基于指紋圖譜、化學模式識別及網絡藥理學的銀黃含化滴丸質量標志物預測分析

中圖分類號：R9 文獻標志碼：A

Quality markers prediction of Yinhuang Hanhua dropping pill based on fingerprint， chemical pattern recognition and network pharmacology

Zhou Lijiel.2，Hou Xiaojiel.3， Zhang Jianfeng1.2.4，Hou Changzhoul，Dai Hua4，Mou Huagang1， Feng Guol，3，Wang Jiankel.3，An Hai2， Zhao Man2，andLiu Xunfeng1

（1 SchoolofPharmacyGuizhouUniversityofraditionalChneseMedicie，Guiyang55o25;2GuizouValidPharmaceticalCo.L， Guiyang 55oo14;3Guizhou Traditional Chinese Medicine Procesing Technology Inheritance Base，Guiyang ; 4College ofPharmacy，Guizhou University， Guiyang ）

AbstractObjectiveTo predict the quality markers （Q-markers）of Yinhuang Huanhua dropping pills based on fingerprint chromatography，chemical patern recognition and network pharmacology methods.MethodsThe fingerprints of Yinhuang Huahua dropping pills were established by HPLC，the main marker substances of quality diffrence between batches were screenedby chemical pattern recognition，andthe network pharmacology method was usedto establish thenetworkof‘ingredient-coretarget-pathway'，toexplorethecore ingredientsofthis preparation for the treatment ofdiseases; Taking into account the existing literature，the Q-marker ofthe Yinhuang Huanua dropping pill was analyzed from the perspectives ofcompounding principle，ingredient validityand measurability.ResultsThe fingerprint chromatograms of 12 batchesof Yinhuang Huanhua dropping pills were established.Eleven components were identifiedfrom the15labeledcommonpeaks marked，including chlorogenicacid，cryptochlorogenicacid，cafeic acid，neochlorogenicacid，isochlorogenicacidB，sochlorogenicacidA，sochlorogenicacidC，baicalin，wogonin， baicalein and wogonoside;among them，cryptochlorogenicacid，neochlorogenic acid，baicalinand chlorogenicacid might be the marker substances that affect the quality differences among batches.Network pharmacology studies suggested that11substances might exert clinicaleficacybyactingonkeytargets，suchasTP53，AKT1，STA3，SRC and ESR1，as wellasthrough the pathogenesis ofancer，Kaposisarcoma-associated hrpesvirus inection，P3K/Akt signaling pathwayhumancytomegalovirus infection，TNFsignaling pathwayandIL-17signalingpathway.Basedon the Q-marker concept， wogonoside，baicalein，chlorogenic acid，cryptochlorogenic acidand baicalin were predicted as potential Q-markers of Yinhuang Huanhua dropping pils. ConclusionThe Q-markers of Yinhuang Huanhua dropping pillwere preliminarily predicted， which provided a certain reference for improving the quality standardof the preparation， further exploring the material basis and mechanism of action.

Key words Yinhuang Hanhua dropping pill; Fingerprint chromatography; Chemical pattern recognition Network pharmacology; Quality marker

銀黃含化滴丸是金銀花、黃芩提取物質加工精制得到的現代復方制劑[1]，有清熱解毒、消炎的功效，臨床常用來治療咽炎，急、慢性扁桃體炎和上呼吸道感染等疾病[2]，具備較好的開發利用前景。目前，關于銀黃含化滴丸有關報道較少，有學者對其藥代動力學[1]、質量控制[2-3]及藥理作用[4進行了研究。在質量控制方面，龍厚寧等[2-3]采用UPLC法建立了銀黃含化滴丸指紋圖譜，測定了6個有機酸類以及4個黃酮類成分的含量，但該制劑中藥質量標志物（qualitymarker，Q-marker）的整體分析仍有待進一步開展。

