽性細胞數量均明顯增多，CHP中、高劑量組陽性細胞數量高于正常對照組（ Plt;0.05 ）。結論CHP可促進學習記憶障礙大鼠海馬神經干細胞增殖，促進海馬神經功能恢復進而改善AD認知障礙，具有臨床推廣價值。

【中圖分類號】R745.7R277.7【文獻標識碼】A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2024.0007

【Abstract】BackgroundAlzheimer's disease（AD）isatype of neurodegenerativedisorder primarilycharacterized bylearning and memory impairments，posingasignificantburden to familiesandsociety.Traditional Chinese Medicine（TCM） holdsconsiderablepotentialinpreventingandtreating AD，anditiscrucial toactivelyexploreefectivetherapeuticmethodsfromthetreasuryofTCM.ObjectiveThisstudyaimed toinvestigatetheeffectsof thecompatibilityextractofHuangjing pil （CHP）on theproliferationof stemcels inthe dentate gyrus（DG）regionofthe hippocampus inrats withlearning and memory impairments induced by D-galactosecombined with scopolamine.MethodsFromJanuary to December 2023，90 male SDrats were randomlydivided intoanormal control group，an AD model group，adonepezil group，and CHPlow，medium，and high dose groups， with 15 rats in each group. The donepezil group was given donepezil by gavage. The CHP low， medium，and high dose groups were given 1，3 and 9g?kg^-1?d^-1 doses of the combined extract of CHP by gavage respectively. The intervention lasted for 8 weeks.The AD rat model was prepared by subcutaneous injection of 1% D-galactose solution combined with scopolamine.The learning and memory capabilities were assessed through the step-down test.After sampling， theexpressionlevelsofhippocampalcellcycle proteinD1（CyclinD1）andnestinmRNA were measuredbyreal-timefluorescent quantitative polymerasechainreaction（RT-qPCR），and theexpresionlevelsofCyclinDlandnestinproteins weredetectedby Western blot.Thenumberofimmunopositivecels was determinedby5-bromo-2-deoxyuridine（BrdU）immunohistochemistry andimmunofluorescence.ResultsThe step-down testshowed thatthereactiontime was prolonged，thenumberof errors in step-downlearningand memoryscores increased，andthelatencytime significantlydecreased intheADmodelgroupcompared to the normalcontrol group.The donepezil groupand each dosage groupofCHP significantlyreducedthereactiontime and the numberof erors in step-down learningand memory scores，and significantlyincreasedthelatencytimecomparedto heAD model group （ Plt;0.05 ）. RT-qPCR results indicated that the expression levels of CyclinD1 and nestin mRNA in the hippocampus of the ADmodel groupweresignificantlylower thanthoseinthe normalcontrolgroup.Thedonepezil groupandeach dosagegroup of CHP showed increased expresion levelsofhippocampal CyclinD1and nestinmRNAcomparedto theADmodel group，with the high dosage group of CHP showing higher levels than the normal control group（ Plt;0.05 ）.Western blot results mirrored these findings，withsigificantincreassitheexpresionlevelsofCyclinDandnestinproteinsinthedonepezil groupandachdosage groupof CHPcompared tothe ADmodel group，especiallinthehighdosage groupof CHP，which were higherthanthose inthe normal control group （ Plt;0.05 ）.BrdU immunohistochemistry and immunofluorescence showed that the number of positive cels inthe hippocampal DGregion significantlydecreasedintheADmodelgroupcompared to thenormalcontrol group;however， itsignificantlyincreased inthedonepezil groupandeachdosage groupofCHP，withthemediumand highdosagegroupsof CHP having higher numbers than the normal control group （ Plt;0.05 ）.ConclusionCHP can promote the proliferation of neural stem cellsin the hippocampus ofratswithlearningandmemoryimpairments，facilitatingtherecoveryofhippocampalneuralfunctions andthereby improving cognitive impairments in AD，which highlights its value for clinical application.

