匹維溴銨增效貝達喹啉抗結核活性的發現及作用機制研究

中圖分類號：R978.3 文獻標志碼：A

Discovery of pinaverium bromide as a potentiator of bedaquiline against tuberculosis and its mechanism of action

LiangWenwen，ZhangYe，QiXianglong，LuYu，andXuJian （Beijing Chest HospitalAfliated toCapitalMedicalUniversityBeijingTuberculosis ChestCancer Institute，Beijing101149）

Abstract Objective To screen the potentiator of the anti-tuberculosis drug bedaquiline （BDQ）and investigate the synergistic anti-tuberculosis activity and potential mechanism of action of pinaverium bromide in combination with BDQ. MethodsAn in vitro model using the Mycobacterium tuberculosis Rv0678 mutant was established to screen for BDQ potentiators. An MmpS5 knockout strain （△S5） with disrupted MmpL5-MmpS5 function was constructed.The activityof pinaverium bromide in combination with BDQ was evaluated in M. tuberculosis strains with different expression levels of MmpL5-MmpS5.The checkerboard assy was used to assess the combined activity of pinaverium bromide with various anti-tuberculosis drugs.The anti-tuberculosis activity of pinaverium bromide in combination with BDQ was further evaluated using an in vitro time-killkinetic assay.ResultsPinaverium bromide at 1/12× MIC （0.5μg/mL ）reduced theMICofBDQagainst the RνO678 mutant by 32-fold，which was even lower than the MIC of BDQ against M. tuberculosis H37Rv （0.06μg/mL ）.No synergistic activity Was observed in the knockout strain△S5 with disrupted MmpL5-MmpS5 function.Pinaverium bromide showed synergistic activity when combined with BDQ，clofazimine，and PBTZ169，which are substrates of the MmpL5-MmpS5 eflux system， but did not show synergy with other anti-tuberculosis drugs.Time-killcurves showed that the combination of pinaverium bromide and BDQhad synergistic bactericidal activity.ConclusionPinaverium bromide potentiates significantly the antituberculosis activityofBDQthrough the inhibition ofthe MmpL5-MmpS5complex.The discovery of his potentiator provides a new potential strategy for the development of novel anti-drug-resistant tuberculosis agents.

Key WordsMycobacterium tuberculosis; Pinaverium bromide; Bedaquiline; MmpL5-MmpS5; Synergy

結核病（tuberculosis，TB）是一種嚴重危害人類健康的慢性傳染性疾病，已成為全球重大公共衛生問題?！?024年全球結核病報告》顯示2023年全球估算新發結核患者1080萬例，其中耐多藥結核病/利福平耐藥結核病患者約40萬例[1。耐藥結核病的全球蔓延增加了結核病防控工作的復雜性和嚴峻性。貝達喹啉（bedaquiline，BDQ）是50多年以來被FDA批準的第一個全新機制的抗結核新藥。2019年開始WHO將BDQ列為治療耐多藥結核病核心藥物中的A組[2]。相比較于傳統的耐藥結核病治療方案，含BDQ的方案可以很大程度地提高耐藥結核病的治療率、縮短治療時間。但是隨著BDQ的廣泛使用，很快就鑒定出了BDQ耐藥株（Rv0678突變），更為嚴重的是，尤其是未使用過該藥的結核患者體內分離到了BDQ耐藥株[3-5]。臨床上首先發現與BDQ耐藥相關，并且報道最多的是結核分枝桿菌Rv0678基因突變[。Rv0678突變可以導致含BDQ的化療方案的抗結核活性降低甚至治療的失敗[7-8]。