Q-marker是劉昌孝院士及團隊提出對中藥及復方制劑標志性物質進行質量控制的有效方法[5-7]。中藥指紋圖譜為進一步建立、實現復方制劑穩定性和一致性以及開展Q-marker的重要方法[8，但對于研究復方制劑批次間質量差異性標志物質存在一定局限性[8]。近年來借助聚類分析（hierarchicalclusteranalysis，HCA）、主成分分析（Principalcomponent analysis，PCA）、正交偏最小二乘法判別分析（Orthogonalpartial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）等方法聯合指紋圖譜的研究模式，可進一步豐富和完善指紋圖譜研究，能從整體觀的基礎上篩選反映中藥復方制劑質量的標志性物質[9.1]，為科學預測中藥復方的Q-marker提供有效依據[12]；網絡藥理學契合中藥復方多組分、多路徑的作用特點，能預測和揭示中藥及復方制劑化學成分的有效性[13]，是研究和發現中藥復方Q-marker的有效方法。鑒此，本研究建立銀黃含化滴丸HPLC指紋圖譜，結合化學模式識別及網絡藥理學，分析預測該制劑的Q-marker，以期為優化該制劑現行質量評價方法提供一定參考。

1材料

UItiMate3000高效液相色譜儀賽默飛世爾科技（中國）有限公司]、ME204E型萬分之一電子分析天平[梅特勒托利多國際商貿（上海）儀器有限公司]、SK8200LHC超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）、WP-UP-LH-20超純水機（四川沃特爾科技發展有限公司）。

綠原酸（批號110753-202119，中國食品藥品檢定研究院，純度 96.3% ，黃芩苷對照品（批號110715-202223，中國食品藥品檢定研究院，純度 97.2% \"黃芩素、咖啡酸對照品（批號24030628、24061118，北京百歐博偉生物技術有限公司，純度均 ?98% ）新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、漢黃芩苷、漢黃芩素（批號24081303、24011920、24061405、24080712、24032023、24082914、24071303，成都曼思特生物科技有限公司，純度均 ?98% ；色譜級磷酸、甲醇及乙腈（天津市科密歐化學試劑有限公司）；銀黃含化滴丸（120丸/瓶，S1～S12樣品的生產批號為20230203、20230204、20230306、20230401、20231101、20231204、20240103、20240104、20240106、20240107、20240108、20240111，）。

2方法與結果

2.1銀黃含化滴丸指紋圖譜研究

2.1.1 色譜條件

采用Agilent C₁₈ 分析柱（ 4.6mm×250mm ， 5μm ）流動相為 0.4% 磷酸水溶液（A）-乙腈（B），洗脫程序如下： 0～25min ， 10% B； 25～65min ， 10%～24% B;65～85min ， 24%～33% B； 85～105min ， 33%～40% B； 105～130min ， 40%～60% B，流速 0.6mL/min 檢測波長 235nm ，柱溫 35^°C ，進樣量 10μL 。

2.1.2供試品儲備液的制備

精密稱定本品（S1）粉末（過4號篩）約 0.8g ，置 100mL 具塞棕色容量瓶中，精密移取 10mL80% 甲醇溶液，超聲處理 53kHz ， 40% ， ，冷卻至室溫后， 80% 甲醇溶液補重、搖勻后過濾，濾液過 0.22μm 微孔濾膜，備用。

2.1.3對照品儲備液的制備

精密稱取適量綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素配制為單個對照品溶液，移取適量置于 5mL 棕色量瓶，配成質量濃度分別為21.6、9.6、11.82、7.6、5.5、4.3、6.4、52.2、8.1、2.1和 3.2μg/mL 的混合對照品儲備液。

2.1.4陰性對照儲備液的制備

參照銀黃含化滴丸的處方比例，分別稱取金銀花提取物，黃芩提取物各 0.02g ，按照“2.1.2”項下制備陰性對照儲備液。

2.1.5 精密度試驗

精密稱取樣品（S1）粉末適量，按照“2.1.2”項下方法制備供試品儲備液，照“2.1.1”項下色譜條件進樣檢測，以黃芩苷為參照峰計算得到各共有峰相對保留時間RSD均 ?1.29% ，相對峰面積RSD均≤2.56% ，表明儀器精密度良好。

2.1.6穩定性試驗

精密稱取樣品（S1）粉末適量，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.1.1”項下色譜條件于0、4、8、12、24和36h進樣檢測，以黃芩苷為參照峰計算得到各共有峰相對保留時間RS D?1.68% ，相對峰面積RSD ?2.63% ，表明36h內供試品儲備液檢測質量穩定。

2.1.7 重復性試驗

精密稱取樣品（S1）粉末適量，按照“2.1.2”項下方法平行制備6份供試品儲備液，照“2.1.1”項下色譜條件進樣檢測，以黃芩苷為參照峰計算得到各共有峰相對保留時間 2SD?1.39% ，相對峰面積RS D?2.95% ，表明該方法重復性良好。

