富血小板血漿對大鼠皮膚缺損創面愈合過程中肉芽組織內生長因子含量的影響及其意義

[摘要]目的：探究富血小板血漿（Platelet-rich plasma，PRP）促進大鼠皮膚軟組織缺損愈合的作用及機制。方法：2024年5月-2024年6月，貴州醫科大學附屬醫院燒傷整形科采用SD清潔級大鼠60只，其中12只制備PRP，其余48只大鼠隨機分為PRP組和對照組，每組24只。在背部分別制作直徑3.0 cm的圓形全層皮膚軟組織缺損，PRP組大鼠創面等距注射0.6 ml的PRP，對照組等距注射0.6 ml的生理鹽水，在注射后的第3、5、10、14天分別測量創面大小并取創面肉芽組織，應用酶聯免疫吸附法測定組織中的PDGF-AB、VEGF、EGF生長因子濃度。結果：創面形成后第3、5、10、14天，測量PRP組創面面積較對照組明顯縮小，差異具有統計學意義（P＜0.01）；PRP組3種生長因子濃度在不同的時間點均較對照組明顯升高，其中VEGF在第3天即達到峰值，PDGF-AB及EGF在第10天達到峰值；第14天，PRP組各生長因子的濃度均開始下降，但仍都明顯高于同期的對照組，差異具有統計學意義（P＜0.01）。結論：PRP可有效促進大鼠皮膚軟組織缺損的愈合，其主要作用機制之一可能與PRP中血小板激活后逐步釋放多種生長因子使創面局部生長因子的濃度升高有關。

[關鍵詞]富血小板血漿（PRP）；創傷；生長因子；創面愈合；作用機制

[中圖分類號]R641" " [文獻標志碼]A" " [文章編號]1008-6455（2025）09-0020-04

Effect and Significance of Platelet-rich Plasma on the Content of Growth Factors in Granulation Tissue During Wound Healing of Skin Defects in Rats

MO Xiaoqun1， SUN Yu2， ZHAO Liang1， YUAN Yuan1

（ 1.Department of Burn and Plastic Surgery， 2.Department of Blood Transfusion， Affiliated Hospital of Guizhou Medical University， Guiyang 550001， Guizhou， China ）

Abstract： Objective" To study the repair effect and mechanism of platelet-rich plasma （PRP） on the skin and soft tissue injury in rats. Methods" Sixty SD clean grade rats were adopted as research materials， of which 12 were adopted to prepare platelet- rich plasma， while the remaining 48 rats were randomly divided into PRP group and control group， with 24 rats in each group. The round full-thickness skin defects with a diameter of 3 cm were made on the back of rats. Subsequently， the rats in the PRP group were injected with 0.6 ml PRP equidistant to the wound surface， while the rats in the control group were injected with 0.6 ml normal saline. On the 3rd， 5th， 10th and 14th day after injection， the size of the wound area was measured and the granulation tissues were obtained simultaneously， and then the concentrations of PDGF-AB， VEGF and EGF in granulation tissue were determined by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Results" On the 3rd， 5th， 10th and 14th day after the wound was made， the granulation was more bright red and the secretion was less in PRP group， after measuring the wound area， the wound area of the PRP group was significantly smaller than that of the control group， the difference was statistically significant （P＜0.01）. Compared with the control group， the concentrations of three growth factors in PRP group were significantly increased at different time points， the VEGF reached the peak on the 3rd day， while the EGF and PDGF reached the peak on the 10th day， moreover， on the 14th day after treatment， the concentrations of growth factors in PRP group began to decrease， but they were still significantly higher than those in the control group， the difference was statistically significant （P＜0.01）. Conclusion" The PRP is capable of effectively promoting the repair of skin injuries in rats， one of the main mechanisms may be involved in the gradual release of various growth factors after platelet activation in PRP， thus leading to the increase of local growth factor concentration in the wound area.