【Key words】 Alzheimer disease；Memory disorders；Huangjing pill；Dentate gyrus；Neural stem cells

阿爾茨海默病（AD）是一種常見的老年癡呆，其本質為中樞神經系統退行性病變，臨床主要癥狀為學習記憶、認知活動等功能衰退與障礙。該病已嚴重危害廣大中、老年人的健康，給家庭和社會造成了沉重負擔[1]。目前，AD的病因及發病機制復雜，研究仍不透徹［2]，但研究人員已明確中樞神經膽堿功能障礙、炎癥反應、氧化應激等在AD的發生、發展中起著重要作用，可引起中樞神經元進行性變性、丟失，其中以負責管理機體學習記憶功能的海馬區病變尤為嚴重［3-4]。近年來有研究表明，成年哺乳類動物腦內海馬齒狀回（DG）區存在著具有多向分化潛能的神經干細胞（NSCs），NSCs在特定刺激下能不斷增殖產生新生神經元，可補充、替代已丟失的神經細胞，進而恢復海馬的調節功能，因此積極尋找有效藥物刺激內源性NSCs增殖對于AD防治具有重要意義［5-6]。中醫藥在全科醫學防治AD方面具有重要潛力，當前應積極從中醫藥寶庫中挖掘有效治療方藥。

古代名方黃精丸又名九轉黃精丸，出自清代《清內廷法制丸散膏丹各藥配本》，其配伍由黃精與當歸以1：1組成，有防癡抗衰、養生保健、美容駐顏等功用［7]前期研究發現該丸配伍可改善AD大鼠、小鼠學習記憶功能，能夠激活海馬Wnt信號通路發揮抗癡呆作用[8-10]。研究證實， Wnt 信號通路與AD密切相關，其激活可促進海馬NSCs增殖，對于恢復海馬功能具有重要作用[1-12]。故筆者推測該丸能刺激機體海馬 NSCs增殖發揮抗癡呆作用。本文觀察了黃精丸的配伍提取液（CHP）對學習記憶障礙大鼠海馬NSCs增殖的影響，以期深入闡述其抗AD的神經保護機制，為推廣黃精丸臨床應用提供實驗依據，并為全科醫學防治AD篩選有效中藥復方。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1 實驗時間：2023年1—12月。

1.1.2動物與分組：4月齡SPF級雄性SD大鼠90只，體質量（ 250±10 ） g ，購自江西中醫藥大學實驗動物科技中心，動物許可證號：SYXK（贛）2023-0001。大鼠適應性飼養1周后隨機分成正常對照組、AD模型組、多奈哌齊組、黃精丸配伍低、中、高劑量組，每組15只。

本研究動物實驗方案已獲得江西中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（編號：20190920158）。

1.1.3藥物與主要試劑：酒黃精飲片（江西江中中藥飲片公司，批號：221205），當歸飲片（甘肅安源藥業有限公司，批號：220504），鹽酸多奈哌齊（重慶植恩藥業有限公司，批號：20030010），東茛蓉堿（美國Sigma公司，批號：PL1096858），D-半乳糖（北京百靈威科技有限公司，批號：LT90O57），5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）（美國MedChenExpress公司，批號：97326），兔抗鼠BrdU抗體、細胞周期蛋白D1（CyclinD1）抗體、肌動蛋白（ β -actin）內參抗體及羊抗兔TRITC（英國Abcam公司，批號：GR3257721-3、GR415239-13、GR25827、GR3255327-2），辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（美國Proteintech公司，批號：O0085343），RNA 酶清除劑、即用型DAPI及FluoroshieldMouning（北京Solarbio公司，批號：5308032、20200715、20201218），二氨基聯苯胺顯色劑及免疫組化試劑盒（北京中杉金橋，批號：2020D0602、2231C0509），巢蛋白（Nestin）抗體、trizol試劑、去基因組DNA污染逆轉錄試劑盒及實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）試劑盒（美國Invitrogen公司，批號：31016A32、184608、10296028、15596026），化學發光試劑盒（美國Millipore公司，批號：1115702），蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒及SDS-PAGE凝膠（上海碧云天公司，批號：082118180821、071317171218、040717170810）。