2.1.8 銀黃含化滴丸HPLC指紋圖譜的生成及相似度評價

照“2.1.2”項下方法制備12批銀黃含化滴丸樣品供試液，于“2.1.1”項下色譜條件檢測并收集“CDF”格式的色譜圖，在“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版本）”軟件中，以圖譜S2作為參照指紋圖譜（R），以時間窗寬度為0.1、中位數法結合多點校正進行Marker峰匹配，得到銀黃含化滴丸特征圖譜及12批樣品HPLC疊加指紋圖譜，標定共有峰15個（圖1），共指認出11個共有峰（圖2）；由于在指紋圖譜相似度評價中色譜峰11（黃芩苷）相較于其余色譜峰的峰高和峰面積差異明顯，使得相似度計算結果均為1[14]，影響了結果的準確性，故選擇去除峰11后計算相似度，相似度計算結果均 ?0.938 （表1），說明銀黃含化滴丸制備工藝相對穩定，該制劑不同生產批次具備高度相似性，質量一致性較好。

2.2化學模式識別

Fig.1Stacking diagram ofHPLC fingerprint of12 batches of Yinhuang Hanhua dropping pill

圖112批銀黃含化滴丸HPLC指紋圖譜疊加圖

注：峰1為新綠原酸，峰3為綠原酸，峰4為隱綠原酸，峰5為咖啡酸，峰8為異綠原酸B，峰9為異綠原酸A，峰10為異綠原酸C，峰11為黃芩苷，峰13為漢黃芩苷，峰14為黃芩素，峰15為漢黃芩素。

圖212批銀黃含化滴丸供試品、混合對照品、陰性對照溶液的HPLC色譜圖

Fig.2HPLCchromatogramsof12batchsoftestsamplesofYiuangHanhuadroppingpill，mixedeferencesubstancesandngative control solution

表112批銀黃含化滴丸HPLC指紋圖譜相似度結果 Tab.1 HPLC fingerprint similarity results of 12 batches of Yinhuang Hhanhua dropping pill

2.2.1 HCA

采用SPSS26.0軟件以組間聯接、平方歐式距離法對12批樣品的15個共有峰峰面積進行HCA。當平方歐式距離為10，可將樣品S4單獨聚為一類，其余樣品為一類（圖3）；平方歐式距離為5，可將樣品S4單獨聚為一類，S1、S2和S11聚為一類，其余樣品為一類；這提示生產制備工藝相同時，S4同其余樣品的共有峰峰面積存在較大差異，而銀黃含化滴丸除S4外其余樣品共有峰峰面積差異相對較小。初步推測，該制劑批次間共有峰峰面積差異同原材料質量、藥品生產存儲等存有一定聯系。

2.2.2 PCA

圖3HCA圖Fig.3HCAdiagram

在SPSS26.0軟件中設置特征值 gt;1 ，對12批樣品的15個共有峰峰面積進行PCA。PCA提取到累計方差貢獻率為 87.539% 的3個信息（表2），在一定情況下能基本反映15個共有峰峰面積的主要特征，運用SIMCA14.1軟件制作PCA圖（圖4）。成分載荷矩陣反映了各主成分與15個共有峰即原始變量之間的相關系數，載荷的絕對值越大，對主成分的貢獻越大[14]，由表3可知，主成分1主要反映了峰1（新綠原酸）、2、3（綠原酸）、4（隱綠原酸）、5（咖啡酸）、6、8（異綠原酸B）、9（異綠原酸A）和10（異綠原酸C）的信息，主成分2主要反映了峰11（黃芩苷）、12、13（漢黃芩苷）、14（黃芩素）、15（漢黃芩素）的信息，主成分3主要反映了峰7、14（黃芩素）的信息。PCA圖顯示，除S4之外的其余樣品點均處于 95% 置信區間，表明樣品S4與其余11批次銀黃含化滴丸的質量存在一定差異，應獨自分為一組，這與相似度分析、HCA的結果基本一致。