Key words： platelet-rich plasma（PRP）; wounds; growth factor; wound healing; mechanisms

近年來，各類創面疾病如糖尿病足、褥瘡、靜脈潰瘍、急性創傷等發病率越來越高[1]，如何促進組織有效快速再生、創面愈合修復，提高創面患者生活質量逐漸成為研究熱點[2-3]。富血小板血漿（Platelet-rich plasma，PRP）是靜脈血經2次離心得到的血小板濃縮物，PRP中血小板α顆粒經鈣例子激活后能夠促進多種生長因子的超生理釋放[4]，這些生長因子如何共同作用并促進創面的愈合，其機制復雜。本研究通過建立大鼠皮膚軟組織缺損創面模型，檢測創面不同時間點肉芽組織中的部分生長因子濃度，探討PRP促進創面愈合的機制。

1" 材料和方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器：60只清潔級健康雄性大鼠，體質量250～300 g，購自貴州醫科大學動物中心，所有大鼠均為相同的飼養條件，實驗過程符合實驗動物倫理學標準條例。大鼠PDGF-AB、VEGF、EGF酶聯免疫吸附測定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；BCA蛋白質定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；水合氯醛、低溫高速離心機、電子分析天平、超聲勻漿機、酶標測試儀、超凈工作臺、無水氯化鈣、生理鹽水。

1.2 實驗方法

1.2.1 PRP的制備：10%水合氯醛按0.3 ml/100 g向12只大鼠行腹腔注射麻醉。經心腔取血分別注入單獨的抗凝管中，每只大鼠的血液標本分別置入離心機中以離心力×200 g，離心10 min；離心后血液分3層，上層為血漿，中層為富血小板血漿層，下層為紅細胞層。用吸管吸取上層、中層以及臨近中層的部分紅細胞，將其移入另一只無菌試管中；再次以離心力×200 g，離心10 min；離心后血液分3層：上層為貧血小板血漿，中層便是富血小板血漿，下層可能會有少量的紅細胞。用吸管吸出大部分的上清液，留適量的血清和懸浮濃縮的血小板混勻，即為PRP[5-7]，分別隨機取其中3只大鼠的0.1 ml PRP稀釋后立即行血小板計數，濃度5 200×109～5 500×109/L，為大鼠全血的3～5倍，說明PRP制備成功[8]。剩余的按PRP：CaCl2=10 ml∶1 ml比例混合激活后備用。

1.2.2 動物模型建立：取48只實驗大鼠，同法進行腹腔注射麻醉。背部予脫毛處理，取俯臥位固定；用75%乙醇消毒背部脫毛區域，于背部正中最寬處設計一直徑為3.0 cm的圓形創面，切除全層皮膚至深筋膜淺層，形成皮膚軟組織缺損創面。隨后將48只大鼠隨機分為兩組，24只/組，其中實驗組在大鼠背部創面按等距的6點于局部注射PRP[9]，見圖1，注射層次為深筋膜深層、肌肉表層，局部注射形成其內含PRP的小凸起，每點0.1 ml，每只共注射0.6 ml；對照組按同樣的方法注射同等量的生理鹽水。術后予以凡士林紗布、干紗布覆蓋創面并縫合四周固定敷料；術畢后將各組大鼠單籠飼養；術后視敷料情況適時換藥。

圖1" 大鼠背部創面按等距的6點于局部注射PRP

1.2.3 創面形態觀察、測量及取材：在術后第3、5、10、14天，兩組分別隨機抽取6只大鼠，麻醉后進行創面拍照，觀察創面周圍的液體滲出、炎癥反應以及傷口愈合情況，采用Image J軟件，設定好標尺，在需要測量的創面上進行傷口邊緣勾畫計算創面面積。于肌肉表層連同深筋膜及肉芽組織全層切取完整創面大小的組織，分別保存于PBS液中，迅速放入-80℃的冰箱內冷凍保存備用。

