利用人表皮干細胞3D生物打印皮膚組織的初步研究

[摘要]目的：對利用人表皮干細胞（Human Epidermal stem cells，hESCs）進行3D生物打印的皮膚組織進行初步研究。方法：分離人皮膚樣本的表皮層與真皮層，胰酶消化，快速貼壁法分離ESCs，細胞免疫熒光染色及流式細胞儀鑒定其標志分子；MTT法檢測完全DMEM培養基、無血清KGM2培養基中ESCs增殖情況；制備3D打印支架材料，以ESCs為種子細胞，采用微擠壓3D生物打印技術打印皮膚組織，HE染色觀察不同ESCs濃度的3D打印皮膚組織厚度，MTT法檢測不同纖維蛋白原濃度對3D打印皮膚組織中細胞活性的影響；HE染色、免疫熒光染色觀察3D打印皮膚組織的結構；透皮水分散失（Transepidermal water loss，TEWL）法、甲苯胺藍滲透法檢測3D打印皮膚組織的屏障功能。結果：細胞免疫熒光染色顯示，第2代ESCs中β1整合素、角蛋白19陽性表達率＞90%；流式細胞儀檢測顯示，CD71低表達的同時α6整合素高表達的細胞＞90%。與完全DMEM培養基比較，ESCs在無血清KGM2培養基中的組24、48、72 h吸光度值均升高（P＜0.05）。與2×106/ml比較，4×106/ml、6×106/ml時打印組織厚度增加，4×106/ml、6×106/ml打印組織厚度比較，差異無統計學意義（P＞0.05），選用4×106/ml作為后續ESCs濃度用于打印皮膚。當纖維蛋白原作為支架材料，濃度為5～20 mg/ml時，對ESCs的活性無明顯影響。免疫熒光染色顯示，3D打印皮膚組織的表皮層、真皮層分層良好。正常皮膚、3D打印皮膚的表皮層厚度、TEWL值、甲苯胺藍的滲透厚度比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。結論：以人ESCs作為種子細胞，培養于無血清KGM2培養基，5 mg/ml纖維蛋白原作為支架材料，微擠壓3D生物打印技術打印皮膚組織，獲取的皮膚組織與正常皮膚具有類似的表皮層厚度與屏障功能。

[關鍵詞]人表皮干細胞（hESCs）；3D生物打印；生物醫學工程；皮膚組織；屏障功能

[中圖分類號]R726.2" " [文獻標志碼]A" " [文章編號]1008-6455（2025）09-0024-06

Preliminary Study on 3D Bioprinting Skin Tissue Using Human Epidermal Stem Cells

GUO Shenghong， LIU Guogang， WANG Huaying， XIE Liwei， ZHANG Haiyang

（ Department of Dermatology， Ziyang Central Hospital， Ziyang 641300， Sichuan， China ）

Abstract： Objective" To conduct a preliminary study on the 3D bioprinting of skin tissue using human epidermal stem cells （ESCs）. Methods" The epidermal and dermal layers of human skin samples were separated， digested with trypsin， and ESCs were isolated using the rapid adhesion method. The identification of their marker molecules was performed through cell immunofluorescence staining and flow cytometry. The proliferation of ESCs in complete DMEM medium and serum-free KGM2 medium was detected by MTT assay. 3D printing scaffold materials were prepared， with ESCs as seed cells， and skin tissue was printed using micro-extrusion 3D bioprinting technology. HE staining was used to observe the thickness of 3D printed skin tissue at different ESC concentrations， and the effect of different fibrinogen concentrations on cell viability in 3D printed skin tissue was detected by MTT assay. The structure of 3D printed skin tissue was observed through HE staining and immunofluorescence staining. The barrier function of 3D printed skin tissue was detected by transepidermal water loss （TEWL） method and toluidine blue permeation method. Results" Cell immunofluorescence staining showed that the positive expression rate of β1 integrin and keratin 19 in the 2nd generation ESCs was ＞90%. Flow cytometry detected that cells with low expression of CD71 and high expression of α6 integrin accounted for ＞90%. Compared with complete DMEM medium， the optical density values of ESCs in serum-free KGM2 medium at 24， 48， and 72 h increased （P＜0.05）. Compared with 2×106/ml， the thickness of printed tissue increased at 4×106/ml and 6×106/ml， and there was no statistically significant difference in the thickness of printed tissue between 4×106/ml and 6×106/ml （P＞0.05）， so 4×106/ml was selected as the subsequent ESC concentration for printing skin. When fibrinogen was used as the scaffold material at a concentration of 5～20 mg/ml， it had no significant effect on the activity of ESCs. Immunofluorescence staining showed that the epidermal and dermal layers of 3D printed skin tissue were well-differentiated. There was no statistically significant difference in the thickness of the epidermal layer， TEWL value， and toluidine blue permeation thickness between normal skin and 3D printed skin. Conclusion" Using human ESCs as seed cells， cultured in serum-free KGM2 medium， and 5 mg/ml fibrinogen as the scaffold material， micro-extrusion 3D bioprinting technology can print skin tissue that has a similar epidermal layer thickness and barrier function to normal skin.