表2特征值及貢獻率

Tab.2 Characteristic values and contribution rates

表3成分載荷矩陣

圖4PCA得分圖Fig.4PCAscorediagram

Tab.3 Component load matrix

2.2.3 OPLS-DA

在HCA基礎上，運用SIMCA14.1軟件對12批樣品的15個共有峰峰面積作為變量的數據進行OPLS-DA處理（圖5A），進一步分析引起銀黃含化滴丸批次間質量差異的可能化學成分。OPLS-DA分析模型穩定性的參數為R 2X=0.827 ， R²Y=0.914 ， Q²=0.83 ，均gt;0.5，表明所建立的模型穩定性高且預測能力良好[14]，利用隨機排列200次置換檢驗進一步判別模型過擬合現象是否存在（圖5B），結果顯示Q回歸線在Y軸截距為- .0.615lt;0^[15] ，過擬合現象不存在，用于判別分析12批樣品的批次間差異具備可行性[14]。參照OPLS-DA得分圖，12批樣品可聚為3類，其中樣品S4聚為1類，S1、S2、S11聚為1類，其余樣品聚為1類。投影中的變量重要性（variable importance in projection，VIP）能夠反映每個共有峰的貢獻程度[10]，設置判定標準為VIPgt; 1（圖5C），得到峰4（隱綠原酸，VIP值為2.10379）、峰1（新綠原酸，VIP值為1.53268）、峰11（黃芩苷，VIP值為1.43747）、峰2（VIP值為1.32498）、峰3（綠原酸，VIP值為1.12309），且上述成分距原點均較遠（圖5D），與批次樣品質量差異聯系密切，為該制劑潛在質量差異標示物[14]；其中新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸和峰2源于金銀花提取物，黃芩苷源于黃芩提取物，提示生產過程中嚴格控制金銀花、黃芩提取物的質量是保證該制劑質量穩定的關鍵。

圖5OPLS-DA得分圖（A）、200次置換檢驗圖（B）、VIP值圖（C）和載荷散點圖（D） ig.5OPLS-DAscore diagram（A），20odisplacementtest diagramt （B），VIPvalue diagram（C）andloadscaterdiagram（

2.3網絡藥理學研究

2.3.1 活性成分靶點預測

通過TCMsP數據庫（http：//old.tcmsp-e.com./tcmsp.php）分別檢索、收集已指認11種化學成分的作用靶點，在Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org）定義物種為“Homosapines”，規范獲得的成分靶點基因名；由于從TCMSP數據庫中收集的成分作用靶點較少，本研究通過PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取11個成分的SMILES編號，利用Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）和SEA（SimilarityEnsembleApproach）數據庫收集潛在活性成分作用靶標，合并TCMSP數據庫收錄的靶點信息，去除重復靶點后，共得到384個成分潛在作用靶點。

2.3.2 疾病靶點的獲取

臨床上銀黃含化滴丸常用來治療咽炎，急、慢性扁桃體炎和上呼吸道感染。在GeneCards在線數據庫（https：//www.genecards.org/）、OMIM在線數據庫（https：//www.omim.org/）中輸入關鍵詞“pharyngitis”、“acute tonsillitis”、“chronictonsillitis”、“upper respiratory tract infection”，將OMIM數據庫中收集到的全部靶點作為疾病靶點，GeneCards數據庫中收集到的疾病靶點分別取“Relevance score gt;10 ”，匯總去除重復后，共得到4133個與疾病相關的靶標。

分別將成分靶點和疾病靶點上傳至Venny2.1.0在線平臺（https：//www.liuxiaoyuyuan.com.cn/），取交集后獲得靶標206個，利用STRING在線分析平臺（https：//cn.string-db.org/），設置物種為“Homosapines”、最高置信度蛋白交互參數評分值 gt; 0.9、隱藏網絡中游離節點的蛋白互作數據[13]，利用Cytoscape3.10.2軟件對其進行可視化（圖6），以“AnalysisNetwork”進行拓撲分析，計算并選取介數中心性≥0.0031295，接近中心性 ?0.3161905 ，且度值 ?10 作為核心靶點[13]，參照Degree值對PPI網絡節點降序排列，得到細胞腫瘤抗原P53（TP53）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、信號轉導及轉錄激活因子3（STAT3）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（SRC）、雌激素受體（ESR1）等45個核心靶點。