結核分枝桿菌有14個分枝桿菌膜蛋白大蛋白（mycobacterialmembraneprotein large，MmpL）基因，MmpL5是Rv0676c基因編碼的跨膜轉運蛋白，分枝桿菌膜蛋白小蛋白MmpS5（mycobacterialmembraneproteinsmall5）是Rv0677c基因編碼的膜融合蛋白，二者位于同一操縱子內。MmpL5和MmpS5共同組成外排轉運系統，隸屬于RND超家族[9]。Rv0678的突變引起MmpL5和MmpS5在耐藥結核分枝桿菌中表達上調2倍以上[1o]，MmpS5的表達促進了MmpL5的同源三聚體化，使其組裝成三元復合物以外排抗結核藥物[9]，MmpL5和MmpS5共表達才能形成外排系統，導致耐藥，而MmpL5單獨不發揮作用[10-11]。在耐藥結核病治療藥物有限，新藥研發困難的情況下，以抑制MmpL5-MmpS5的功能，開發能夠增強BDQ療效并抑制耐藥性產生的新型治療策略具有重要臨床意義。

本研究建立了篩選BDQ增效劑的 RνO678 基因突變結核分枝桿菌模型，首次從上市藥物中的4103個化合物里篩選出與BDQ協同活性較強的胃腸道鈣離子拮抗劑匹維溴銨， 0.5μg/mL 匹維溴銨與BDQ聯合使用能將BDQ的對 RνO678 突變株的最小抑菌濃度（MIC）降低至1/32，比BDQ對結核分枝桿菌 H37Rv 的MIC（0.06μg/mL） 還低。目前，匹維溴銨對抗結核藥物具有增敏效果的還未見研究報道。本實驗通過在MmpL5-MmpS5表達程度不同的結核分枝桿菌評估匹維溴銨對BDQ等不同抗結核藥物的增效活性，時間殺菌曲線評估其聯合增效活性，表明匹維溴銨通過抑制MmpL5-MmpS5發揮聯合增效BDQ的抗結核活性。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 實驗菌株、細胞

菌株：結核分枝桿菌標準株H37Rv（ATCC27294）培養在Middlebrook 7H9+10% OADC（oleicacid，albumin，dextrose，catalase，油酸、清蛋白、葡萄糖、過氧化氫酶），由北京市耐藥結核病重點實驗室保存并提供。結核分枝桿菌 RνO678 突變株：由H37Rv在BDQ的自發突變實驗中獲得，突變位點為 RνO678 基因的c305t，全基因組測序排除其他基因突變。結核分枝桿菌mmpS5基因敲除株△S5：采用噬菌體介導敲除了mmpS5基因，破壞了MmpL5-MmpS5的外排功能。構建過程如下：首先構建同源交換位點（AES），PCR擴增左右臂。

左右臂PCR產物經限制性內切酶酶切后回收并與Van91I酶切的質粒p0004s連接并轉化E.coliDH5α感受態細胞，篩選陽性克隆子，經限制性內切酶（PacI）酶切并回收，并與同樣PacI酶切的質粒phAE159連接、包裝并轉化E.coliHB101細胞，篩選獲得陽性噬菌粒。酶切驗證后，將噬菌粒電轉化感受態恥垢分枝桿菌 mc² 155 細胞，鋪板，培養2～3d后，篩選噬菌斑，擴增制備高滴度噬菌體。將MP緩沖液洗滌后重懸的結核分枝桿菌H37Rv與噬菌體裂解液混勻后，置于 37°C 靜置過夜。離心去上清，加入 10mL 7H9培養基（含 0.05% Tween80），復蘇 24h ，離心收集菌體，用培養基重懸后均勻涂布于含潮霉素的7H11平板上， 37^°C 培養。挑選陽性單克隆進行基因組提取和PCR驗證，獲得mmpS5基因敲除株（△ S5）。

細胞：非洲綠猴腎細胞（Vero細胞）、人類肝臟的癌細胞系（HepG2細胞）購自北京協和細胞資源中心。

1.1.2 實驗藥物

匹維溴銨（PVB，純度 ?97% 購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；貝達喹啉（BDQ，純度?99% ），氯法齊明（CFZ，純度 gt;98% ，左氧氟沙星（LFX，純度 gt;98% 均購自上海瀚香生物科技公司；利福平（RFP，純度 ?97% ，異煙膚（INH，純度?99% 均購自美國Sigma公司；PBTZ169由中國醫學科學院醫藥生物技術研究所合成。

