基于HPLC指紋圖譜及一測多評法的心通顆粒質(zhì)量評價

中圖分類號R917 文獻標志碼A 文章編號 1001-0408（2025）15-1866-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.15.08

Qualityevaluation of Xintong granules basedon HPLC fingerprint and quantitative analysis of multi components by single-marker method

YE Xide'，F(xiàn)ENG Xiaolong1，SHAO Mingguo1，2，WAN Linchun3，HU Zhenyu’，CHEN Chunyu'，WU Yu¹ ，BU Junwen'，QIAN Yuhang'，MENG Fanqiang2（1. School of Pharmacy，Jiangxi University of Chinese Medicine， Nanchang 33004， China;2.Lunan Pharmaceutical Group Co.，Ltd.，Shandong Linyi 276006，China;3.Jiangxi InstituteforDrugControl，Nanchang330029，China）

ABSTRACTOBJECTIVEToestablishthe HPLCfingerprintof Xintonggranulesand thequantitativeanalysisof multicomponents bysingle-marker method（QAMS）todetermine thecontentsof7components，soastoprovideascientific basis for theirqualitycontrol.METHODS HPLCmethodwasusedtoestablish thefingerprints for10batchesof Xintonggranules（No.S1- S10），and similarityevaluation，cluster analysis（CA）and partial leastsquares-discriminant analysis （PLS-DA）wereperformed. At the same time，the contents of seven components，including puerarin，daidzin，calycosin-7-O- β -D-glucoside， stilbene glycoside，naringin，icarinandtanshinoneIA，were determinedbyQAMSmethod，and werecomparedwiththeresultsof externalstandardmethod.RESULTSAtotalof18commonpeaksweremarkedand7peakswereidentifiedintheHPLC fingerprints for 10 batches of Xintong granules，namely puerarin （peak 4），daidzin （peak 7），calycosin-7-O. ?β -D-glucoside（peak 9），stilbene glycoside（peak1O），naringin（peak12），icarin（peak17），andtanshinoneIA（peakl8）；the similaritisamong themwere morethanO.990，andCAandPLS-DAresultsshowedthatS4-S5，S8-S10，S1-S3andS6-S7wereclusteredintothree categories，respectively.Using naringinastheinternal standard，thecontentsof puerarin，daidzin，calycosin-7-O _?β -D-glucoside， stibeneglyoside，icarinandtanshnoneIAweredeterminedtobe7.8681-10.1812，.709.741，0.2852-03263，24- 1.5239，0.140 2-0.290 4，and 0.077 1-0.219 4mg/g ，respectively，by the QAMS. These results showed no significant differences compared to thoseobtained bythe exteral standard method.CONCLUSIONS Established HPLCfingerprint andQAMS method

areconvenient，stableandaccurate，whichcanprovideabasis forthe quality evaluation of Xintong granules.

KEYWORDS Xintong granules； fingerprint； quantitativeanalysisofmulti-componentsbysingle-markermethod;content determination

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，簡稱冠心病，是一種缺血性心臟病。冠狀動脈因膽固醇及其他物質(zhì)堆積引起動脈壁狹窄或閉塞可導致心肌缺血、缺氧或壞死，引發(fā)胸痛、胸悶等不適癥狀，與中醫(yī)氣陰兩虛、寒凝心脈、痰阻心脈等病證有關(guān)[1-2]。

心通顆粒收載于國家藥品標準YBZ16392009-2017，由黃芪、丹參、葛根等13味藥材組成，具有活血化瘀、祛痰通絡(luò)的功效，可改善冠心病患者心肌功能異常等癥狀。心通顆粒的成分復雜，現(xiàn)有質(zhì)量標準僅對葛根素、柚皮苷、淫羊藿苷等成分作了含量測定要求，難以全面反映心通顆粒的質(zhì)量。指紋圖譜可全面反映中藥所含化學成分的種類和數(shù)量，從而體現(xiàn)中藥的整體性和復雜性。一測多評（quantitative analysis of multi-componentsbysinglemarker，QAMS）法是一種對多指標同步進行質(zhì)量控制的方法，可通過確定中藥或制劑中1種成分的含量，利用相對校正因子來計算其他多種成分的含量，從而實現(xiàn)多個成分的同時測定。因此，指紋圖譜結(jié)合QAMS法可更直觀、更全面地反映中藥質(zhì)量。基于此，本研究在建立心通顆粒的高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography，HPLC）指紋圖譜的基礎(chǔ)上，采用QAMS法，以柚皮苷為內(nèi)標物，計算心通顆粒中葛根素、大豆苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷、丹參酮ⅡA的含量，以期為該制劑的質(zhì)量評價提供參考。