2.3.3 GO和KEGG富集分析

圖6核心蛋白互作PPI網絡

利用DAVID在線分析平臺（https：//david.ncifcrf.gov/）對206個交集靶點開展GO和KEGG富集分析。GO富集分析共獲得377個條目 （Plt;0.01） ，得到237個生物過程（biologicalprocess，BP）、34個細胞組分（cellularcomponent，CC）和106個分子功能（molecularfunction，MF）。BP主要富集在凋亡過程負向調控（negative regulation ofapoptoticprocess）、蛋白質磷酸化（proteinphosphorylation）、胰島素樣生長因子受體信號通路（insulin-likegrowthfactorreceptorsignalingpathway）等過程；CC主要富集在細胞質（cytoplasm）、胞質（cytosol）、含蛋白復合物（protein-containingcomplex）等過程；MF主要富集于酶結合（enzymebinding）、同源蛋白結合（identicalproteinbinding）、ATP結合（ATPbinding）（圖7）。KEGG富集條目共156條 （Plt;0.01） ，分析結果表明（圖8），銀黃含化滴丸治療咽炎，急、慢性扁桃體炎，上呼吸道感染可能與癌癥的發病途徑、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinaseB，Akt）信號通路、人巨細胞病毒感染、腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactor，TNF）信號通路以及白介素17（interleukin-17，IL-17）信號通路等有關。

Fig.6 Core target protein interaction PPI network

圖7GO富集分析Fig.7GO enrichment analysis

2.3.4“成分-核心靶點-通路”網絡構建及分析

將銀黃含化滴丸中11個物質及核心靶點、20條信號通路運用Cytoscape3.10.2軟件，繪制成分-核心靶點-通路網絡（圖9）。選擇“連接度”作為參考指標，漢黃芩素、黃芩素、咖啡酸、綠原酸、隱綠原酸在該網絡中度值排名靠前，可能是銀黃含化滴丸治療上呼吸道感染，急、慢性扁桃體炎及咽炎的潛在活性成分。

2.3.5Q-marker成分與核心靶點分子對接驗證

從PDB數據庫（https：//www.rcsb.org/）中收集TP53（PDBID：1GZH）、AKT1（PDBID：3OCB）、STAT3（PDBID：6NJS）、SRC（PDBID：4MXO）及ESR1（PDBID：1XPC）的蛋白三維結構，分別與銀黃含化滴丸潛在Q-marker：漢黃芩素、黃芩素、綠原酸、隱綠原酸及黃芩苷進行分子對接，其對接結合能結果（表4）顯示，上述分子對接結合能 lt;0kcal/mol 表明受體與配體能自發結合[5]，其中TP53與5個潛在Q-marker對接結合能均 ，表明其與5個潛在Q-marker能形成穩定的對接結構，進一步通過PyMOL軟件對分子對接結果進行可視化分析，見圖 10。

3討論

3.1指紋圖譜及化學模式識別分析

本實驗對不同溶劑（包括水、 20% 、 40% ！60% 、 80% 甲醇-水溶液）提取，超聲10、20和 30min 制備的供試品溶液，結果顯示 80% 甲醇提取液黃芩苷的含量最高，超聲 30min 基本提取完成；最終采用 80% 甲醇-水溶液，超聲 30min 作為提取方式；考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇 .0.4% 磷酸水溶液以及乙腈- .0.4% 磷酸水溶液等流動相洗脫系統，其中乙睛 .0.4% 磷酸水溶液作為洗脫溶劑時，各色譜峰分離度效果最佳；還對紫外波長（235、280和 326nm 進行了考察，發現綠原酸等有機酸類在 326nm 處有最大吸收峰[2-3]，黃芩苷等黃酮類在 280nm 處有最大吸收峰，當檢測波長為 235nm 時，相較于326和 280nm 兩類成分響應值有所降低，但各峰間比例協調，所呈現出的峰信息量大[16]，峰形與分離度均良好，因此以 235nm 作為檢測波長。