1.1.4主要儀器：微小型中藥提取罐（上海順儀實驗設備公司，EX-TE-03型），旋轉蒸發儀（德國ChemTron公司，STRIKE300型），大鼠跳臺儀（江蘇賽昂斯公司，SA202型），多功能電泳儀（碧云天公司，EEP102型），熒光定量PCR儀（美國ABI公司，ABI7500型），熒光顯微鏡（德國Leica公司，DMI3000B型），圖像數據分析儀（德國Motic公司，MoticImageAdvanced3.2）。

1.2實驗方法

1.2.1實驗藥液制備：CHP提取液制備按中藥制藥標準提取方法進行[8-10]，簡言之，取酒黃精、當歸各 500g 粉碎，加10倍量的清水充分浸泡，沸水回流 ^1h ，濾過后收集提取液；向殘藥內再加3倍量清水并再次沸水回流 30min ，濾過后收集提取液；合并兩次提取液后進行旋轉蒸發濃縮至 1000mL ，使其每 1mL 相當于含生藥1g ，本配伍提取物收率為 17.53% 。鹽酸多奈哌齊片粉碎后，用雙蒸水配制成 5mg/mL 水溶液備用。

1.2.2AD模型建立與實驗藥物干預：按課題組AD造模方法建立AD大鼠模型[9，13]，即AD模型組及各實驗藥物組大鼠頸背處皮下注射 1% D-半乳糖液（50mg?kg^-1?d^-1 ），連續注射3周；第4周開始改用東茛蓉堿（ 2mg?kg^-1?d^-1 ）腹腔注射，連續注射2周以造成大鼠學習記憶障礙，模擬AD病變。AD造模開始1周后，同時參考文獻報道［14］給多奈哌齊組大鼠等效劑量多奈哌齊（ 0.5mg?kg^-1?d^-1 ）灌胃，治療8周，參考前期研究結果[8]以 1，3，9Φ_o?kg^-1?Φd^-1 劑量的CHP提取液分別給CHP低、中、高劑量組大鼠灌胃治療8周。同時給予AD模型組等量無菌 0.9% 氯化鈉溶液灌胃8周。正常對照組大鼠僅日常飼養。灌胃進行至第6周開始，每組隨機選取8只大鼠再增加腹腔注射BrdU標記處理（ 50mg?kg^-1?d^-1 ），連續 14d^[15]

1.2.3跳臺檢測：灌胃結束后進行大鼠跳臺實驗，跳臺儀由8個回避反射暗室組成，每室中央有一圓形絕緣平臺，室底面鋪有可通電銅柵，實驗時先將大鼠置于底面適應 3min ，再接電，動物正確反應是跳上絕緣平臺，多數大鼠有可能再次或多次跳下平臺而受電擊又會迅速跳回平臺；照此訓練大鼠 5min ，并分別記錄大鼠受到電擊的反應時間及錯誤次數作為其學習成績；1d后檢測各大鼠的記憶保持能力，先將大鼠置于平臺，記錄其第1次跳離平臺的潛伏時間及 5min 內反復跳下平臺的錯誤次數以檢測其記憶成績，若 5min 內動物不離平臺，則潛伏期記作 300s 。

1.2.4取材：跳臺實驗后次日，每組未BrdU標記處理的7只大鼠快速脫頸處死，取出大腦海馬，漂洗后勻漿于液氮凍存待檢；每組已BrdU標記處理的8只大鼠于麻醉后作灌注固定、取腦、再固定、制作切片用于形態學檢測。