Key words： human epidermal stem cells （ESCs）; 3D bioprinting; biomedical engineering; skin tissue; barrier function

皮膚作為人體最大的器官，承擔著保護身體免受外界物理、化學和生物因素侵害的重要作用，并參與體溫調節、水分保持和感覺傳遞，是人體健康與美麗的重要標志。但由于意外傷害、疾病、手術等原因，皮膚組織常會受到損傷，嚴重影響個體健康及生活質量。皮膚創面愈合和功能恢復問題一直是醫學領域面臨的重大挑戰[1-2]。目前臨床治療皮膚損傷的主要方法包括自體皮膚移植和異體皮膚移植，但這些方法存在諸多局限性，其治療成本高昂，自體皮膚移植需要在另一部位切取皮膚，可能會導致新的傷口和瘢痕，異體皮膚移植則存在免疫排異風險，且長期供體皮膚也存在再損傷風險，限制皮膚移植治療的廣泛應用[3-4]。組織工程學通過結合生物學、材料學、工程學等多學科知識，構建具有生物活性的人工組織或器官，以替代或修復損傷的自然組織，可為燒傷、慢性潰瘍等難以愈合創面提供臨時或永久的創面覆蓋，同時可促進創面愈合，減少感染和瘢痕形成[5]。隨著生物醫學工程的進步，3D生物打印技術的發展為皮膚組織工程提供了新的方向，該技術利用生物材料和細胞作為“墨水”，通過精確控制打印參數，在三維空間內精確放置活細胞和支架材料，使其能夠模擬自然皮膚的結構和功能，具有操作簡便、制備周期短、可定制化設計等優勢，為皮膚創面修復提供了新的解決方案[6]。人表皮干細胞（Epidermal stem cells，ESCs）具有自我更新和多向分化的潛能，能夠分化為皮膚的各種細胞類型，是構建人工皮膚的理想種子細胞[7]。本研究旨在探索利用人ESCs進行3D生物打印皮膚組織的方法，以期克服傳統組織工程皮膚存在的局限性，為皮膚創面的治療提供更為有效和安全的解決方案。

1" 材料和方法

1.1 實驗材料：本研究中所選用的皮膚組織樣本均來自經過臨床診斷并同意行手術切除的色素痣患者。在手術過程中，由經驗豐富的外科醫生在嚴格遵守無菌操作規程的條件下，精確切除含有色素痣的病變皮膚組織。在確保病變組織完全切除的同時，小心保留周邊未受病變影響的健康皮膚。這些健康皮膚樣本在獲得患者書面同意并經過倫理審查委員會批準后，被用于本研究。樣本在切除后立即被轉移到預先準備好的含有無菌磷酸鹽緩沖液的培養皿中，并在2 h內轉移到實驗室進行后續處理。在實驗室中，樣本被再次清洗以去除表面的血液和污染物，并按照標準化的程序進行切割和保存，以確保細胞的活性和組織的完整性。所有處理步驟均在層流凈化臺內完成，以防止微生物污染。

1.2 方法

1.2.1 分離培養人ESCs：在無菌條件下，處理收集的健康皮膚樣本，首先用外科手術刀和鑷子去除多余的脂肪和結締組織，然后將表皮層與真皮層分離。在無菌條件下使用0.25%胰酶進行消化，破壞細胞間的連接，從而分離表皮細胞。分離后的表皮細胞被轉移培養基中。在培養過程中，定期更換培養基，以提供細胞所需的營養，并監測細胞的生長狀態和形態。通過細胞免疫熒光染色和流式細胞儀分析，對細胞表面標志物進行鑒定，確保所分離的細胞為人ESCs。

1.2.2 制備3D打印支架材料

1.2.2.1 配制3D打印支架材料基礎液：透明質酸300 mg，DMEM 90 ml、甘油10 ml混合攪拌，恒溫振蕩器避光振蕩15 h（37℃、100 rpm）至透明質酸溶解，獲取支架材料基礎液（透明質酸濃度為3 mg/ml），4℃保存待用。