1材料

1.1主要儀器

本研究所用主要儀器有Agilent1100型、1260型HPLC儀（美國Agilent公司），TG328A型十萬分之一天平（瑞士MettlerToledo公司），HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司），KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

10批心通顆粒[批號分別為07220651、07221271、07221331、07221361、07221371、07221221、07221401、707230241、707230371、707230391（編號S1～S10），規(guī)格5.3g] 購自魯南厚普制藥有限公司；葛根素、大豆苷、柚皮苷、丹參酮IA、淫羊藿苷、二苯乙烯昔、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號分別為WP24010211、WP23042006、WP24010212、WP23030106、WP23080108、WP23103007、WP23090802，純度均大于 98.0% ）均購自四川省維克奇生物科技有限公司；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

本研究所用色譜柱為Diamonsil C₁₈ 色譜柱（150mm×4.6mm，5μm） ，以 0.1% 磷酸溶液（A）-乙腈（B）為流動相，進行梯度洗脫（ 0～5min ， 5～10 min， ： 10～25min ， ： 25～40 min ， 25%B60%B 40～50min 50～55 min ， 70%B?80%B ： 55～60min ， 80%B?100%B 60～ 61min 100%B10%B ），流速為 1mL/min ，檢測波長為280nm ，柱溫為 30^°C ，進樣量為 10μL 。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液

分別精密稱取葛根素、大豆苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、二苯乙烯苷、柚皮苷、淫羊藿苷、丹參酮ⅡA對照品適量，加甲醇制成每毫升分別含上述成分 0.9856.0.1704. 0.1255，0.1666，0.1952，0.2101，0.0950mg 的混合對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液

將心通顆粒研成粉末并過三號篩，精密稱取 2.0g 置于錐形瓶中，精密加入 80% 甲醇 25mL ，回流提取 1h 冷卻，過濾，取濾液即得供試品溶液。

2.3 專屬性考察

取混合對照品溶液及供試品溶液各適量，按“2.1\"項下色譜條件進樣分析。結(jié)果顯示，各成分色譜峰分離度良好，且供試品溶液中相應成分的色譜峰位置與各對照品溶液一致。結(jié)果見圖1。

圖1專屬性試驗考察結(jié)果

1：葛根素；2：大豆苷;3：毛蕊異黃酮葡萄糖苷；4：二苯乙烯苷；5：柚皮苷；6：淫羊藿苷；7：丹參酮ⅡIA。

2.4 HPLC指紋圖譜的建立

2.4.1 精密度考察

取心通顆粒供試品溶液（編號S1）適量，按\"2.1\"項下色譜條件連續(xù)進樣6次，以柚皮昔為參照峰，計算共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果顯示，葛根素、大豆苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷、丹參酮ⅡIA相對保留時間的RSD均不大于 0.10%（n= 6），相對峰面積的RSD均不大于 1.37%（n=6） ，表明該方法精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗

取心通顆粒供試品溶液（編號S1）適量，在室溫放置0、2、5、10、15、24h后，按“2.1\"項下色譜條件進樣分析，以柚皮昔為參照峰，計算共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果顯示，葛根素、大豆苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷、丹參酮ⅡA相對保留時間的RSD均不大于 0.11%（n=6） ，相對峰面積的RSD均不大于 1.14%（n=6） ，表明供試品溶液在室溫放置 24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復性試驗

精密稱取心通顆粒樣品（編號S1）6份，按“2.2.2\"項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣分析，以柚皮苷為參照峰，計算共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果顯示，葛根素、大豆苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷、丹參酮ⅡA相對保留時間的RSD均不大于 0.11%（n=6） ，相對峰面積的RSD均不大于 1.78%（n=6） ，表明該方法的重復性良好。

2.4.4指紋圖譜的建立及相似度評價

取10批心通顆粒樣品，按“2.2.2\"項下方法制備供試品溶液，再按“2.1\"項下色譜條件進樣分析，將所得數(shù)據(jù)導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版），以S1色譜圖為參照圖譜，經(jīng)多點校正和Mark峰匹配后，得到對照指紋圖譜R（圖2），以對照指紋圖譜R為基準計算10批心通顆粒色譜圖的相似度。結(jié)果顯示，共標記了18個共有峰，通過與混合對照品溶液圖譜進行比對指認出7個成分，分別是葛根素（峰4）大豆昔（峰7）毛蕊異黃酮葡萄糖苷（峰9）、二苯乙烯苷（峰10）、柚皮苷（峰12）、淫羊藿苷（峰17）丹參酮ⅡA（峰18）；10批心通顆粒的相似度為 0.995～1.000 ，表明心通顆粒各樣品相似度高、質(zhì)量差異小。

