復(fù)方倍他米松通過Nrf2/ARE/HO-1信號(hào)通路對(duì)黑素細(xì)胞抗氧化作用的機(jī)制研究

[摘要]目的：探討復(fù)方倍他米松通過核因子E2相關(guān)因子2（Nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化反應(yīng)元件（Antioxidant response element，ARE）/血紅素加氧酶-1（Oxygenase-1，HO-1）信號(hào)通路對(duì)白癜風(fēng)抗氧化作用及分子機(jī)制。方法：使用永生化的人正常黑素細(xì)胞系PIG1建立了氧化應(yīng)激模型。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（Cell counting kit-8，CCK-8）來檢測(cè)藥物的細(xì)胞毒性。通過抗氧化酶檢測(cè)試劑盒評(píng)估細(xì)胞內(nèi)氧化損傷。此外，通過流式細(xì)胞術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot，WB）來評(píng)估細(xì)胞凋亡。通過WB和免疫熒光分析Nrf2/ARE /HO-1信號(hào)通路活性，探討了復(fù)方倍他米松在黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中的潛在機(jī)制。最后，在應(yīng)用抑制劑（ML385）阻斷Nrf2途徑進(jìn)行拯救實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示復(fù)方倍他米松可以緩解過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞異常生長(zhǎng)和凋亡。此外，復(fù)方倍他米松增強(qiáng)了黑素細(xì)胞中抗氧化酶的活性，并顯著降低了細(xì)胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平。隨后，復(fù)方倍他米松有效激活了Nrf2/ARE /HO-1通路，ML385阻斷了復(fù)方倍他米松對(duì)H2O2處理的黑素細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)論：該實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持復(fù)方倍他米松通過激活Nrf2對(duì)人類黑素細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，從而表明復(fù)方倍他米松是治療白癜風(fēng)的潛在治療劑。

[關(guān)鍵詞]Nrf2/ARE/HO-1信號(hào)通路；復(fù)方倍他米松；白癜風(fēng)；黑素細(xì)胞；氧化應(yīng)激

[中圖分類號(hào)]R758.41" " [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A" " [文章編號(hào)]1008-6455（2025）09-0030-05

Study on the Mechanism of Antioxidative Effect of Compound Betamethasone on Melanocytes Through Nrf2/ARE /HO-1 Signaling Pathway

ZHANG Lina， LYV Chao， WANG Xin， SHEN Juan， ZHAO Zhonglin， LI Zhifeng， MIAO Guoying

（ Department of Dermatology， Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering， Handan 056002， Hebei， China ）

Abstract： Objective" Explore the compound betamethasone through nuclear factor E2 related factor 2 （nuclear factor E2 - related factor 2， Nrf2）/oxidation reaction components （antioxidant response element， oxygenase-1 （ARE）/Oxygenase-1 （HO-1） signaling pathway in vitiligo and its molecular mechanism. Methods" A model of oxidative stress was established using the immortem human normal melanocyte line PIG1. Cell Counting Kit-8 （CCK-8） was used to detect the cytotoxicity of the drugs. Intracellular oxidative damage was assessed using an antioxidant enzyme assay kit. In addition， apoptosis was evaluated by flow cytometry and Western blot （WB）. The activity of Nrf2/ARE /HO-1 signaling pathway was analyzed by WB and immunofluorescence to explore the potential mechanism of compound betamethasone in oxidative stress of melanocytes. Finally， we applied inhibitors （ML385） to block Nrf2 pathway for rescue experiments. Results" The results showed that compound betamethasone could alleviate the abnormal growth and apoptosis of melanocytes induced by hydrogen peroxide （H2O2）. In addition， compound betamethasone enhanced the activity of antioxidant enzymes in melanocytes and significantly reduced the level of intracellular reactive oxygen species （ROS）. Subsequently， compound betamethasone effectively activated the Nrf2/ARE /HO-1 pathway， and ML385 blocked the protective effect of compound betamethasone on H2O2-treated melanocytes. Conclusion" The experimental results support the protective effect of compound betamethasone on oxidative damage of human melanocytes by activating Nrf2， suggesting that compound betamethasone is a potential therapeutic agent for the treatment of vitiligo.