1.2.2.2 配置纖維蛋白原水凝膠：明膠、纖維蛋白原及支架材料基礎液混合均勻，37℃恒溫下經旋轉儀低速度旋轉30 min，制備成明膠35 mg/ml和纖維蛋白原濃度分別為5、10、20 mg/ml的纖維蛋白原水凝膠。室溫下用0.45μm注射器式濾器過濾，-20℃環境保存待用。

1.2.3 MTT法檢測ESCs在不同培養基中的增殖情況：將ESCs分別接種在完全的DMEM培養基和無血清的KGM2培養基中，置于37℃、5% CO2的培養箱中培養，至孔板覆蓋率達到70%～80%。培養24、48、72 h后，向每個孔中加入MTT溶液（濃度5 mg/ml）。繼續培養4 h。移除培養孔中的培養基，向每個孔中加入150μl的二甲基亞砜，搖床上振蕩10 min，溶解形成的甲烷結晶。使用酶標儀在490 nm波長下測定各孔的吸光度值。

1.2.4 混合種子細胞與支架材料：將分離培養的ESCs（ESCs濃度分別為2×106/ml、4×106/ml、6×106/ml）與制備好的纖維蛋白原水凝膠混合。混合均勻后，細胞-水凝膠混合物被裝載到3D生物打印機的注射系統中。在此過程中，確保細胞分布的均勻性，以避免在打印過程中出現細胞團塊或細胞死亡。優化細胞懸浮液的黏度和注射壓力，確保細胞在打印過程中的存活率和分布均勻性。蘇木精-伊紅（Hematoxylin-eosin，HE）染色觀察不同ESCs濃度的打印組織厚度，MTT法檢測不同纖維蛋白原濃度對3D打印皮膚組織中細胞活性的影響。

1.2.5 微擠壓打印皮膚組織：使用微擠壓3D生物打印技術，基于探索好的真皮層成纖維細胞濃度及表皮層支架材料纖維蛋白原濃度，將細胞-水凝膠混合物精確地打印到預先設計好的模板上。設置打印參數：黏度6×107 mPa/s，凝膠方法為化學、溫度、光交聯，打印速度慢，分辨率中、低，液滴大小100 μm～1 mm，精度中、低，打印細胞密度1×106 cells/ml。打印過程中，細胞-水凝膠混合物通過微細噴嘴擠出，形成連續的纖維。先打印8層成纖維細胞構建真皮層，滴加凝血酶20 U/ml交聯30 min。然后在真皮層上打印2層表皮干細胞構建表皮層，滴加凝血酶20 U/ml交聯30 min。

1.2.6 培養打印皮膚組織：打印完成的皮膚組織加入KGM2完全培養基，轉移至5% CO2、37℃培養箱中浸沒培養4 d，每2天換液1次。4 d后氣液培養，每天換液。7 d后進行后續實驗。在培養過程中，定期更換培養基，以支持細胞的增殖和分化。通過顯微鏡觀察和記錄細胞的生長情況和組織形態的變化，評估細胞在3D打印支架中的分布和生長狀態。通過調整培養條件如氧氣濃度、溫度和濕度，及添加特定的生長因子，促進細胞的分化和組織的形成。

1.2.7 3D打印皮膚組織冰凍切片制作：將培養好的組織樣本在無菌條件下冷凍在液氮中，用冰凍切片機切成5～10μm厚的切片。切片放置在載玻片上并編號，以便后續的染色和分析。在切片過程中，嚴格控制溫度和切片厚度，以保持組織結構的完整性和細胞的形態特征。

1.2.8 3D打印皮膚組織冰凍切片染色：使用HE染色和免疫熒光染色對冰凍切片進行染色。HE染色可清晰地顯示組織的細胞結構和形態，免疫熒光染色用于檢測特定蛋白質的表達。染色后的切片在顯微鏡下觀察，以評估細胞的形態、組織結構和特定蛋白質的表達。通過比較正常皮膚組織和3D打印皮膚組織，評估打印組織的生物學特性和功能。使用顯微鏡和對應的圖像分析軟件，對染色切片進行分析。

1.2.9 3D打印皮膚組織屏障功能測試：透皮水分散失（Transepidermal water loss，TEWL）法、甲苯胺藍滲透法檢測3D打印皮膚組織的屏障功能。TEWL法：將3D打印皮膚樣品放置在TEWL測試儀的測量區域，啟動設備，記錄TEWL值。測量過程中，確保樣品與測試儀的接觸面緊密貼合。計算多次測量值的平均值，作為最終TEWL結果。甲苯胺藍滲透法：將3D打印的皮膚樣品進行脫水處理，25%、50%、75%甲醇中分別浸泡2 min。將處理過的皮膚樣品浸入甲苯胺藍染料溶液中，取出后洗脫，顯微鏡下觀察皮膚樣品的染色情況，記錄染色深度和分布，通過圖像分析軟件量化染色強度。