圖210批心通顆粒樣品的HPLC指紋圖譜和對照指紋圖譜R

2.4.5 聚類分析

將10批心通顆粒的18個共有峰的峰面積導入到SPSS21.0軟件中進行聚類分析，結(jié)果（圖3）顯示，當平方歐氏距離為15時，10批心通顆粒被聚為3類： S4～S5 樣品聚為一類， S8～S10 樣品聚為一類， _{S1～S3?S6～S7} 樣品聚為一類。

2.4.6 偏最小二乘-判別分析

將10批心通顆粒的18個共有峰的峰面積導入到SIMCA14.0軟件進行偏最小二乘-判別分析（PLS-DA）

圖310批心通顆粒樣品的聚類分析結(jié)果

以建立模型，該模型參數(shù) R²X 為 0.766，R²Y 為 0.902，Q² 為0.782，均大于0.5，表明該模型預測準確性良好，穩(wěn)定性高。由圖4可知，PLS-DA結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。進一步將模型隨機排列200次進行置換檢驗，結(jié)果顯示，左側(cè)的 R² 和 Q² 均低于右側(cè)的 R² 和 Q² ，表明該模型未出現(xiàn)過度擬合現(xiàn)象。

圖410批心通顆粒樣品的PLS-DA得分圖

2.5 QAMS法定量分析

結(jié)合“2.4\"項下指紋圖譜分析結(jié)果，選取葛根素、大豆苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、二苯乙烯苷、柚皮苷、淫羊藿昔、丹參酮ⅡA作為心通顆粒定量分析的指標成分。

2.5.1 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，逐級稀釋成不同質(zhì)量濃度的系列混合對照品溶液，按“2.1\"項下色譜條件進樣分析，以對照品峰面積為縱坐標（Y）質(zhì)量濃度為橫坐標 （X） 進行線性關(guān)系擬合，結(jié)果見表1。

表17種成分的回歸方程及線性范圍

2.5.2 精密度考察

取心通顆粒供試品溶液（編號S1）適量，按“2.1\"項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，葛根素、大豆苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、二苯乙烯苷、柚皮苷、淫羊藿苷、丹參酮ⅡA峰面積的RSD分別為 0.74% ）0.44%?0.92%?0.78%?0.34%?0.76%?0.27%（n=6） ，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性考察

精密稱取 2.0g 心通顆粒粉末（編號S1），按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別在室溫放置0、2、4、8、12、24h時按\"2.1\"項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結(jié)果顯示，葛根素、大豆苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、二苯乙烯苷、柚皮苷、淫羊藿苷、丹參酮ⅡA峰面積的RSD分別為 0.50% 、 0.41% 、 1.12% 、 1.01% 、 0.33% 、1.15%.0.20%（n=6） ，表明供試品溶液在室溫放置 24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復性考察

精密稱取 2.0g 心通顆粒粉末（S1），按“2.2.2\"項下方法制備6份供試品溶液，再按“2.1\"項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算含量。結(jié)果顯示，葛根素、大豆苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、二苯乙烯苷、柚皮苷、淫羊藿苷、丹參酮IA含量的RSD分別為 0.41% /1.91%，1.65%，1.17%，0.56%，1.62%，0.42%（n=6） ，表明該方法重復性良好。

2.5.5 加樣回收率考察

精密稱定 1.0g 已知含量的心通顆粒粉末（編號S1）9份，置于具塞錐形瓶中，加入相當于樣品中各成分含量80%，100%，120% 的對照品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1\"項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積并計算加樣回收率。結(jié)果顯示，葛根素、大豆苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、二苯乙烯苷、柚皮苷、淫羊藿苷、丹參酮ⅡA的平均加樣回收率分別為 99.19%.100.68% 、100.03% 、 100.82% 、 100.78% 、 99.91% / 100.18% ，RSD分別為 1.77%0.0.90%0.89%0.0.97%0.86%0.62%0.0.76% 1 n=9 ），表明該方法準確度良好。

2.5.6 相對校正因子的計算

精密吸取“2.2.1\"項下混合對照品溶液，按“2.1\"項下色譜條件，分別進樣 2、4、6、8、10、12、14μL ，記錄各成分峰面積。以柚皮苷為內(nèi)標物，采用多點校正法計算相對校正因子，相對校正因子 =（A_s/C_s）/（A_i/C_i） ，其中 C_s 和 A_s 分別表示內(nèi)標物的質(zhì)量濃度和峰面積， C_i 和 A_i 分別表示待測成分的質(zhì)量濃度和峰面積[3。結(jié)果（表2）顯示，不同質(zhì)量濃度葛根素、大豆昔、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷、丹參酮ⅡA相對校正因子的RSD均小于 1.50%（n=6） 。