Key words： Nrf2/ARE /HO-1 signaling pathway ; compound betamethasone; vitiligo; melanocyte; oxidative stress

白癜風(fēng)是一種后天色素性皮膚病，是一種由于皮膚內(nèi)的黑素細(xì)胞功能消失或減退引起的局限性或泛發(fā)性皮膚、黏膜色素完全脫失的疾病[1]。到目前為止，表皮黑素細(xì)胞丟失作為白癜風(fēng)的關(guān)鍵因素的原因尚不清楚，這阻礙了有效治療策略的發(fā)展[2]。然而，最近的研究表明氧化應(yīng)激參與了白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制[3]。隨著黑素細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的缺乏，特別是作為抗氧化反應(yīng)主要調(diào)節(jié)因子的核因子E2相關(guān)因子2（Nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化反應(yīng)元件（Antioxidant response element，ARE）途徑的缺乏[4-5]，活性氧（Reactive oxygen species，ROS）[如過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）]在白癜風(fēng)中過度積累[6]。因此，在白癜風(fēng)中，黑素細(xì)胞易受ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響[3，5]。因此，氧化應(yīng)激在白癜風(fēng)中起著至關(guān)重要的作用。復(fù)方倍他米松（Compound betamethasone injection，CBI）是一種長(zhǎng)效類糖皮質(zhì)激素，由倍他米松磷酸二鈉及二丙酸倍他米松組成[7]。復(fù)方倍他米松在白癜風(fēng)治療中具有明顯療效[8-9]。然而，復(fù)方倍他米松在氧化應(yīng)激下對(duì)白癜風(fēng)黑素細(xì)胞的影響尚未可知。因此，本研究擬探討復(fù)方倍他米松對(duì)H2O2誘導(dǎo)的正常人黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響，以揭示其相關(guān)機(jī)制，為探討該藥治療白癜風(fēng)的機(jī)制提供依據(jù)。

1" 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理：將永生化的正常人表皮黑素細(xì)胞系PIG1（ATCC，USA）培養(yǎng)在培養(yǎng)基254（Gibco，USA）中，補(bǔ)充有人類黑素細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充劑（Gibco，USA）和5%胎牛血清在37℃的5% CO2中。在培養(yǎng)基中加入800μM或500μM的H2O2（Sigma-Aldrich，USA）48 h誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。為了確定復(fù)方倍他米松（Sigma-Aldrich，USA）對(duì)黑素細(xì)胞抗氧化損傷的保護(hù)作用，將復(fù)方倍他米松（CBI）和H2O2（800μM）以指定濃度同時(shí)加入PIG1細(xì)胞的培養(yǎng)基中。此外，用1.5μM ML385（Med Chem Express，USA）（一種抑制Nrf2活化的化合物）處理PIG1細(xì)胞，以進(jìn)一步探索復(fù)方倍他米松的機(jī)制。

1.2 細(xì)胞活力評(píng)估：使用CCK8試劑盒（7 Seabiotechnology，China）評(píng)估細(xì)胞活力。將PIG1細(xì)胞以每孔2×104個(gè)細(xì)胞的密度接種到96孔板中。將10μl CCK8溶液每個(gè)孔中，并將細(xì)胞在37℃下孵育2 h。利用680型微孔板閱讀器（BioRad，USA）檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下的吸光值。

1.3 細(xì)胞凋亡分析：使用膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素酯（Fluorescein Isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（Principal Investigator，PI）試劑盒（7 Seabiotechnology，China）測(cè)量細(xì)胞凋亡。根據(jù)制造商的說明書對(duì)處理過的PIG1細(xì)胞進(jìn)行染色，然后通過流式細(xì)胞術(shù)（Beckman-Colter，USA）進(jìn)行檢測(cè)，并用Expo32軟件（BeckmanCoulter，美國(guó)）進(jìn)行分析。