1.2.5RT-qPCR檢測：參照trizol試劑說明書，提取各大鼠海馬組織勻漿的總RNA，配制RT反應液后進行RT-qPCR檢 測CyclinD1、Nestin的mRNA水平，以 Folds 表示實驗組和對照組目的基因表達的倍比關系，其中 ^ΔΔCt= （Ct目的基因-CtGAPDH）實驗組－（Ct 目的基因-Ct GAPDH）對照組[9-10]。各待測引物序列由Invitrogen公司設計合成，CyclinD1上游引物 5^′ -AACTACCTGGACCGCTTCCT- ?3^′ ，下游引物5^′ -CCACTTGAGCTTGTTCACCA- ?3^′ ，產物長度 171bp Nestin上游引物 5^′. -GGAGCAGGAGAAGCAAGG- ?3^′ ，下游引物 5^′ -GGTCCAGAAAGCCAAGAG- ?3^′ ，產物長度185bp； β -actin上游引物 5^′. -CTGGCACCCAGCACAATG- ?3^′ ，下游引物 5^′ -CCGATCCACACGGAGTACTTG- -3^′ ，產物長度 156bp 。

1.2.6免疫印跡法（Westernblot）檢測：提取各動物海馬勻漿的總蛋白，并以BCA法測算蛋白含量；取適量蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后轉到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜， 5% 脫脂奶粉室溫封閉 ^1h ，分別加CyclinD1（ 1：1 000 ）、Nestin（ ?_{1：1 000} ）、 β -actin一抗 （ 1：1 000 ）， 4^°C 孵育過夜，二抗（ 1：5000 ）室溫 ^1h 暗室條件下用發光液顯影、曝光成像，并用發光儀分析結果、采集圖像，以 β -actin為內參對照，分析目的條帶灰度比值。

1.2.7BrdU免疫組化：按試劑盒推薦的SP法進行操作，BrdU以 1：500 稀釋。顯色成功后，運用Motic軟件，隨機取鏡下放大400倍的相鄰3個視野、計數海馬DG區陽性神經元數量。

1.2.8BrdU免疫熒光：切片經PBS漂洗后滴加山羊血清封閉，滴加兔抗大鼠BrdU（ 1：500 ）抗體，再滴加山羊抗兔TRITC二抗，經DAPI復染，漂洗、封片，熒光顯微鏡下觀察并計數海馬DG區陽性細胞。

1.3 統計學方法

采用SPSS25.0統計學軟件分析處理數據，符合正態分布的計量資料以（ ）表示，多組間比較選用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1 CHP對大鼠學習、記憶的影響

6組大鼠跳臺學習成績的反應時間及錯誤次數、跳臺記憶成績的潛伏時間及錯誤次數比較，差異均有統計學意義（ Plt;0.05 ）。其中AD模型組較正常對照組大鼠反應時間延長，跳臺學習成績與跳臺記憶成績的錯誤次數增多，潛伏時間明顯縮短；多奈哌齊組及CHP各劑量組較AD模型組大鼠跳臺學習成績的反應時間及錯誤次數、跳臺記憶成績的錯誤次數均明顯減少，跳臺記憶成績潛伏時間明顯增加，差異有統計學意義（ Plt;0.05 ），見表1。

2.2CHP對大鼠海馬CyclinD1、NestinmRNA表達水平的影響

5組大鼠海馬CyclinD1、Nestin的mRNA表達水平比較，差異有統計學意義（ Plt;0.05 ）。其中AD模型組較正常對照組的大鼠海馬CyclinD1、NestinmRNA表達水平明顯降低，多奈哌齊組及CHP各劑量組較AD模型組大鼠海馬CyclinD1、NestinmRNA表達水平均升高，CHP高劑量組CyclinD1、NestinmRNA表達水平高于正常對照組，差異均有統計學意義（ Plt;0.05 ），見表2。