表2各成分相對校正因子的測定結(jié)果

2.5.7不同儀器、色譜柱、柱溫、流速對相對校正因子的影響考察

本研究考察了不同HPLC系統(tǒng)（Agilent1100、Agi-lent1260），不同色譜柱（Waters C₁₈ 、Thermo C₁₈ Diamon-sil C₁₈ ），不同柱溫 （25，30，35^°C ），不同流速（0.6、0.8、1.0AA.1.2mL/min 對相對校正因子的影響。結(jié)果顯示，在上述不同條件下各成分相對校正因子的RSD均小于2.00% ，表明相對校正因子在不同HPLC系統(tǒng)和色譜條件下耐用性良好。

2.5.8 色譜峰的定位

根據(jù)“2.5.7”項下實驗結(jié)果，以柚皮昔為參照峰，計算各成分的相對保留時間[4-5]。結(jié)果顯示，采用不同儀器、色譜柱、柱溫和流速時，各成分相對保留時間的RSD均小于 4.0% 。因此，以各成分相對保留時間作為峰定位的依據(jù)。

2.5.9 各成分含量測定結(jié)果

取10批心通顆粒，按\"2.2.2\"項下方法制備供試品溶液，再按“2.1\"項下色譜條件進樣測定，分別采用外標法（externalstandardmethod，ESM）和QAMS法計算各成分含量，并通過計算差異百分比（percentagedifference，PD）比較2種方法所得結(jié)果。 PD=|QAMS 法結(jié)果一ESM結(jié)果 |×2/ （QAMS法結(jié)果+ESM結(jié)果） ×100%^[6] O結(jié)果（表3）顯示，各成分的PD均小于 10% ，表明這兩種方法的含量測定結(jié)果無明顯差異，所建QAMS法可靠。

表3兩種方法測定7種成分含量的結(jié)果比較

3討論

3.1提取條件的選擇

本研究分別考察了不同提取條件（超聲、回流）不同提取溶劑（ 100% 甲醇、 80% 甲醇、 50% 甲醇、 30% 甲醇、 70% 乙醇、 50% 乙醇、水）對心通顆粒有效成分提取的影響。結(jié)果顯示，采用 80% 甲醇進行回流提取時，各成分色譜峰峰形較好，且雜質(zhì)較少。

3.2 指紋圖譜結(jié)果分析

心通顆粒由13味藥材組成，為多成分復雜體系，對單成分進行檢測無法反映其整體質(zhì)量，因此本研究使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）對10批心通顆粒的HPLC指紋圖譜進行分析。結(jié)果，共標記了18個共有峰，并指認了7個峰；10批心通顆粒的相似度均大于0.990，這說明心通顆粒的質(zhì)量較為穩(wěn)定、差異較小。

3.3定量分析的指標成分選擇

心通顆粒由黃芪、黨參、麥冬、何首烏、淫羊藿、葛根、當歸、丹參、皂角刺、海藻、昆布、牡蠣和枳實13味藥材組成，具有活血化瘀、祛痰通絡(luò)的功效。君藥黃芪中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷可通過激活磷脂酰肌醇3激酶蛋白激酶B信號通路，抑制氧化應激，從而改善心肌功能。何首烏的主要成分二苯乙烯苷具有護肝作用，可通過恢復肝的疏泄功能，增強黃芪的健脾益氣通絡(luò)作用；此外，其還具有抗氧化、保護心肌等作用。丹參的主要成分丹參酮ⅡA具有明顯的活血化瘀作用，可通過增加冠脈流量改善供血量，對冠心病、心絞痛及心肌梗死等具有良好的改善作用[9-。淫羊藿中的淫羊藿苷具有抗炎、提高免疫力和保護心血管等作用[]。葛根中的大豆苷、葛根素具有改善心肌功能、減少心肌耗氧、緩解心絞痛和心肌梗死的作用[12-13]。枳實中的柚皮苷具有抗氧化、抗炎、改善心肌缺血等作用[4。上述成分均對心臟有良好的保護作用，因此本研究選擇這些成分作為心通顆粒定量分析的指標成分。

綜上所述，本研究建立的HPLC指紋圖譜和QAMS法便捷、穩(wěn)定、準確，可為心通顆粒的質(zhì)量評價提供依據(jù)。

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（編輯：唐曉蓮）