1.4 蛋白質(zhì)免疫印跡分析（Western blot，WB）：用RIPA緩沖液（Beyotime，China）提取全細(xì)胞裂解物。根據(jù)制造商的說明，使用細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒（Beyotime，China）分離細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)。使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒（Thermoscientic，USA）測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。通過SDS-PAGE（Bio-Rad，USA）分離等量的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（Polyvinylidene difluoride membranes，PVDF；Millipore，USA）上。PVDF膜在5%脫脂牛奶中封閉2 h，并將PVDF膜與用含有1% BSA的PBS稀釋的一抗在4℃下孵育過夜，一抗包括兔抗人B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2；Cell Signaling Technology，USA），兔抗人BCL2相關(guān)X蛋白（BCL2-Associated X，Bax；Cell Signaling Technology，USA），兔抗人裂解半胱天冬酶-3（cleaved Caspase-3；Cell Signaling Technology，USA），兔抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3；Cell Signaling Technology），兔抗人核纖層蛋白AC抗體（Lamin A/C；Abcam，UK），兔抗人Nrf2（Abcam，UK），兔抗人血紅素加氧酶-1（oxygenase-1，HO-1；Proteintech，China），兔抗人微管蛋白（Tubulin，Proteintech，China），兔抗人超氧化物歧化酶2（Superoxide Dismutase 2，SOD2）和兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH；Abcam，UK）。之后，再將膜與含有1%BSA的PBS稀釋的相應(yīng)過氧化物酶綴合的二抗（包括山羊抗兔IgG抗體（Sigma-Aldrich，USA）和山羊抗小鼠IgG抗體（Sigma-Aldrich，USA）在室溫下孵育2 h。最后，在Western印跡檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）下，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑（Millipore，USA）檢測(cè)條帶。

1.5 氧化應(yīng)激分析：使用商用試劑盒（Jiancheng Bioengineering Institute，Nanjing，China）按照說明書檢測(cè)細(xì)胞中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的含量。

1.6 免疫熒光：PIG1細(xì)胞在單層載玻片（NEST Biotechnology，China）中以每個(gè)培養(yǎng)皿5 000個(gè)細(xì)胞的密度生長(zhǎng)。經(jīng)過指定的處理后，用PBS洗滌細(xì)胞并用4%的多聚甲醛固定。將細(xì)胞在補(bǔ)充有0.1% Triton X-100的 PBS中在室溫下透化15 min，并用一抗抗Nrf2（1∶200，ab62352，Abcam，USA）標(biāo)記在4℃下孵育過夜，并在室溫下用相應(yīng)的二抗Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG（Abcam，USA）標(biāo)記1 h。最后，將細(xì)胞與4′，6-二脒基-2苯基吲哚（4′，6-Diamidino-2′-phenylindole，DAPI）（Thermo Fisher Scientific，USA）在室溫下在黑暗中溫育10 min。利用FV-1 000/ES激光共聚焦顯微鏡儀（Olympus，Japan）檢測(cè)熒光。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用GraphPad Prism 6.0版軟件（GraphPad software，San Diego，CA）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。本研究的數(shù)據(jù)分析使用了雙尾Student t檢驗(yàn)或單因素方差分析（ANOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)表示為至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2" 結(jié)果

2.1 不同濃度復(fù)方倍他米松對(duì)PIG1細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激形態(tài)及活力的影響：首先CCK8測(cè)定以評(píng)估用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的復(fù)方倍他米松的合適劑量。結(jié)果顯示，高劑量（1 000μM和3 000μM）復(fù)方倍他米松在第3天顯示出毒性（P＜0.05，圖1A）。為了研究復(fù)方倍他米松在氧化應(yīng)激下對(duì)黑素細(xì)胞的保護(hù)作用，用濃度梯度為25、50和100 μM的復(fù)方倍他米松處理PIG1細(xì)胞，并與800μM H2O2共處理24 h 。結(jié)果表明，用相對(duì)較高劑量的50μM或100μM的復(fù)方倍他米松處理顯著挽救了H2O2誘導(dǎo)的PIG1細(xì)胞中縮短或消失的樹突的形態(tài)變化（見圖1B）。復(fù)方倍他米松以劑量依賴的方式逆轉(zhuǎn)了H2O2引起的PIG1細(xì)胞的抑制活力（P＜0.05，圖1C）。