1.3 統計學分析：用SPSS 23.0軟件對數據進行分析，符合正態分布的數據以（xˉ±s）表示，兩樣本計量資料用獨立樣本t檢驗，不同時間點多樣本計量資料比較用重復測量方差分析，兩兩樣本比較用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。所有實驗均重復3次取均值。

2" 結果

2.1 人皮膚ESCs的鑒定：ESCs分離后培養7 d，熒光鏡下顯示細胞呈現為小而圓的細胞形態，結構較為緊湊，胞體透亮，具有強折光性（見圖1）。培養8 d后ESCs融合度＞90%，以1∶2進行傳代，選取第2代細胞進行后續實驗。細胞免疫熒光染色顯示，第2代ESCs中β1整合素、角蛋白19陽性表達率＞90%（見圖2）；流式細胞儀檢測顯示，CD71低表達的同時α6整合素高表達的細胞＞90%（見圖3）。

2.2 ESCs在不同培養基中的增殖情況比較：與完全DMEM培養基比較，ESCs在無血清KGM2培養基中的組24、48、72 h吸光度值均升高（P＜0.05）。

2.3 ESCs濃度的確定：HE染色顯示，ESCs濃度為2×106/ml、4×106/ml、6×106/ml時打印組織厚度分別為（98.54±10.52）μm、（186.54±27.41）μm、（189.62±32.15）μm。與2×106/ml比較，4×106/ml、6×106/ml時打印組織厚度增加（t=5.192，P=0.07；t=4.664，P=0.10），4×106/ml、6×106/ml打印組織厚度比較，差異無統計學意義（t=0.126，P=0.906）。因此，選用4×106/ml作為后續ESCs濃度用于打印皮膚。

2.4 3D打印皮膚組織中細胞活性：重復測量方差分析結果顯示，纖維蛋白原濃度5、10、20 mg/ml時，浸沒培養4 d、氣液培養1 d，浸沒培養4 d、氣液培養7 d時ESCs活性組間、時間均不存在交互作用（P＞0.05）。當纖維蛋白原作為支架材料，濃度為5～20 mg/ml時，對ESCs的活性無明顯影響。

2.5 打印皮膚組織的表皮層厚度及結構：HE染色顯示，正常皮膚、3D打印皮膚的表皮層厚度分別為（68.45±8.94）μm、（62.59±7.11）μm，差異無統計學意義（t=0.889，P=0.424）（見圖5）；免疫熒光染色檢測皮膚表皮干細胞標志物P63，結果顯示，3D打印皮膚組織的表皮層、真皮層分層良好（見圖6）。

2.6 皮膚屏障功能：TEWL測試結果顯示，正常皮膚、3D打印皮膚的TEWL值分別為（12.58±3.51）g/m2·h、（13.41±2.97）g/m2·h，差異無統計學意義（t=0.313，P=0.770）；甲苯胺藍滲透實驗結果顯示，正常皮膚、3D打印皮膚甲苯胺藍的滲透厚度分別為（23.16±4.91）μm、（23.79±4.26）μm，差異無統計學意義（t=0.168，P=0.875）。

3" 討論

皮膚由表皮、真皮和皮下組織三層構成，當發生大面積皮膚損傷時，不僅表皮層受損，真皮層的結構也可能遭到破壞，從而影響皮膚的再生能力，這種能力主要依賴于表皮基底層的干細胞，但當損傷面積過大時，這些干細胞數量和功能無法滿足再生需求，導致修復過程緩慢或無法完成[8-9]。大面積皮膚損傷還會影響局部血液循環，導致血液供應不足，使氧氣和營養物質無法充分輸送至傷口，同時使得清除代謝廢物和死亡細胞效率降低。因此，對于大面積皮膚損傷，僅靠機體自身修復能力不足以實現完全愈合，需要通過外源皮膚移植或使用生物工程皮膚等方法來輔助修復。