1.1.3 儀器

萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）、立式壓力蒸汽滅菌器（致微（廈門）儀器有限公司）、生物安全柜[益世科（江蘇）生物科技有限公司]、二氧化碳恒溫培養箱（美國Nuaire公司）、多功能酶標儀[帝肯（上海）實驗器材有限公司]。

1.1.4 試劑

7H9液體培養基干粉、7H10固體培養基干粉均購自美國BD公司、OADC增菌液購自上海晶諾生物科技有限公司；DMEM高糖培養基、二甲基亞砜（DMSO）、吐溫-80、N-苯基-1-萘胺均購自北京索萊寶科技有限公司；丙三醇購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1增效劑的篩選和活性測定

采用微孔板阿爾瑪藍（microplatealamarblueassay，MABA）法使用 RνO678 突變株，從上市藥物庫中篩選抗結核藥物BDQ的增效劑。初篩即固定BDQ濃度，將化合物首孔設為 進行二倍稀釋，選擇濃度 ?2.5μmol/L 的化合物進行下一步篩選；復篩測定化合物單獨MIC及固定化合物濃度為 4μmol/L 將BDQ首孔設為 8μg/mL 進行二倍稀釋，選擇化合物?10μmol/L ，BDQ的MIC降低至1/8及以上的化合物進入第二次復篩。固定化合物濃度為2，1， 0.5μg/mL 將BDQ首孔設為 8μg/mL 進行二倍稀釋，隨后添加菌液（濃度為 2×10⁵CFU/mL ， 37°C ， 5%CO₂ 培養箱中培養 7d ，每孔添加 32.5μL 指示劑 0.2mg/mL 刃天青：20% Tween- 80=20：12.5 ，現配現用），培養1d，觀察顏色變化，最后一個保持藍色孔中藥物的濃度即為該藥的MIC值。同樣采用MABA法測定匹維溴銨、BDQ對結核分枝桿菌 H37Rv 、 RνO678 突變株、敲除株 Δ S5的MIC。

1.2.2 棋盤法測定兩藥組合的聯合作用

采用微量棋盤稀釋法在96孔板中測定匹維溴銨與6種抗結核藥物聯合使用后的MIC，將藥物用DMSO溶解成儲備液后于96孔板中進行二倍稀釋，按照棋盤方式進行交叉聯用，兩者的濃度分別為各藥物的 2×MIC～1/16 MIC。通過觀察96孔板中的藍色孔變化情況確定兩藥聯合后的單藥MIC。聯合運用計算分級抑菌濃度指數（fractionalinhibitoryconcentration index，FICI），FICI=MICA聯合/MICA單藥+MIC_BBE，Δ/MIC_B??? ， FICI?0.5 表示兩藥為協同作用。

1.2.3時間殺菌動力學評估兩藥聯合的抗菌活性

采用時間殺菌曲線法進一步評估匹維溴銨聯合BDQ對Rv0678突變株的體外聯合抗菌效果，匹維溴銨濃度設計為1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC；BDQ的濃度設計為 1× MIC、1/2MIC。

根據上述濃度設計各藥單用及聯合用藥濃度，將處于對數生長期的Rv0678突變株接種于各濃度梯度的組合藥物，將加入結核分枝桿菌和藥物的24孔板置于 37^°C 、 5% CO₂ 的恒溫培養箱中孵育 14d 。在給藥當天（D0）、第3天、第5天、第7天和第14天，吸取 100μL ，10倍遞減稀釋為4個濃度梯度的藥液，再均勻地涂布在7H10培養基上，在 37^°C 、 5%CO₂ 的恒溫培養箱培養3～4周后，進行CFU計數。以時間為橫坐標， lgCFU/mL 為縱坐標，繪制時間殺菌曲線。