2.2 復(fù)方倍他米松減弱氧化應(yīng)激下黑素細(xì)胞的凋亡數(shù)量：流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，用H2O2處理后凋亡的PIG1細(xì)胞的比例顯著增加，而用50μM或100μM濃度的復(fù)方倍他米松處理顯著減弱了H2O2誘導(dǎo)的PIG1細(xì)胞的凋亡數(shù)量（P＜0.05，圖2A和2B）。此外，在PIG1細(xì)胞中，H2O2引起細(xì)胞中促凋亡Bcl-2和cleaved Caspase-3的蛋白質(zhì)水平上調(diào)，Bax的蛋白質(zhì)水平下調(diào)均被復(fù)方倍他米松（100μM）處理所逆轉(zhuǎn)（P＜0.05），見圖2C、圖2D和2E）。

2.3 復(fù)方倍他米松增強(qiáng)氧化應(yīng)激下黑素細(xì)胞的抗氧化反應(yīng)：用H2O2處理的PIG1細(xì)胞中ROS的積累，而在50μM或100μM復(fù)方倍他米松處理減弱了ROS的積累（P＜0.05），見圖3A。同時(shí)，在用H2O2處理的PIG1細(xì)胞中，SOD活性顯著降低，而50μM或100μM復(fù)方倍他米松處理顯著逆轉(zhuǎn)了這一結(jié)果（P＜0.05），見圖3B。此外，WB分析結(jié)果顯示，在用H2O2處理的PIG1細(xì)胞中，復(fù)方倍他米松共處理促進(jìn)Nrf2、p-Nrf2、SOD2和HO-1的表達(dá)（見圖3C）。隨后對(duì)細(xì)胞核和胞質(zhì)Nrf2的檢測(cè)分別揭示了復(fù)方倍他米松在 H2O2處理的PIG1細(xì)胞中誘導(dǎo)了Nrf2從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的易位（見圖3D），這一結(jié)果得到了免疫熒光測(cè)定的驗(yàn)證（見圖3E）。

2.4 復(fù)方倍他米松通過激活Nrf2/ARE/HO-1途徑防止黑素細(xì)胞氧化損傷：與對(duì)照組相比，用ML385（一種抑制Nrf2活化的化合物）處理PIG1細(xì)胞以沉默Nrf2的表達(dá)（見圖4A）。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用ML385時(shí)，復(fù)方倍他米松就不能消除H2O2處理的PIG1細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)ROS的積累（P＜0.05），見圖4B。此外，ML385消除了FA對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PIG1細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用（P＜0.05），見圖4C～D。進(jìn)一步WB分析觀察到，在H2O2處理的PIG1細(xì)胞中，ML385消除了復(fù)方倍他米松誘導(dǎo)的ARE、HO-1和SOD2的上調(diào)（見圖4E）。

3" 討論

氧化應(yīng)激是白癜風(fēng)的一個(gè)關(guān)鍵致病因素，也是白癜風(fēng)發(fā)病和進(jìn)展的原因之一[10]。過量的ROS產(chǎn)生和不足的抗氧化劑反應(yīng)共同導(dǎo)致白癜風(fēng)中黑素細(xì)胞的破壞[11]，這促使研究者致力去尋求措施來重新平衡黑素細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)。一項(xiàng)臨床研究數(shù)據(jù)分析表明白癜風(fēng)患者組MDA水平顯著升高，SOD和rGSH水平顯著降低[12]。此外，先前的研究表明白芍總苷聯(lián)合復(fù)方倍他米松治療糜爛型口腔扁平苔蘚可以改善患者的氧化應(yīng)激狀態(tài)[13]。目前的研究進(jìn)一步表明，復(fù)方倍他米松能夠通過降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平和上調(diào)HO-1和SOD2來保護(hù)黑素細(xì)胞免受氧化損傷，這兩者均在白癜風(fēng)黑素細(xì)胞中缺乏[3，5]。目前，復(fù)方倍他米松在白癜風(fēng)中的抗氧化應(yīng)激的具體分子機(jī)制稍微得到充分闡明。本研究闡明復(fù)方倍他米松在防止黑素細(xì)胞氧化損傷中的作用其可能通過Nrf2/ARE/HO-1途徑所實(shí)現(xiàn)。本研究對(duì)尋找復(fù)方倍他米松防治白癜風(fēng)患者氧化應(yīng)激水平失衡的治療靶點(diǎn)藥物具有重要意義。