2.3CHP對大鼠海馬神經CyclinD1、Nestin蛋白表達水平的影響

6組大鼠海馬CyclinD1、Nestin的蛋白表達水平比較，差異有統計學意義（ Plt;0.05 ）。其中AD模型組較正常對照組的大鼠海馬CyclinD1、Nestin蛋白表達水平顯著降低，多奈哌齊組及CHP各劑量組較AD模型組的大鼠海馬CyclinD1、Nestin蛋白表達水平均升高，CHP高劑量組CyclinD1、Nestin蛋白表達水平高于正常對照組，差異均有統計學意義（ Plt;0.05 ），見表3、圖1。

2.4CHP對大鼠海馬DG區BrdU免疫陽性細胞數量 的影響

6組大鼠海馬DG區BrdU免疫陽性細胞數量比較，差異有統計學意義（ Plt;0.05 ）。其中AD模型組較正常對照組的大鼠海馬DG區BrdU免疫組化及免疫熒光陽性細胞數量均明顯減少；多奈哌齊組及CHP各劑量組較AD模型組的大鼠海馬DG區BrdU免疫組化及免疫熒光陽性細胞數量均明顯增多，CHP中、高劑量組BrdU免疫組化及免疫熒光陽性細胞數量高于正常對照組，差異均有統計學意義（ Plt;0.05 ），見表4、圖2～3。

3討論

AD等神經退行性疾病普遍存在中樞神經元變性、丟失現象，如何補充、替代這些缺少的神經元已成為防治此類疾病的關鍵措施之一。曾經利用NSCs移植以重建宿主神經元網絡系統、改善其神經功能缺陷方法被認為是一種有治療AD應用前景的手段，但同時也存在

表16組大鼠跳臺學習成績與跳臺記憶成績結果（ ）

Table1 Results of learning performance and memory performance of 6 groups of rats

注： AD= 阿爾茨海默病， CHP= 黃精丸的配伍提取液；“表示與正常對照組比較 Plt;0.05 ，表示與AD模型組比較 Plt;0.05 。

圖16組大鼠海馬神經CyclinD1、Nestin蛋白 Westernblot 蛋白條帶圖Figure1Western blot analysis of protein bands of hippocampal nerveCyclinD1 and Nestin in 6 groups

注：CyclinD 1= 細胞周期蛋白D1，Nestin=巢蛋白， β -actin=肌動蛋白；A～F分別為正常對照組、AD模型組、多奈哌齊組、CHP低劑量組、CHP中劑量組、CHP高劑量組。

表26組大鼠海馬神經CyclinD1、NestinmRNA表達水平（ ） Table2Expressionlevels of CyclinD1 and Nestin mRNA in hippocampus of rats in 6 groups

注： CyclinDl= 細胞周期蛋白D1，Nestin=巢蛋白；“表示與正常對照組比較 Plt;0.05 ，表示與AD模型組比較 Plt;0.05_lt;

表36組大鼠海馬神經CyclinD1、Nestin蛋白表達水平（ ）Table3The expression levels of CyclinD1 and Nestin in hippocampalnerve of rats in 6 groups

注：“表示與正常對照組比較 Plt;0.05 ，表示與AD模型組比較Plt;0.05 （204

一些突出的問題，如非患者特異性神經前體/NSCs移植可能會導致免疫排斥反應，逆轉錄病毒整合、重組的NSCs移植會有致腫瘤的風險，胚胎干細胞來源的NSCs移植還面臨巨大的倫理學挑戰，各種NSCs移植的臨床應用效果遠低于實驗效果等[16]。因此，尋找有效藥物刺激自體海馬NSCs增殖、補充神經元數量已成為治療AD 的新策略［5-6]。當前醫學界需積極展開相關體內實驗研究以便尋找防治AD的有效藥物，選擇合適的動物模型是獲得理想結果的前提。D-半乳糖可致動物腦內出現自由基、炎癥反應、氧化應激而產生亞急性衰老[17]，東茛蓉堿為M膽堿受體阻斷劑，能引起機體膽堿系統功能障礙，故采用D-半乳糖聯合東茛蓉堿造模法可較好地制備復合AD動物模型，較其他單因素造模法更貼近臨床AD復雜的病理變化過程，且本法造模動物具有存活率高、費用低等優勢，是AD研究中較早應用的動物模型之—[18-19]。故本實驗采用該造模法致大鼠學習記憶障礙模擬AD病變，以探究CHP的神經保護可能機制。