兩藥相互作用的定義：與兩藥組合中抗菌活性最好的單藥相比，藥物聯合作用使活菌數減少量 ?2 lgCFU/mL 被認為是協同作用； 活菌數減少量 lt;2lgCFU/mL 被認為是相加作用；活菌數減少量 ?1lgCFU/mL 被認為是無關作用；活菌數增加量?2lgCFU/mL 被認為是拮抗作用[13]。

1.2.4MTT法測定匹維溴銨的細胞毒性

本部分研究采用MTT法檢測匹維溴銨對不同細胞系的半抑制濃度 （IC₅₀） 值。Vero細胞通常用于細胞毒性測試模型，容易培養，穩定性好，被廣泛用于細胞毒性研究。HepG2細胞來源于人類肝臟，保留了部分肝臟細胞的特性，適合用于研究藥物在肝臟中的代謝和毒性。為考察匹維溴銨的肝細胞毒性，選用HepG2細胞特異性評估匹維溴銨的肝臟毒性。將Vero、HepG2細胞用含 10% FBS的DMEM培養基培養使其終濃度為 4×10⁵ 個 /mL 。將匹維溴銨儲備液首孔進行50倍稀釋，使其首孔為 100μg/mL ，再依次進行3倍稀釋。調整細胞密度為 4×10⁴ 個 /mL ，以每孔50μL 接種于96無菌微孔板中，混勻后置于 37° ，5% （20 CO₂ 的恒溫培養箱中培養 ^48h 。各孔中均加入10μL 的 5mg/mL MTT，培養4h后，棄去培養基，加入100μL 的DMSO，搖動 |5min ，酶標儀測定 ?_A490 的吸光值，計算IC50°。

1.2.5 統計學處理

采用SPSS26.0軟件對數據進行統計分析，GraphPadPrism8.0對數據進行繪圖，CFU計數進行對數轉換后分析，計量資料符合正態分布，采用“ ”描述。各指標組間差異的比較采用單因素方差分析，進一步的組內兩兩比較采用樣本t檢驗，Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1MABA法測定藥敏結果

運用建立的BDQ增效劑篩選模型，從上市藥物中的4103個化合物里（不包括中藥）篩選出與BDQ協同活性較強的化合物匹維溴銨（圖1）。匹維溴銨本身對結核分枝桿菌H37Rv和 RνO678 突變株的MIC為6μg/mL （表1）。 1/12MIC（0.5μg/mL） 的匹維溴銨能使BDQ對MmpL5-MmpS5過表達的Rv0678突變株的MIC降低至1/32，比BDQ對結核分枝桿菌敏感株 H37Rv 的MIC（0 .06μg/mL 還低。1/12MIC的匹維溴銨能使BDQ對H37Rv的MIC降低至1/16而在敲除株 沒有表現出聯合活性，提示匹維溴銨通過抑制MmpL5-MmpS5發揮作用。匹維溴銨在 的濃度下呈現劑量依賴性效應關系的聯合增效BDQ活性。

2.2匹維溴銨與抗結核藥物的聯合相互作用Rv0678突變株對BDQ、CFZ、PBTZ169對均有不同程度的耐藥，相比較于H37Rv的MIC提高了8～16倍，對INH、LFX無影響。在結核分枝桿菌H37Rv和Rv0678突變株中，匹維溴銨與MmpL5-MmpS5外排底物BDQ、CFZ、PBTZ169聯合均有協同作用，并且在Rv0678突變株中的協同活性優于H37Rv，匹維溴銨與BDQ的協同作用最強（表2）。在結核分枝桿菌H37Rv中，匹維溴銨與RFP、INH、LFX聯合均是無關作用，在Rv0678突變株中，匹維溴銨與INH、LFX聯合均是無關作用（表2）。

