枸地氯雷他定對小鼠過敏性肺炎的改善作用及機制

中圖分類號R965 文獻標志碼A 文章編號 1001-0408（2025）15-1882-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.15.11

Improvement effect and mechanism of desloratadine citrate disodium in hypersensitivity pneumonitis model mice

PENG Wenjuan’，ZHAO Yan2，YUE Shaoyun2，WU Yujiao2，MO Jiajia2，CHU Zhaoxing2（1.Dept.of Internal Medicine II，Anhui Chest Hospital，Hefei 230022，China;2.Hefei Industrial Pharmaceutical Institute Co.， Ltd.，Hefei 230601，China）

ABSTRACTOBJECTIVETo investigate the improvement efectand mechanismof desloratadine citrate disodiuminmice with hypersensitivitypneumonitis（HP）.METHODS Sixtymicewererandomlydividedintoblank control group（normalsaline）， model group（normal saline），prednisone group（positive control， 20mg/kg ）anddesloratadine citrate disodium low-，mediumand high-dose groups（0.5，1， 2mg/kg ），with 1O mice in each group.Except for the blank control group，mice in other groups wereintraperitoneallyinjectedwithovalbumin（OVA）andexposedtoOVAinhalationtoestablishtheHPmodel.Onday22postmodeling，miceineachgroupwereadministeredthecorrespondingdrugsornormalsaline，onceaday，for11consecutivedays. Afterthelastadministration，lungfunctionandairwayhypereactivitywereassssd.Televelsofinterleukin-1β（I-1β），IL-4 andIL-6inserumaswellasthelevelsofIL-8，IL-13andIL-17AinbronchoalveolarlavagefluidweredeterminedPathological changesinlungtissueofmicewereevaluatedusing Massonstaining.Furthermore，theexpressonsoffibrosis-relatedproteins， including transforming growth factor β₁ （TGF- β₁ ），typeII collagen（Col- II）and fibronectin （FN）were determined in lung tisues.ESULTSComparedwiththe blankcontrol group，the model groupshowed significantdeteriorationinlung function（ Plt; 0.01），whileairwayresistanceandserumlevelsof IL-1β，IL-4，IL-6andthelevelsof IL-8，IL-13andIL-17Ain the bronchoalveolar lavage fluid were increased significantly（ （Plt;0.01 ）.The lung tissues exhibited alveolar collapse，atrophy，and structuraldisarrayalongwiththeformationof extensivedepositsofbluecoagen fibers，thepercentageofpositivestaining

increased significantly（ Plt;0.01 ）.Additionally，the expression levelsof TGF- ?β₁ ，Col-II，and FN proteinsin the lung tissues werealso increased significantly（ _Plt;0.01 ）.After intervention with desloratadine citrate disodium，the pathological changes in the lung tissues of mice in each dosage group of

desloratadinecitratedisodiumshowedvaryingdegresofimprovement，andmostof theaforementioned indicatorlevelswere significantlyreversed（ Plt;0.05 or Plt;0.01 ）. CONCLUSIONs Desloratadine citrate disodium can improve the lung function and airwayhyperreactivityofHPmice，inhibitthereleaseofinflammatoryfactors inserumandbronchoalveolarlavage fluid，and reducethedepositionofcollgenfibers.Itsmechanismofactionmayberelatedtoanti-inflammatory，mmunomodulatory，nd antifibrotic effects.

KEYWORDsdesloratadine citrate disodium；hypersensitivity pneumonitis；lung function；anti-inflammation；fibrosis

過敏性肺炎（hypersensitivitypneumonitis，HP）是易感個體被暴露于環(huán)境中的致敏原經(jīng)免疫介導而引起的一種間質(zhì)性肺疾病，常見臨床癥狀包括呼吸困難、咳嗽和喘鳴。HP患病率隨氣候、職業(yè)暴露和環(huán)境暴露的差異而變化。研究顯示，HP占間質(zhì)性肺疾病的 3%～15% ，為我國第三大常見的間質(zhì)性肺疾病[-2]。