表4CHP對大鼠海馬DG區BrdU免疫陽性細胞數量的影響（ ） Table4Effect of CHP on the number of BrdU immunopositive neurons in the DG region of rat's hippocampus

注：‘表示與正常對照組比較 Plt;0.05 ，表示與AD模型組比較Plt;0.05

CyclinD1是細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）重要的調控因子，為啟動細胞分裂周期由G0進人G1期的關鍵分子，故其表達水平升高能反映細胞增殖水平升高[10]。Nestin也稱神經上皮干細胞蛋白，是一種中間絲類型蛋白，常作為中樞神經前體細胞/NSCs的特征性標記物，其表達水平高低可反映NSCs增殖水平的高低［20]。本研究發現正常對照組大鼠大腦海馬神經CyclinD1及Nestin的mRNA與蛋白均有一定量表達，采用可摻入細胞增殖S期內DNA鏈的BrdU活體標記，經免疫組化及免疫熒光檢測均發現該組大鼠海馬DG區有BrdU陽性細胞，表明成年大鼠腦內有NSCs增殖，與已報道的成年個體腦內存在一定量NSCs增殖、神經發生相符合[21]；AD模型組大鼠海馬神經CyclinD1及Nestin的mRNA與蛋白表達水平均下降、海馬DG區BrdU陽性細胞數量明顯減少，亦符合AD動物腦內NSCs 增殖能力顯著衰弱的報道[6]；AD大鼠經CHP治療后，其mRNA與蛋白表達水平均升高，海馬DG區BrdU陽性細胞數量明顯增多。同時AD大鼠經各劑量CHP治療后學習記憶功能有顯著改善，仍達不到正常大鼠的功能狀態，但高劑量組大鼠海馬CyclinD1及Nestin的mRNA與蛋白表達水平、BrdU陽性細胞數量明顯高于正常大鼠，提示黃精丸促進海馬NSCs增殖作用具有優勢。前期研究發現CHP能顯著激活AD動物海馬神經 Wnt/β -catenin信號通路[8-10]，故該配伍可能是通過激活此信號通路促進海馬NSCs增殖以發揮防治AD作用，確切機制有待進一步探討。此外，本實驗參照的多奈哌齊為抗AD藥物研發中公認的陽性對照藥，本結果亦得出該藥可刺激海馬NSCs增殖作用，這與龍清華等［22]結果相符。但多奈哌齊促進海馬NSCs增殖的效果要遜于CHP，這可能與多奈哌齊治療AD的優勢在于提高中樞神經乙酰膽堿含量有關。

中醫認為AD的核心病機為患者腎精虧虛和血瘀絡滯，最終導致髓海空虛、神機失用，治療上主要采取補腎填精、活血通絡法以生髓養腦、充盈髓海的根本措施[23］。已有一些中藥復方促進NSCs增殖的研究報道，如丹龍醒腦方（丹參、三七、地龍、遠志、石菖蒲、淫羊藿、菟絲子）補腎生髓、活血通絡，可促進局灶性腦缺血再灌注模型大鼠海馬區NSCs增殖[24]；益腎化濁方（制何首烏、女貞子、淫羊藿、補骨脂、石菖蒲、炙黃芪、川芎）補腎益精、化濁通絡，可促進體外培養的海馬 NSCs 增殖[25]；補腎活血方（丹參、川芎、山藥、熟地黃、鹿角膠、枸杞、牛膝、菟絲子、山萸肉）補腎填精、活血化癡，能促進SAMP8小鼠（AD動物）海馬NSCs增殖［26]等。本研究的CHP亦具有補腎填精、活血化瘀等功效，也能促進AD大鼠海馬NSCs增殖。綜合這些研究結果，筆者認為中醫采用生髓養腦、充盈髓海治癡呆的現代醫學機制與其促進海馬NSCs增殖、恢復海馬神經功能有關，其確切機制有待深人研究。