圖1匹維溴銨結構圖Fig.1Structure of pinaverium bromide

表1BDQ聯合不同濃度的匹維溴銨對不同結核分枝桿菌的MIC值 （μg/mL） （2號Tab.1TheMICs （μg/mL） ofBDQcombinedwithdifferentconcentrationsofPinaveriumbromideagainstdifferentMycobacteriumtuberculosisstrains （|g/mL） ！

注：PVB-匹維溴銨。

2.3匹維溴銨聯合BDQ對Rv0678突變株的時間殺菌曲線

基于Rv0678突變株中匹維溴銨聯合增效BDQ的顯著作用，進一步考察單藥及聯合用藥組對 RνO678 突變株的時間殺菌動力學。 1/4MIC（1.5μg/mL） 、1/8MIC（0.75μg/mL） 和1/16MIC（ 0.375μg/mL 的匹維溴銨沒有殺菌活性，盡管BDQ對 RνO678 突變株的MIC為 1μg/mL ，其在 1μg/mL 時仍然有微弱的殺菌活性（圖2）。作用14d后， 1/4MIC 、1/8MIC和1/16MIC的匹維溴銨聯合 1μg/mL BDQ相比較于BDQ單藥組對 RνO678 突變株具有協同殺菌活性，降低2.8～2lgCFU ，比未治療組可以降低 5.3～4.5lgCFU 。1/4MIC 、1/8MIC匹維溴銨聯合 0.5μg/mL BDQ對RνO678 突變株作用14d具有協同增效活性，比BDQ單藥組分別降低3.2、 2.1lgCFU 。

表2匹維溴銨聯合6種不同抗結核藥物對結核分枝桿菌

H37Rv和Rv0678突變株的FICI值

Tab.2 FICI values of pinaverium bromide in combination withsix different anti-tuberculosisdrugsagainstMycobacterium tuberculosisH37Rvand RνO678 mutant

注：FICI-部分抑制濃度指數；PVB-匹維溴銨；BDQ-貝達喹啉；CFZ-氯法齊明；RFP-利福平；INH-異煙肼；LFX-左氧氟沙星。

2.4匹維溴銨的細胞毒性

MTT法測定細胞毒性實驗發現，匹維溴銨對Vero、HepG2細胞的半數抑制濃度 （IC₅₀） 分別為36.3、16.1μg/mL ，遠高于其發揮作用濃度 （0.5μg/mL） ，細胞毒性較低。

3討論與結論

耐藥結核病的治療現狀復雜且面臨諸多困難，治愈率低，其中BDQ等新藥的上市為耐藥結核病治療帶來了希望，但其耐藥性的出現和發展，迫切需要開發新型藥物及藥物組合提高耐藥結核病的治愈率，縮短治療時間。但新抗菌藥的研發時間長、難度高且昂貴，無法應對日益嚴重的細菌耐藥問題。

“老藥新用”策略開發已上市藥物的新用途已經成為新藥研發的一種有效的替代方案?？咕雒魟┡c現有抗生素聯合使用方案為治療耐藥菌的感染帶來了希望。比如研究表明治療2型糖尿病二甲雙肌能作為抗菌增敏劑聯合替加環素通過抑制外排泵協同作用于肺炎克雷伯耐藥菌[14]。

抗菌增敏劑是一類能增加現有藥物抗菌活性的化合物。這類化合物通常本身不具備顯著抗菌作用，不對細菌施加直接的選擇壓力，不容易有耐藥株的出現，但與抗生素聯合使用時，可以通過逆轉細菌耐藥性從而恢復耐藥菌對抗生素的敏感性[15]，同時減緩細菌耐藥性發展進程，是對抗耐藥細菌有效且可持續的策略[16]。