炎癥反應和纖維化在HP的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，美國胸科協(xié)會、日本呼吸病學會和拉丁美洲胸科協(xié)會聯(lián)合制定的2020年版《成人過敏性肺炎診斷指南》，將HP分為纖維化型（混合炎癥性合并纖維化或純纖維化）和非纖維化型（純炎癥性）。糖皮質(zhì)激素是目前治療HP的首選藥物，早期使用可以有效緩解呼吸困難、咳嗽等癥狀，但長期使用會引起感染、高血壓、骨質(zhì)疏松等不良反應；免疫抑制劑如硫唑嘌呤、嗎替麥考酚酯，作為HP的二線治療選擇，可通過抑制免疫細胞的功能和增殖從而控制炎癥反應，但會出現(xiàn)骨髓抑制、肝腎功能損害等不良反應，長期使用安全性風險較大4。近年來，抗纖維化藥物成為治療HP的研究熱點，如尼達尼布或吡非尼酮均有改善HP纖維化的作用，可延緩肺功能下降，但胃腸道不良反應發(fā)生率高，且患者耐受性差。因此，現(xiàn)有藥物治療HP仍存在一定不足。

枸地氯雷他定是新型抗組胺藥，常用于治療過敏性蕁麻疹和過敏性鼻炎等過敏性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，枸地氯雷他定不僅具有抑制肥大細胞脫顆粒和抗組胺作用，還可通過抑制炎癥因子的釋放和炎癥細胞的募集發(fā)揮抗炎作用，并進一步改善纖維化[6-]。從作用機制和臨床應用來看，枸地氯雷他定具有治療HP的潛力。基于此，本研究以卵清蛋白（ovalbumin，OVA）誘導構建小鼠HP模型，研究枸地氯雷他定對HP的改善作用，并初步探討其可能的作用機制，以期為臨床治療HP提供一個可用的治療藥物。

1材料

1.1主要儀器

本實驗所用主要儀器包括QA40型超聲噴霧儀（美國Qsonica公司），SCIREQ型小動物肺功能檢測儀（北京廣源達科技發(fā)展有限公司），WBP型小動物全身體積描記檢測系統(tǒng)（美國DSIBUXCO公司），5810R型冷凍高速離心機（德國Eppendorf公司），MultiskanTMFC型酶標儀、FormaTM900系列 -80^°C 超低溫冰箱（美國ThermoFisherScientific公司），BS124S型萬分之一精密天平（德國Sartorius公司），KD-160型電子秤[百利達（上海）商貿(mào)有限公司]，MX-S型可調(diào)式渦旋混勻器（美國Scilogex公司）， CO₂ 安樂死箱（上海玉研科學儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

枸地氯雷他定（批號20240341，純度 ?98% 購自合肥恩瑞特藥業(yè)有限公司；小鼠源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單抗（2310435）、兔源轉化生長因子 β₁ （trans-forming growth factor- β₁ ， TGF- β₁ ）多克隆抗體（批號2313234）均購自美國SantaCruz公司；兔源3型膠原蛋白（typeIIcollagen，Col-II）抗體、兔源纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）抗體、OVA（批號分別為234124、241234、240514）均購自美國Sigma公司；Al（OH）3（批號C11882643）購自德國Merk公司；白細胞介素（interleu-kin，IL）-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-13和IL-17A酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（批號均為ml002921）均購自江蘇酶免實業(yè)有限公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠/兔二抗（批號分別為20709024D、21205016D）均購自廈門通靈生物醫(yī)藥科技股份有限公司；乙酰甲膽堿（批號r622312）購自美國BioRuler公司。