1.2.4 組織蛋白含量、生長因子測定：于-80℃冰箱中取出冷凍備用的組織，在3℃下緩慢解凍后，磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate buffer saline，PBS）沖洗，取2 mm×2 mm組織，予組織剪剪成細碎狀，研磨器研磨成勻漿，2 500 r/min離心30 min后分離出上清液，取其中的10μl用于測定組織蛋白的含量，將BCA試劑和Cu試劑按50∶1配制成工作試劑，用工作試劑將樣品稀釋10倍，37℃溫育30 min，吸光度值選擇562 nm，用酶標儀進行測定，根據標準曲線計算出蛋白濃度。根據酶聯免疫吸附測定試劑盒上標準的操作步驟，測定勻漿后上清液中PDGF-AB、VEGF、EGF 3種生長因子的濃度，用測出的生長因子濃度值除以該組織的蛋白含量值，算出組織中每毫克蛋白中生長因子濃度。

1.3 統計學分析：采用SPSS 23.0軟件對數據進行統計學分析，圖像數據采用Image J軟件系統處理。符合正態分布的計量資料以xˉ±s表示，兩樣本間比較采用t檢驗，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2" 結果

2.1 PRP對大鼠創面愈合的影響：術后第3天，實驗組與對照組相比，創面滲出減少，紅色肉芽組織開始生長并覆蓋部分創面，創緣上皮開始收縮；術后第5～14天，兩組創面均逐漸縮小；在第10、14天，實驗組創面較對照組創面開始出現明顯的縮小，見圖2。在術后各時間點，對照組和實驗組相比創面大小的變化比較，見表1。

2.2 肉芽組織生長因子濃度：3種生長因子濃度在第3、5、10、14天不同的時間點，PRP組均明顯高于對照組。在對照組，3種生長因子在不同時間點均處于一個較平穩的水平，整個創面愈合的過程中波動不大；而在實驗組，3種生長因子在不同的時間點的濃度均明顯增高，其中PDGF-AB與EGF在第10天時達到峰值，此時 PRP組較對照組PDGF-AB的濃度高出1.63倍、EGF的濃度高出1.58倍（P＜0.01），見表2、表4；VEGF在術后第3天即達到最高，PRP組較對照組升高了1.8倍（P＜0.01），見表3；第14天，雖然PRP組各生長因子的濃度均開始下降，但PRP組仍都明顯高于對照組（P＜0.05）。

3" 討論

本實驗結果顯示創面經PRP治療后，在術后第3天，創面的各種生長因子濃度均開始升高，其中VEGF濃度在此時達到高峰；在術后的第10天PDGF-AB和EGF濃度達到峰值；在術后的第14天，PRP組中生長因子的濃度均開始下降，但仍都明顯高于同期的對照組。說明由于生長因子的釋放，PRP組創面局部組織中各種生長因子的含量都較對照組有明顯增高，同時也觀察到創面的愈合速度相應的也有明顯的增快。在實驗的過程中可以看到，兩組大鼠的創面在術后第3天和第5天縮小的速度差異不明顯，在第10天創面出現明顯的縮小，而這個階段也是組織中生長因子濃度較高的時候，由此可以推測，PRP治療后創面的愈合關鍵可能在于提高了組織中生長因子的濃度，這可能是主要的機制之一。

嚴重創傷、糖尿病、血管病變等原因引起的全層皮膚缺損是臨床常見的疾患，創面的愈合是一個協調的動態組織修復過程，由生長因子、細胞因子、驅化因子等介質的分子信號相互作用介導[10]。傷口愈合的正常過程包括3個階段：炎癥、組織形成和組織重塑，這幾個階段相互關聯和相互影響[11-12]，當正常的愈合過程被破壞時，傷口會變成慢性性質，導致炎癥期停止，創面愈合延遲[13]。既往的研究報道中，臨床中應用PRP治療慢性難愈性創面，能加快創面愈合速度，提高創面愈合率，縮短創面愈合時間[14-15]。PRP中血小板α顆粒經鈣離子激活后，釋放出PDGF、VEGF、EGF等大量生長因子［16-17］，這些生長因子和其他蛋白質（如黏附分子和趨化因子）與局部環境相互作用，促進細胞分化和增殖，通過間充質細胞募集和細胞外基質合成負責再上皮化和血管生成[18]，而血管的生成對肉芽生長至關重要；這一觀點與