人ESCs作為3D生物打印皮膚組織的種子細胞，具有多方面的優勢和重要性：自我更新能力強，可不斷地分裂和增殖，產生新的干細胞以及分化為特定類型的皮膚細胞，保證所打印的皮膚組織能夠持續生長和修復；多向分化潛能，可分化成多種類型的表皮細胞，包括角質形成細胞和黑素細胞等，能夠構建出具有復雜細胞組成的皮膚組織，可精確模擬自然皮膚的層次結構和功能；具有修復和再生能力，可響應皮膚受損的信號，并遷移到受損區域進行修復；保留了正常表皮細胞的生物學特性，包括細胞間的相互作用和細胞外基質的構建，有助于創建一個更加真實和功能性的皮膚組織模型；與使用其他類型的干細胞如胚胎干細胞相比，人ESCs避免了倫理爭議，且來源相對容易，可從人體皮膚樣本中獲取[10-12]。此外，在3D生物打印中以hESCs作為種子細胞，可實現多種細胞類型的共培養，如角質形成細胞、黑素細胞和內皮細胞等，有助于生成更接近真實皮膚的復雜結構。此外，將人ESCs的潛在分化和自我更新能力與3D生物打印技術的精確控制相結合，為皮膚組織的構建提供了新的途徑，不僅有助于治療燒傷、創傷等皮膚損傷，還有望應用于藥物篩選、疾病建模等領域，為醫學研究和臨床治療提供了新的思路和方法。本研究通過觀察分離出的形態，且第2代ESCs中β1整合素、角蛋白19陽性表達率＞90%，CD71低表達的同時α6整合素高表達的細胞＞90%，提示本研究分離培養的人ESCs具有較高的純度，可滿足后續打印皮膚組織的要求。

本研究還發現，ESCs在無血清KGM2培養基中的組24、48、72 h吸光度值均高于完全DMEM培養基，當ESCs濃度為4×106/ml、6×106/ml時打印組織厚度大于2×106/ml，纖維蛋白原濃度為5～20 mg/ml時，對ESCs的活性無明顯影響，提示使用人ESCs打印皮膚組織時無血清KGM2培養基、支架材料5 mg/ml纖維蛋白原、4×106/ml濃度的ESCs為適宜條件。蘇浩等[13]研究發現，相較于DMEM完全培養基，成纖維細胞在KGM2完全培養基中的增殖速度更快，支架材料中的纖維蛋白原濃度在真皮層和表皮層分別為5 mg/ml和10 mg/ml，成纖維細胞和ESCs濃度分別為4×10 ml、5×10/ml時，打印的皮膚組織在培養后生長良好，本研究結論與其基本一致。Cavallo A等[14]在進行3D生物打印皮膚時以30 mg/ml纖維蛋白原、6%海藻酸鹽和25 mmol/L CaCl2為生物原料，打印出的皮膚與天然皮膚結構類似。Fu H等[15]新設計的生物材料由脂肪組織dECM預凝膠、甲基丙烯酸酯明膠和甲基丙烯酸透明質酸組成，同樣可獲取滿意的皮膚打印組織，可作為今后探索方向。由此可見，在3D打印皮膚時的條件并不是固定的，后續仍需繼續嘗試，以確定最佳條件。本研究對微擠壓3D生物打印技術打印獲取的皮膚組織進行HE染色及免疫熒光染色，結果顯示其與正常皮膚具有類似的表皮層厚度與結構。皮膚作為人體的第一道防線，保護內部器官免受外界物理、化學和生物因素的侵害[16-17]。因此，評估3D打印皮膚組織的屏障功能是功能評價的重要組成部分。本研究顯示，正常皮膚、3D打印皮膚的TEWL值、甲苯胺藍的滲透厚度比較，差異均無統計學意義，提示3D打印皮膚組織的屏障功能與正常皮膚類似。

綜上，以人ESCs作為種子細胞，培養于無血清KGM2培養基，5 mg/ml纖維蛋白原作為支架材料，微擠壓3D生物打印技術打印皮膚組織，獲取的皮膚組織與正常皮膚具有類似的表皮層厚度與屏障功能。本研究的創新性在于使用人ESCs作為生物打印的主要細胞來源，為皮膚組織工程提供了一種新的模式，有望克服傳統皮膚移植和再生策略的局限性。未來的研究重點集中于提高3D打印的分辨率，以及開發新的生物材料和生物墨水，以更好地模擬天然皮膚的微觀結構和生物力學特性，并進行更多的功能性測試，包括對打印皮膚組織的生物學功能、穩定性和免疫反應進行評估，以及開展臨床前研究，以驗證其在實際醫療環境中的應用潛力。

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[收稿日期]2024-04-22

本文引用格式：郭生紅，劉國剛，汪華英，等.利用人表皮干細胞3D生物打印皮膚組織的初步研究[J].中國美容醫學，2025，34（9）：24-29.