1.3實驗動物

SPF級健康BALB/c小鼠，共60只，雌性， 6～8 周齡，體重 （18±2）g ，由浙江維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2024-0001。所有動物飼養(yǎng)于合肥綜合性國家科學中心大健康研究院動物實驗平臺，研究方案經(jīng)該院動物倫理委員會審核通過（倫理號：IHM-AP-2024-063）。實驗期間小鼠自由進食與飲水。本研究嚴格遵循“3R\"原則，動物處理嚴格按照《實驗動物管理條例》進行。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，根據(jù)動物體重，按隨機數(shù)字表法將60只小鼠分為空白對照組（生理鹽水）模型組（生理鹽水）潑尼松組（陽性對照， 20mg/kg ，根據(jù)臨床等效劑量換算）和枸地氯雷他定低、中、高劑量組（0.5、

1，2mg/kg ，根據(jù)預實驗結果設定），每組10只。除空白對照組外，其余小鼠通過腹腔注射OVA和吸入OVA噴霧構建HP模型，以出現(xiàn)呼吸急促和氣喘為模型成功標準8-9。具體方法如下：造模小鼠在第1、8、15天腹腔注射 0.1mL 造模劑[含 200μgOVA 和 1mg.Al（OH）₃] ，共注射3次；從造模第22天開始，每天使造模小鼠暴露于 1% OVA噴霧中 30min （超聲噴霧儀），同時開始灌胃相應藥物干預，給藥容積為 10mL/kg ，每天1次，連續(xù)噴霧、給藥11 d。

2.2 肺功能檢測

末次給藥結束后 30min ，腹腔注射 1% 戊巴比妥鈉（70mg/kg） 麻醉各組小鼠，以仰臥位將其放置于小動物肺功能檢測儀內(nèi)，手術鈍性分離暴露氣管并進行氣管插管，然后記錄小鼠肺功能指標：用力肺活量（forcedvitalcapacity，F(xiàn)VC）、第1秒用力呼氣容積（forced expiratoryvolumeinonesecond，F(xiàn)EV1）FEV1/FVC、最大呼氣流量（peakexpiratoryflow，PEF）。

2.3 氣道高反應性測定

肺功能檢測完畢后，采用小動物全身體積描記檢測系統(tǒng)評估各組小鼠氣道高反應性。將小鼠放入霧化室先適應 1min ，以乙酰甲膽堿溶液按霧化質(zhì)量濃度1、5、10，15，20，25mg/mL 從低到高檢測，程序為霧化 1min 、記錄 3min 恢復 1min ，記錄氣道阻力。

2.4血清和支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子水平檢測

完成氣道高反應測定后，所有小鼠仰臥固定，于腹主動脈取血，室溫靜置 2h 后，以 3500r/min 離心 10min 后取上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作，使用酶標儀檢測小鼠血清中的IL-1β、IL-4、IL-6水平。采用 0.9% 氯化鈉溶液對小鼠左側肺部進行灌洗，收集支氣管肺泡灌洗液，以 3500r/min 離心 10min 后取上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作，使用酶標儀檢測小鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-8、IL-13、IL-17A水平。

2.5 肺組織病理觀察

完成血清和肺泡灌洗液采集后，將小鼠安樂死。每組取6只小鼠肺組織于 4% 多聚甲醛溶液中固定 24h 后脫水包埋于石蠟中，制備石蠟切片（厚度 3μm ），進行Masson染色后，封片，采用熒光顯微鏡于白光下觀察大鼠的肺組織病理變化。應用ImageProPlus6.0軟件測算切片中陽性染色（呈藍色）面積，并計算陽性染色百分比[陽性染色百分比 （%）= 陽性染色面積/總面積 x 100% 以評價病變程度。

2.6肺組織中纖維化相關蛋白表達的檢測

采用Westernblot法檢測。每組另取3只小鼠肺組織，提取組織中的總蛋白，采用BCA法測定總蛋白濃度。

將蛋白變性后，取蛋白 40μg 上樣進行電泳（恒壓180V， 13min 后轉膜至聚偏二氟乙烯膜上，用含 5% 脫脂奶粉的TBST浸泡聚偏二氟乙烯膜，室溫封閉 2h ；加入TGF- β₁ 、Col-II、FN、GAPDH一抗（稀釋比例分別為1：1000，1：1000，1：5000，1：5000） ，于 4^°C 孵育過夜；洗膜后，加人相應二抗（稀釋比例為1：10000），室溫孵育 2nΩ ；曝光顯色，利用ImageProPlus6.0軟件分析，以目標蛋白與內(nèi)參蛋白（GAPDH）條帶灰度值的比值表示目標蛋白的表達水平。