臨床上與BDQ耐藥相關，并且報道最多的是結核分枝桿菌 RνO678 基因突變[]。Rv0678基因是MmpL5-MmpS5外排系統的轉錄抑制因子，其突變能引起mmpL5和mmpS5的過表達[17]。Rv0676c基因編碼的MmpL5與 Rν0677c 基因編碼的MmpS5，二者位于同一操縱子內，共同組成外排轉運系統[18]。研究前期對MmpL5-MmpS5的作用與功能發現，不論是恥垢分枝桿菌還是結核分枝桿菌中，mmpL5和mmpS5共表達才能形成外排泵，導致BDQ的耐藥，而MmpL5單獨不發揮作用[11]。因此本研究構建了MmpL5-MmpS5功能破壞的MmpS5基因敲除株，采取mmpL5-mmpS5過表達的Rv0678突變株、mmpS5基因敲除株及mmpL5-mmpS5正常表達的H37Rv株進行研究。1/12MIC的匹維溴銨能使BDQ對mmpL5-mmpS5過表達的Rv0678突變株的MIC降低至1/32優于mmpL5-mmpS5正常表達的H37Rv，而在MmpL5-MmpS5功能破壞的敲除株△S5沒有表現出聯合活性，表明匹維溴銨通過抑制MmpL5-MmpS5發揮作用。 Rν0678 基因突變可導致多個抗結核藥物耐藥，如BDQ與CFZ的交叉耐藥[17]、PBTZ169低水平耐藥[19-20]，不影響INH、LFX的藥物敏感性。我們研究發現匹維溴銨與BDQ、CFZ、PBTZ169聯合均有協同作用，并且在mmpL5-mmpS5過表達的Rv0678突變株中的協同活性優于mmpL5-mmpS5正常表達的H37Rv ，與INH、LFX無聯合作用。BDQ、CFZ、PBTZ-169對Rv0678突變株的MIC分別提高16、10、8倍，而匹維溴銨聯合增效活性強弱順序也類似（FICI值大小）。這些結果進一步表明匹維溴銨的聯合增效作用是通過抑制MmpL5-MmpS5發揮作用。

匹維溴銨是一種選擇性胃腸道鈣通道括抗劑，可抑制鈣流入腸平滑肌細胞，從而減輕腸平滑肌的收縮，主要用于治療腸易激綜合征和功能性腸道痙攣[21]。Chen等發現匹維溴銨可通過抑制嗜中性粒細胞啟動，抑制促炎性細胞因子的產生，來減弱脂多糖誘導的過度全身炎癥，并保護肝臟和肺免受脂多糖誘導的損傷，減少器官特異性炎癥反應并提高了膿毒癥小鼠的存活率[22]。最近研究也發現匹維溴銨對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和糞腸球菌具有抗菌活性，并且證明其抗菌和抗生物膜作主要由質子驅動力破壞和誘導活性氧產生介導[23-24]。結核分枝桿菌電子傳遞鏈產生跨膜質子梯度導致膜電位的建立，質子梯度和膜電位組成質子動力勢。匹維溴銨對BDQ的增效作用可能涉及結核分枝桿菌質子動力勢破壞和誘導活性氧產生。質子動力勢是ATP合酶驅動ATP合成的能量來源，質子動力勢破壞直接阻礙ATP的合成[25-26]。BDQ抑制ATP合酶阻止ATP合成[27]，兩藥聯合可協同降低菌內ATP含量。RND超家族外排泵底物轉運依賴于質子動力勢，因此質子動力勢破壞可抑制MmpL5-MmpS5外排作用。既往研究中BDQ處理結核分枝桿菌將誘導ROS產生[28]，匹維溴銨與BDQ兩藥聯合處理后可能會進一步導致ROS含量升高，直接引起氧化損傷。以往的研究表明匹維溴銨在臨床治療上未出現明顯的不良事件且也被證明具有良好的耐受性[29-30]，本次研究表明在發揮聯合增效的濃度下，匹維溴銨在Vero細胞和HepG2細胞毒性低。