本研究通過建立12批銀黃含化滴丸HPLC指紋圖譜，從標記的15個色譜峰中，指認出7種有機酸類（包括綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、咖啡酸）和4種黃酮類物質（包括漢黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素、黃芩苷）；隱綠原酸、新綠原酸、黃芩苷、峰2、綠原酸的VIP值均 gt;1 ，為引起批次間銀黃含化滴丸共有峰峰面積差異的重要物質，由于未結合質譜定性分析，無法對峰2進行確認，后續將加強此方面研究。研究顯示，金銀花提取物制備過程中可能存在新綠原酸和隱綠原酸逆轉化為綠原酸，而綠原酸受pH、溫度的影響可能存在部分水解外，主要被氧化為還原性較弱的新綠原酸和隱綠原酸等[17]，黃芩提取物質量差異可能與提取進程中水洗、醇洗次數及用量有關[18]；另外，生產過程中投料比、制劑質量穩定性、藥品的存儲等是造成上市產品質量差異的主要因素，在今后的生產制備中應關注原料藥質量穩定性、可相對固定原料藥制備工藝及廠家、嚴格控制生產參數等[9]，保證制劑質量穩定。

圖9“成分-核心靶點-通路”網絡Fig.9 “Component-core target-pathway” network

表4銀黃含化滴丸潛在Q-marker與靶點受體蛋白間的結合能 Tab.4Binding energy between Yinhuang Hanhua dropping pil Q-marker and target receptor protein

3.2銀黃含化滴丸的Q-marker預測分析

3.2.1基于復方配伍原則預測銀黃含化滴丸的 Q-marker

注：漢黃芩素-TP53（A），黃芩素-TP53（B），綠原酸-TP53（C），隱綠原酸-TP53（D），黃芩苷-TP53（E）。圖10潛在Q-marker成分與核心靶點分子對接可視化圖Fig.10Visualization of potential Q-marker components docking with core target molecules

銀黃含化滴丸是在銀黃含化片的基礎上調整劑型而來[2]，根據銀黃含化滴丸的方解，組方君藥金銀花能解毒清熱、芳香清輕，配伍清上焦肺熱，能除濕熱、瀉實火的黃芩[20]，使該制劑具備解毒清熱，消炎的功效。結合指紋圖譜，可將金銀花中綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、異綠原酸C、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸B作為主藥化學成分，黃芩中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素作為輔藥，根據復方制劑配伍原則將其排序為君藥（綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、異綠原酸C、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸B） gt; 臣藥（黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素）。

3.2.2基于質量傳遞與溯源、成分特有性預測銀黃 含化滴丸Q-marker

特征指紋圖譜顯示，新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B、異綠原酸A及異綠原酸C源于金銀花提取物，可將新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C等有機酸類成分作為金銀花特有成分[21-22]；漢黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷及黃芩素源于黃芩提取物，是黃芩的重要物質基礎，可作為黃芩的特有成分[23]。

3.2.3基于成分可測性預測銀黃含化滴丸Q-marker

王淑等[24采用UPLC法測定了金銀花藥材中12種成分，其中包括綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、異綠原酸C、咖啡酸、異綠原酸B和異綠原酸A；徐境榮等[25]采用HPLC法測定了黃芩中8種黃酮類成分，其中包括黃芩素、漢黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷；龍厚寧等[2-3]建立了16批銀黃含化滴丸UPLC指紋圖譜，結合化學對照品確認了7種有機酸類和4種黃酮類物質，同時對黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和漢黃芩苷、隱綠原酸、新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的含量進行測定，符合Q-marker的可測性原則，可作為銀黃含化滴丸潛在Q-marker的依據。