2.7 統(tǒng)計學方法

使用GraphPadPrism9.5軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料滿足正態(tài)分布，以 表示，多組間比較采用方差分析，方差齊性時組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊時組間兩兩比較采用Tamhane's 檢驗。檢驗水準 α=0.05 。

3結果

3.1枸地氯雷他定對模型小鼠肺功能的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠FVC、FEV1、FEV1/FVC、PEF均顯著降低 （Plt;0.01 ；與模型組比較，各給藥組小鼠FVC、FEV1、FEV1/FVC（除枸地氯雷他定低劑量組外）、PEF均顯著升高（ （Plt;0.05 或 Plt;0.01 ）。結果見表1。

表1各組小鼠肺功能指標比較 ）

a：與空白對照組比較， Plt;0.01 ;b：與模型組比較， Plt;0.01 ;c：與模型組比較， Plt;0.05 。

3.2枸地氯雷他定對模型小鼠氣道高反應性的影響

空白對照組、模型組、潑尼松組和枸地氯雷他定低、中、高劑量組小鼠的氣道阻力依次為 （2.01±0.22） ！（4.05±0.25） ）、 （2.96±0.23） ）、 （3.23±0.29） 、 （2.90±0.35） 、（2.77±0.40）cmH₂O/（mL?s）（1cmH₂O≈98.0665Pa） 。與空白對照組比較，模型組小鼠氣道阻力顯著升高（ Plt; 0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠氣道阻力均顯著降低 ?Plt;0.05 或 Plt;0.01 ）。

3.3枸地氯雷他定對模型小鼠血清中炎癥因子的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠血清中IL-1β、IL-4、IL-6水平均顯著升高 （Plt;0.01 ）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清中IL-1β、IL-4、IL-6（除潑尼松組和枸地氯雷他定低劑量組外）水平均顯著降低 Plt;0.01. ）。結果見表2。

表2各組小鼠血清中炎癥因子水平比較 pg/mL）

a：與空白對照組比較， Plt;0.01 ;b：與模型組比較， ?Plt;0.01?

3.4枸地氯雷他定對模型小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-8、IL-13、IL-17A水平均顯著升高（ （Plt;0.01 ；與模型組比較，各給藥組小鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-8、IL-13（除枸地氯雷他定低劑量組外）、IL-17A水平均顯著降低（ ΔPlt;0.05 或 Plt;0.01 ）。結果見表3。

表3各組小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子水平比較

a：與空白對照組比較， Plt;0.01 ;b：與模型組比較， Plt;0.01 ;c：與模型組比較， ΔPlt;0.05Δ

3.5枸地氯雷他定對模型小鼠肺組織病理的影響

空白對照組小鼠肺泡結構清晰，肺泡間質(zhì)內(nèi)以氣管為中心的少量藍色膠原屬于正常膠原，陽性染色百分比為 （3.43±0.23）% ；與空白對照組比較，模型組小鼠肺組織出現(xiàn)肺泡塌陷、萎縮及結構紊亂，并生成大量藍色膠原纖維沉積，陽性染色百分比顯著升高[（ 26.54± 2.65）% Plt;0.01] ;與模型組比較，各給藥組小鼠肺組織結構均明顯改善，陽性染色百分比均顯著降低[潑尼松組和枸地氯雷他定低、中、高劑量組的陽性染色百分比依次為 （15.43±1.76）% ！ （21.43±2.63）% 、 （17.65±1.72）% ！（ 14.36±1.23）% Plt;0.05 或 Plt;0.01] 。結果見圖1。