在代謝途徑上，貝達喹啉主要通過細胞色素450（CYP）3A4進行肝臟代謝，而匹維溴銨未報告顯著酶抑制/誘導作用。從作用機制看，匹維溴銨可能破壞分枝桿菌膜穩定性，促進貝達喹啉（依賴質子梯度發揮作用）的細胞內積累，匹維溴銨抑制MmpL5-MmpS5外排系統，減少貝達喹啉的主動外排。同時給藥可能使協同效應最大化。下一步需要開展兩藥的藥動學相互作用與給藥順序研究，探究其臨床轉化用藥的可能性。

本研究還存在以下不足： ① 僅進行體外協同作用，缺乏動物體內實驗驗證，應建立小鼠結核病模型，進行體內藥效學研究。 ② 表明了匹維溴銨的聯合增效是通過抑制MmpL5-MmpS5發揮作用，可能通過協同降低菌體ATP水平及累積ROS發揮作用，但具體機制后續還需進行實驗驗證。

綜上，本研究建立BDQ增效劑篩選模型，發現匹維溴銨具有顯著的增效BDQ抗結核和協同殺菌活性，通過抑制MmpL5-MmpS5發揮作用。本研究為進一步研發抑制MmpL5-MmpS5的抗結核藥物增效劑，發展耐藥結核病治療新策略提供了有力依據。

參考文獻

[1]] World Health Organization.Global tuberculosis report 2024[R/OL].Geneva：World Health Organization， 2024.https：//www.who.int/teams/global-tuberculosisprogramme/tb-reports/global-tuberculosis-report-2024.

[2] WorldHealth Organization.WHO consolidated guidelines on tuberculosis[EB/OL].2022.https： //www. who. int/ publications/i/item/9789240063129.

[3] Xu J，WangB，Hu M，et al. Primary clofazimine and bedaquiline resistance among isolates from patients with multidrug-resistant tuberculosis[J].Antimicrob Agents Chemother，2017， 61（6）： e00239-17.

[4]Ghajavand H， Kargarpour Kamakoli M， Khanipour S，et al.High prevalence of bedaquiline resistance in treatmentnaive tuberculosis patients and verapamil effectiveness[J]. AntimicrobAgentsChemother，2019，63（3）：e02530-18.

[5]Xu J， Converse PJ， Upton A M， et al. Comparative efficacy of the novel diarylquinoline TBAJ-587and bedaquiline against a resistant Rv0678 mutant in a mouse model of tuberculosis[J].AntimicrobAgentsChemother，2021，65（4）： e02418-20.

[6] Sonnenkalb L， Carter JJ， SpitaleriA，et al.Bedaquiline and clofazimine resistancein Mycobacterium tuberculosis：an in-vitro and in-silico data analysis[J].Lancet Microbe，2023， 4（5）： e358-e368.

[7] VillellasC，CoeckN，MeehanCJ，etal.Unexpected high prevalence of resistance-associated Rvo678 variants in MDR-TB patients without documented prior use of clofazimineorbedaquiline[J].JAntimicrob Chemother， 2017，72（3）：684-690.

[8] Omar SV，Ismail F，Ndjeka N，et al.Bedaquiline-resistant tuberculosis associated with Rv0678 mutations[J].N Engl J Med，2022，386（1）： 93-94.

[9] Yamamoto K，Nakata N，Mukai T，et al. Coexpression of MmpS5andMmpL5contributes to bothefflux transporter MmpL5 trimerization and drug resistance in Mycobacterium tuberculosis[J].mSphere，2021，6（1）： e00518-20.

[10] Xu J， Li D，Shi J， et al. Bedquiline resistance mutations： correlations with drug exposures and impact on the proteome inM.tuberculosis[J].Antimicrob Agents Chemother，2023， 67（7）： e0153222.

[11] 李東碩，王彬，陸宇，等.結核分枝桿菌膜蛋白MmpS5- MmpL5的表達及功能研究[J].中國防癆雜志，2022，44（3）： 227-233.

[12] Maltempe F G， Caleffi-Ferracioli KR，Do Amaral R C R， et al.Activity of rifampicin and linezolid combination in Mycobacteriumtuberculosis[J].Tuberculosis（Edinb），2017， 104： 24-29.