細(xì)胞凋亡是氧化應(yīng)激下黑素細(xì)胞死亡的主要形式。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡Bcl-2和促凋亡BAX是凋亡途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其中Caspase-3是凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者[14]。據(jù)報(bào)道，在氧化應(yīng)激下，葉酸對(duì)人類黑素細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗凋亡能力。葉酸可以保護(hù)黑素細(xì)胞免受Hcy誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[15]。有趣的是，Li Z等[16]和Zhou D等[17]觀察到葉酸分別抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞衰老誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表明葉酸可以在各種條件下抑制細(xì)胞凋亡[16-17]。此外，本研究顯示在復(fù)方倍他米松處理可以降低氧化應(yīng)激的黑素細(xì)胞中Bax的表達(dá)，提高Bcl2的表達(dá)，抑制Caspase-3激活。這些結(jié)果表明復(fù)方倍他米松的抗凋亡能力可能是通過調(diào)節(jié)氧化損傷的黑素細(xì)胞中Bax與Bcl-2表達(dá)的比例來降低Cleaved Caspase-3的表達(dá)。

Nrf2是一個(gè)重要的抗氧化劑調(diào)節(jié)劑，作為一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄激活因子[18]。在生理?xiàng)l件下，Nrf2主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，并與Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein1，Keap1）結(jié)合，阻礙Nrf2的活化[19]。在對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)中，Nrf2與Keap1的結(jié)合脫離，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，其中Nrf2增強(qiáng)抗氧化反應(yīng)元件（AREs）的轉(zhuǎn)錄并誘導(dǎo)一系列抗氧化蛋白[20]。正如先前研究所證實(shí)的，Nrf2途徑在保護(hù)人類黑素細(xì)胞免受氧化應(yīng)激方面起著至關(guān)重要的作用[21-22]。白癜風(fēng)中的黑素細(xì)胞缺乏Nrf2的活性，因此更容易受到氧化應(yīng)激的影響，Nrf2途徑的重新引入有望提高黑素細(xì)胞在氧化應(yīng)激下的存活率[5]。Nrf2途徑的激活以Nrf2的磷酸化、Nrf2核易位以及包括SOD2和HO-1[23]在內(nèi)的抗氧化蛋白的表達(dá)為特征，本研究在復(fù)方倍他米松處理的黑素細(xì)胞中觀察到了所有這些。ML385是Nrf2的抑制劑，它抑制Nrf2與ARE的結(jié)合，降低Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性。此外，ML385還降低了Nrf2啟動(dòng)子的活性，導(dǎo)致Nrf2本身的表達(dá)降低。ML385消除了復(fù)方倍他米松對(duì)黑素細(xì)胞抗氧化損傷的保護(hù)作用，支持復(fù)方倍他米松的抗氧化作用依賴于黑素細(xì)胞中的Nrf2通路。與本研究結(jié)果相一致，曹等人發(fā)現(xiàn)也算促進(jìn)了Nrf2從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的易位，并且在自發(fā)性高血壓大鼠中提高了HO-1的表達(dá)[24]。一致的是，葉酸缺乏伴隨著Nrf2的表達(dá)降低[25]。這些發(fā)現(xiàn)表明復(fù)方倍他米松作為Nrf2途徑的強(qiáng)激活劑可以被廣泛應(yīng)用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明復(fù)方倍他米松通過激活Nrf2/HO-1途徑來減弱H2O2誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激。其他研究已經(jīng)證明，激活Nrf2及其下游抗氧化基因的表達(dá)可以提高黑素細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激的能力[26-27]。本研究證實(shí)了這一途徑在黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激中的重要性。然而，復(fù)方倍他米松是否影響黑色素合成和代謝，或者通過其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響消除氧化損傷，以及其在體內(nèi)是否有效和安全，這些問題仍然沒有得到解答，值得進(jìn)一步深入研究。

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[收稿日期]2023-06-20

本文引用格式：張麗娜，呂超，王鑫，等.復(fù)方倍他米松通過Nrf2/ARE/HO-1信號(hào)通路對(duì)黑素細(xì)胞抗氧化作用的機(jī)制研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2025，34（9）：30-34，79.025，34（7）：