3.6枸地氯雷他定對模型小鼠肺組織中纖維化相關蛋白表達的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠肺組織中TGF- ?β₁ 、Col-II、FN蛋白表達水平均顯著升高（ Plt;0.01 。與模型組比較，各給藥組小鼠肺組織中TGF- ?β_¹?Col. I、FN蛋白表達水平均顯著降低（ Plt;0.01 。結果見圖2、表4。

4討論

HP是一種由吸人有機粉塵或化學物質(zhì)引發(fā)的免疫介導的肺部炎癥性疾病，發(fā)病機制復雜，炎癥免疫反應和組織纖維化是其主要致病機制，涉及先天性和適應性

D.枸地氯雷他定低劑量組E.枸地氯雷他定中劑量組F.枸地氯雷他定高劑量組黃色箭頭：膠原纖維沉積。

圖1各組小鼠肺組織病理變化Masson染色顯微圖

圖2各組小鼠肺組織中TGF- β_β1，C0l- Ⅲ、FN蛋白表達電泳圖

I：空白對照組；Ⅱ：模型組；Ⅱ：潑尼松組； IV ：枸地氯雷他定低劑量組；V：枸地氯雷他定中劑量組；VI：枸地氯雷他定高劑量組。

表4各組小鼠肺組織中TGF- ??{β}_{C0I- IⅢI ?_FN 蛋白表達水平比較 ）

a：與空白對照組比較 .Plt;0.01 ；b：與模型組比較， ?Plt;0.01 。

免疫反應。在先天性免疫啟動后，適應性免疫通過抗原特異性T細胞和B細胞介導的炎癥反應，導致肺部肉芽腫形成，并促進肺部纖維化，最終導致肺組織結構發(fā)生不可逆破壞，加重疾病癥狀[0-11]

OVA是常用的致敏原，可啟動機體過敏性免疫反應，激活輔助性T細胞2（helperTcell2，Th2）/Th17型免疫應答和免疫球蛋白E介導的效應反應，導致IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、IL-17A等細胞因子釋放，進而誘導促纖維化因子TGF- ?β₁. Col-II、FN的高表達，導致氣道壁的阻塞、狹窄和炎癥細胞的浸潤，引起肺功能呼氣量降低和嚴重的氣道高反應性，進而導致肺部組織出現(xiàn)纖維化及不可逆的病理變化[12]。因此，本研究采用OVA構建小鼠HP經(jīng)典模型，用于評價枸地氯雷他定對HP的改善作用。

在HP疾病發(fā)展過程中，炎癥、免疫紊亂及纖維化均起到重要作用。促炎因子IL-1β和IL-6的大量釋放可誘導黏附分子及IL-8等趨化因子表達，促進白細胞募集和T細胞分化，其中Th2細胞釋放的IL-4和IL-13可誘導成纖維細胞增殖和膠原蛋白生成，Th17細胞釋放的IL-17A可促進中性粒細胞聚集、激活、遷移，加劇纖維化形成，從而導致TGF- ?β₁ 和FN等纖維化相關因子激活，加重肺纖維化程度[13-14]。在本實驗中，HP小鼠的氣道阻力顯著升高，肺功能顯著降低，血清中IL-1β、IL-4、IL-6水平和支氣管肺泡灌洗液中IL-8、IL-13、IL-17A水平以及肺組織中TGF- ?β₁?C01? Ⅱ和FN蛋白表達水平均顯著升高，說明OVA誘導的HP引起了體內(nèi)相應促炎因子的激活，并進一步促進了TGF-βi和FN等纖維化因子的激活。給予枸地氯雷他定干預，可顯著改善小鼠肺功能和氣道高反應性，降低炎癥因子水平，抑制肺組織中纖維化相關蛋白表達，改善肺組織膠原纖維的沉積。

綜上所述，枸地氯雷他定可改善HP小鼠的肺功能和氣道高反應性，抑制血清和支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子的釋放，降低膠原纖維的沉積，其作用機制可能與抗炎、調(diào)節(jié)免疫和抗纖維化相關。

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（編輯：舒安琴）