3.2.4基于有效性預測銀黃含化滴丸的Q-marker

網絡藥理學研究表明，銀黃含化滴丸中11種成分可能通過TP53、STAT3、SRC、AKT1等關鍵靶標以及癌癥的發病途徑、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、PI3K-Akt信號通路、人巨細胞病毒感染、TNF信號通路、IL-17信號通路等治療疾病；TP53具有調控細胞凋亡，影響細胞周期停滯等活性，其活化后能調節機體抗氧化應激能力，干預炎癥反應的進程[2；在肺部炎癥發生發展過程中STAT3具有重要作用，其能介導肺泡巨噬細胞的急性炎癥反應，引起急性肺損傷[27；AKT1參與了PI3K/Akt信號通路的信號傳導，該靶標影響炎癥反應進程可能同抑制細胞凋亡，支持細胞存活，避免凋亡細胞堆積等有關[27]。病毒感染是引起上呼吸道感染主要因素之一，PI3K/Akt信號通路與病毒侵染細胞、機體免疫應答發生發展有關，可能通過抑制細胞過早凋亡進一步支持病毒復制28]；TNF信號通路被激活后，能破壞機體免疫平衡，參與炎癥反應進程[29]；IL-17信號通路能夠影響中性粒細胞生成，并將其募集到炎癥部位，引起炎癥反應進一步異常發展[30]。“成分-核心靶點-通路”網絡中漢黃芩素、黃芩素、咖啡酸、綠原酸和隱綠原酸度值排位靠前，可能是銀黃含化滴丸臨床治療疾病的重要物質基礎；漢黃芩素能干預TNF-αmRNA表達，抑制TNF-α的產生，減輕病毒性肺炎的炎癥反應[31]，還能增加核因子E2相關因子2（nuclearfactorerythroid2-relatedfactor2，Nrf2）的表達及核轉位，降低脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）-ATP誘導的小鼠單核巨噬細胞（RAW264.7巨噬細胞）產生活性氧，減少核因子kB（Nuclearfactor kappa-B，NF-kB）核轉位，干預RAW264.7巨噬細胞的炎癥反應進程[32]；黃芩素對流感病毒、呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）及新型冠狀病毒活性具有一定抑制作用[3-36]，能調節PI3K/Akt、NF-KB等通路的活化以及TNF-α、IL-6及IL-1β等炎癥介質的釋放發揮抗炎作用[37]；咖啡酸抗病毒、抗菌抗感染活性顯著[38]，對LPS致小鼠肺損傷具有保護作用，其效應機制與抑制NF-kB、MAPKs及核苷酸結合寡聚結構域樣受體蛋白3炎癥小體通路的活化影響炎癥反應進程及調節活性氧表達水平，活化Nrf2抗氧化途徑改善氧化損傷關聯密切[39]；隱綠原酸能維持機體免疫平衡、緩解機體氧化損傷，進而改善H9N2-AIV滴鼻致小鼠肺損傷[40]；現代藥理研究發現，金銀花具有抗炎解熱、抗感染、保護肺臟等藥理活性[41-42]，其主要指標成分綠原酸能抑制流感病毒[43]、乙肝病毒和RSV的活性[44-45]，能調節炎癥反應異常發展、抑制病毒復制、破壞細菌細胞膜以及干擾細菌遷移等發揮抗感染作用[46-47]；黃芩苷為黃芩指標性成分[48]，也是黃芩含量最高的黃酮類成分，其抗菌、抗病毒、抗炎的藥理作用明顯[49]，能調節Toll樣受體4/NF-kB信號通路，影響炎癥反應進程，對支原體致小鼠肺炎具有保護作用[50]；黃芩苷、黃芩素還具備一定解熱抗炎活性[51]，其效應機制可能與干預花生四烯酸代謝、核因子的活化、調節細胞因子的分泌及釋放存在關聯[52]，黃芩苷口服生物利用度相對較弱，TCMSP、swisstargetprediction、SEA數據庫收錄潛在活性靶點較少，這可能是引起“成分-核心靶點-疾病通路網絡”度值排名靠后的原因之一，文獻報道可將黃芩苷作為黃芩Q-marker[53-56]，Zhao等[4]研究表明，黃芩苷是銀黃含化滴丸治療咽炎的主要活性成分，其效應機制與抑制TNF- ??a 、AKT1和COX-2，調節花生四烯酸、色氨酸代謝、抑制PI3K-AKT/NF-KB/MAPK信號通路有關；以上物質具有抗病毒、抗菌、抗炎等作用，是銀黃含化滴丸產生“清熱解毒”，“消炎”功效的重要物質基礎，可作為銀黃含化滴丸的潛在Q-marker。

本研究基于指紋圖譜、化學模式識別及網絡藥理學研究的綜合分析預測可將漢黃芩素、黃芩素、綠原酸、隱綠原酸、黃芩苷作為銀黃含化滴丸Q-marker。目前，銀黃含化滴丸全方化學成分及入血成分研究較少，孟小夏等采用LC-MS技術快速測定大鼠口服銀黃含化滴丸后，血漿中黃芩苷的含量。一測多評法（quantitative analysis ofmulticomponents by single marker，QAMS）是一種多指標質量評價的有效手段，可用于中藥復方Q-marker的定量分析[57-58]，后續將開展銀黃含化滴丸入血成分研究，并通過建立QAMS測定5個Q-marker的含有量，以期為豐富銀黃含化滴丸入血成分的研究及其質量標準的提升提供基礎實驗支撐。

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