習珊珊等認為PRP可通過促進再上皮化、膠原沉積和血管新生，加速大鼠背部創面愈合[19]。在組織修復過程的所有階段，各種各樣的生長因子、細胞因子和局部作用的調節因子通過內分泌、旁分泌、自分泌機制促進最基本的細胞功能[20-22]。這些生長因子在血管的新生和促進細胞的增殖等創傷組織進行修復的環節也發揮了重要的作用[23]。目前，臨床上所使用的很多生長因子產品一般為單一的生長因子，僅能促進創面某一階段的創面愈合過程，而多種生長因子共同作用修復傷口的效果優于單一的生長因子，這與多種生長因子之間的聯合促進作用且能作用于傷口愈合過程的多個階段有關[24-26]，且符合創面愈合的生物學過程。而且作為自體血小板的濃縮物，PRP中所含的多種生長因子與正常生理中的生長因子濃度比例相近，能起到更好的協同作用[27]。此外，PRP中的大量纖維蛋白可組成立體的網狀結構，為細胞生長提供良好的支架，可維持生長因子的釋放[28]，還可以促進創面的收縮及凝血；PRP中還含有大量的白細胞，可增加創面的抗感染能力[29]，白細胞還能產生大量的VEGF[30-31]。在最新的研究中[32]，有學者通過對富血小板血漿促進創面愈合的機制進行概述和分析，總結如下：①PRP在創面愈合中具有許多潛在的優勢，能夠提供豐富的生長因子和細胞因子等生物活性物質。②PRP可以調節參與創面愈合的各種細胞類型的功能，包括表皮細胞、血管內皮細胞、成纖維細胞、干細胞和炎癥細胞等。③在PRP療法中，細胞外囊泡、線粒體對于創面愈合可能扮演著重要角色。④負載PRP水凝膠可廣泛用于增強組織再生和作為藥物傳遞的功能性載體。⑤PRP對創面細胞外基質合成和降解起調節作用，從而影響傷口愈合過程中基質重建。⑥PRP可能通過動態調節多種信號通路和上皮間質轉化來影響組織修復與再生，從而為創面愈合的研究提供了全新的視角。

本研究通過實驗組創面變化可以觀察到，在術后的第3天，實驗組創面就形成了較多的新生肉芽組織，肉芽鮮紅，創面較對照組分泌物少且愈合速度快，而對照組創面表面灰暗、分泌物較多，在第5天才出現明顯的肉芽組織，且之后的不同時間點，實驗組的創面縮小均較對照組明顯。從生長因子濃度的測定結果可以看到，當組織內生長因子達到峰值后創面也隨即出現快速的收縮，也更加證實了創面的愈合與PRP的生長因子濃度密切相關，同時也提示了在臨床治療過程中，最初使用PRP時可能看不到創面明顯的變化，但隨著創面組織內生長因子濃度的增長，達到峰值后創面即開始快速愈合，這個現象提示臨床使用PRP應1～2周使用一次，3～4次為一療程[33]。

在創面修復漫長且復雜的過程中，PRP可為創面的組織持續提供大量的生長因子，生長因子發揮各自的作用并相互協同，加速組織修復的過程，但PRP促進創面的修復也與其釋放的各種趨化因子，如血清素、組胺、多巴胺等生物活性物質有關，這些物質可以直接誘導血小板聚集，也可以參與組織修復的多重反應。因此，PRP促進創面修復的機制是極其復雜的，還有待更進一步的研究。

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[收稿日期]2024-11-13

本文引用格式：莫驍群，孫宇，趙亮，等.富血小板血漿對大鼠皮膚缺損創面愈合過程中肉芽組織內生長因子含量的影響及其意義[J].中國美容醫學，2025，34（9）：20-24.