[13].Bhusal Y， Shiohira C M， Yamane N.Determination of in vitro synergy when three antimicrobial agents are combined against Mycobacterium tuberculosis[J]. Int JAntimicrob Agents，2005，26（4）： 292-297.

[14] Xiao X， Huan Q， Huang Y， et al. Metformin reverses tmexCDl-toprJl-andtet（A）-mediated high-level tigecycline resistance in K. pneumoniae[J]. Antibiotics （Basel），2022， 11（2）： 162.

[15] 周紅，覃容欣.抗菌增敏藥藥效學非臨床研究技術指南 [J].中國抗生素雜志，2023，48（1）：8-12.

[16] Liu Y， Tong Z， Shi J， et al. Drug repurposing for nextgeneration combination therapies against multidrug-resistant bacteria[J].Theranostics，2021，11（10）： 4910-4928.

[17] Andries K， Vilellas C， Coeck N， et al. Acquired resistance ofMycobacterium tuberculosis to bedaquiline[J].PLoS One， 2014，9（7）： e102135.

[18] Briffotaux J， Huang W， Wang X， et al. MmpS5/MmpL5 as an eflux pump in Mycobacterium species[J]. Tuberculosis （Edinb），2017，107： 13-19.

[19] Poulton N C，Azadian ZA，DeJesus MA，et al.Mutations in Rv0678 confer low-level resistance to benzothiazinone DprE1 inhibitors in Mycobacterium tuberculosis[J]. Antimicrob Agents Chemother，2022， 66（9）： e0090422.

[20] Chen X， Li Y， Wang B， et al. Identification of mutations associated withmacozinone-resistantin Mycobacterium tuberculosis[J]. Curricrobiol，222，79（7）：205.

[21] Bor S，Lehert P， ChalbaudA，et al.Efficacyof pinaverium bromide in the treatment of irritable bowel syndrome： a systematic review and meta-analysis[J]. Therap Adv Gastroenterol，2021，14： 17562848211033740.

[22] Chen X， Liu Y， Dolin H，et al. Pinaverium bromide attenuates lipopolysaccharide-induced excessive systemic inflammation via inhibiting neutrophil priming[J]. J Immunol，2021，206（8）：1858-1865.

[23] Mao T，Chai B，XiongY，etal.Invitro inhibitionof growth， biofilm formation，and persisters of Staphylococcus aureus by pinaveriumbromide[J].ACSOmega，2023，8（10）：9652-9661.

[24] Pengfei S， Yifan Y， Shasha L， et al. Repurposing pinaverium bromideagainstStaphylococcusand itsbiofilmswithnew mechanisms[J].AMBExpress，2024，14（1）：141.

[25] Gong H，Li J， XuA，et al.An electron transfer path connects subunits of a mycobacterial respiratory supercomplex[J]. Science，2018，362（6418）：eaat8923.

[26] YangB，TongZ，Shi J，et al.Bacterial proton motive forceas an unprecedented target tocontrol antimicrobial resistance[J].MedResRev，2023，43（4）：1068-1090.

[27]Koul A，Dendouga N， Vergauwen K，et al.Diarylquinolines targetsubunitcofmycobacterialATP synthase[J].NatChem Biol， 2007， 3（6）： 323-324.

[28] 劉海婷，李東碩，張蕾，等.吡法齊明與貝達喹啉協同作用及 機制的初步研究[J].中國防癆雜志，2022，44（7）：646-653.

[29]Kamolsripat T，Thinrungroj N，Pinyopornpanish K，etal. Efficacy and safety of pinaverium bromide asan add-on therapyinrefractory dyspepsia：A randomized controlled trial[J].JGHOpen，2024，8（3）：e13051.

[30]Qin D，Tao Q，Huang S，et al.Eluxadoline versus antispasmodics in the treatment of irritable bowel syndrome： anadjusted indirect treatment comparison meta-analysis[J]. FrontPharmacol，2022，13：757969.