綜上所述，黃精丸能通過促進海馬NSCs增殖、恢復海馬神經功能進而改善AD認知障礙，該名方可作為防治AD的有效候選藥，具有臨床推廣價值。

作者貢獻：廖可欣負責完成本研究中各實驗、整理數據；肖移生負責研究的構思與設計、實驗指導、文章撰寫、修改及審核，對論文負責。

本文無利益沖突。

參考文獻

［1］楊昊鵬，索靖東，申賢磊，等．中國“失智癥防治行動”任務清單的建議：基于WHO全球行動視角［J].中國全科醫學，2023，26（7）：775-779，782.D0I：10.12114/j.issn.1007-9572.2022.0744.

[2]YU TW，LANE HY，LIN CH.Novel therapeutic approaches forAlzheimer's disease：an updated review[J].IntJMol Sci，2021，22（15）： 8208.D0I：10.3390/ijms22158208.

[3]KOWALCZYK J， KURACH L， BOGUSZEWSKA-CZUBARA A，et al.Bergapten improves scopolamine-induced memory impairmentinmicevia cholinergicandantioxidative mechanisms[J].FrontNeurosci，2020，14：730.DOI：10.3389/fnins.2020.00730.

[4]SPOLETI E，KRASHIA P，BARBERA L L，et al. Early derailmentof firing properties in CA1 pyramidal cels of the ventral hippocampusin an Alzheimer's disease mouse model［J].Exp Neurol，2022，350：113969.DOI：10.1016/j.expneurol.2021.113969.

[5]PACHECO-HERRERO M，SOTO-ROJASLO，REYES-SABATER H，et al.Current status and challenges of stem celltreatment for Alzheimer'sdisease[J].JAlzheimers Dis，2021，84（3）：917-935.DOI：10.3233/JAD-200863.

[6] ZHENG J. Hippocampal neurogenesis and pro-neurogenic therapiesfor Alzheimer'sdisease[J].Animal Model ExpMed，2O22，5（1）：3-14.DOI： 10.1002/ame2.12212.

［7］肖移生，董琦，熊浩仲，等.黃精丸同名異方之文獻分析與關鍵內容考證［J].世界科學技術-中醫藥現代化，2023，25（5）：1608-1614.

[8］楊晶瑩，肖移生，姜劫琳，等.黃精丸對阿爾茨海默病大鼠大腦的抗氧化作用及 Aβ∣-42 ，APP蛋白表達的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2020，26（6）：32-38.D0I：10.13422/j.cnki.syfjx.20200305.

[9］楊晶瑩，高萌，左愛仁，等． β -cateninRNA干擾對黃精丸治療學習記憶障礙小鼠的信號通路機制的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2021，27（1）：53-62.D0I：10.13422/j.cnki.syfjx.20201879.

［10］錢紅月，肖移生，侯吉華，等.黃精丸對D-半乳糖和岡田酸所致學習記憶障礙小鼠海馬 Wnt/β -catenin信號通路相關蛋白表達的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2021，27（1）：63-71.DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20201876.

[11]ARREDONDO SB，VALENZUELA-BEZANILLAD，MARDONES MD，etal.Role of Wnt signaling in adult hippocampalneurogenesis in health and disease［J］. Front Cell Dev Biol，2020，8：860.D0I：10.3389/fcell.2020.00860.

[12]GAOJM，LIAOY，QIU MS，etal.Wnt/β-cateninsignaling in neural stem cell homeostasis and neurologicaldiseases[J].Neuroscientist，2021，27（1）：58-72.DOI：10.1177/1073858420914509.

[13］肖移生.黃精地龍提取液對老年癡呆大鼠腦內M膽堿能受體影響的研究［J］.中藥藥理與臨床，2017，33（4）：110-114.DOI：10.13412/j.cnki.zyyl.2017.04.031.

［14］王虎平，米彩云，李明成，等.基于“三陰并調”探討黑逍遙散對AD模型大鼠海馬神經元及PP2A的影響及作用機制［J].中藥藥理與臨床，2022，38（4）：40-45.D0I：10.13412/j.cnki.zyyl.2022.04.020.

[15］倪廣曉，段春巧，周宏斌，等.和血生絡方對缺血性卒中大鼠神經功能的影響及其作用機制研究［J］.時珍國醫國藥，2022，33（2） 300-305.DOI： 10.3969/j.issn.1008-0805.2022.02.11.

[16]HAYASHI Y，LIN HT，LEE C C，et al.Effects of neural stemcell transplantation in Alzheimer's disease models[J].JBiomedSci，2020，27（1）：29.D0I：10.1186/s12929-020-0622-x.

[17］張淑萍，劉璐，王秀梅，等.衰老模型聯合β-淀粉樣蛋白1-42建立大鼠阿爾茨海默病模型研究［J］.中國全科醫學，2015，18（36）： 4459-4463. DOI： 10.3969/j.issn.1007-9572.2015.36.012.

［18］牛彩琴，徐厚謙，張團笑.壽聰膠囊對老年癡呆模型大鼠學習記憶及海馬區ChAT的影響［J］.中國老年學雜志，2010，30（2）： 226-227.D0I： 10.3969/j.issn.1005-9202.2010.02.036.

［19］肖移生，曾元鳳，歐陽厚淦，等.黃精地龍方對老年癡呆大鼠行為認知及腦膽堿能系統的影響［J］.中藥藥理與臨床，2013，29（4）：146-148.D0I：10.13412/j.cnki.zyyl.2013.04.031.

[20]HU Z Q，TAO L，DENG M. Postnatal changes of neural stem cellsin the mammalian auditory cortex[J]. Int JMol Sci，2021，22（4）：1550.DOI：10.3390/ijms22041550.

[21]MORENO-JIMENEZEP，TERREROS-RONCAL J，FLOR-GARCIA M，et al. Evidences for adult hippocampal neurogenesis inhumans［J].JNeurosci，2021，41（12）：2541-2553.DOI：10.1523/JNEUROSCI.0675-20.2020.

[22］龍清華，趙賓賓，丁莉，等.酸棗仁湯通過抑制神經炎癥和改善神經營養水平促進APP/PS1癡呆小鼠海馬神經發生［J］.世界科學技術－中醫藥現代化，2021，23（9）：3014-3022.

［23］楊晶瑩，肖移生，肖愛嬌，等.黃精丸防治阿爾茨海默病的可行性探析及研究進展［J］．中國實驗方劑學雜志，2021，27（1）：46-52.DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20202105.

［24］陳娉婷，周小青，劉旺華，等.丹龍醒腦方對腦缺血再灌注大鼠海馬區神經干細胞增殖及Frizzled1、Dvl1、CyclinD1表達的影響［J］.中藥藥理與臨床，2016，32（1）：120-124.DOI：10.13412/j.cnki.zyyl.2016.01.034.

［25]韓文文，張玉蓮，周震，等.益腎化濁方對 Aβ 25-35 介導神經干細胞增殖與分化的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2015，21（20）：99-102.D01：10.13422/j.cnki.syfjx.2015200099.

［26］劉盼興，高媛媛，任璐，等.補腎活血方對SAMP8小鼠學習記憶及海馬神經干細胞影響實驗研究［J］.中華中醫藥學刊，2020，38（2）：50-53，264-265.D0I：10.13193/j.issn.1673-7717.2020.02.014.（收稿日期：2024-01-11；修回日期：2024-03-14）（本文編輯：鄒琳）