耐碳青霉烯黏質沙雷菌對頭孢他啶敏感性差異的機制研究

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

Mechanism of different sensitivity of carbapenem-resistant Serratia marcescens to ceftazidime

Zhang Yan， Zheng Jie，Wang Danwei， MengLingning，Gao Shuo， Liu Chang， Zhou Wanqing， Cao Xiaoli， and Shen Han （DepartmentofClinicalLaboratory，NanjingDrumTowerHospital，AffliatedHospitalofMedicalSchool， NanjingUniversity，Nanjing）

Abstract Objective To analyze the mechanism of different sensitivity of carbapenem-resistant Serratia marcescens （CRSM） to ceftazidime.MethodsFifty-three strains of CRSM clinicall isolated from Nanjing Drum Tower Hospital，Afiliated Hospital ofMedical School，Nanjing University from June 2018 to September2019 were collected.The drug sensitivitytestof ceftazidime wasperformed by Vitek 2.0 Compact withthe GN13 drug-sensitive plate and disk difusion method. RNA of 53 CRSM strains was extracted， and the expression of the bla_?KPC-2 gene was detected by fluorescence quantitative PCR after reverse transcription. Genomic DNA of 53 strains of CRSM was extracted for repetitive extragenic palindromic elements-PCR （REP-PCR）.According to the typing results of REP-PCR，6 strains （3 with identical genetic background and 3 with completely diferent genetic background） were selected to extract genomic DNA for whole genome sequencing. The flanking sequence of the bla_?KPC-2 gene was analyzed.ResultsOf the 53 CRSM strains，24 were sensitive to ceftazidime，21 were intermediate，and 8 were resistant. Analysis of bla_KPC-2 gene expression in 53 strains of CRSM showed that Ct values between the ceftazidmesensitive group and drug-resistant group and Ct values between the intermediate group and drug-resistant group had statistical differences （ Plt;0.0001 ）. There was no significant difference in Ct values between the sensitive group and the intermediate group （ P=0.4116 ）. The REP-PCR results showed genetic diversity， with type I （27 strains） and type I （1l strins）being the most common.The results of whole genome sequencing of6 strains of CRSM showed that all these strains carried 5 identical drug resistance genes， namely ac （6） -Ic， bla_SRT-1 bla_?KPC-2 bla_CTX-M-14， and qnrS1. Flank sequence analysis showed that the flank sequence of the 6 strains of blaKPC-2 was the same. Conclusion The difference in sensitivity of CRSM bacteria to CAZ in our hospital may be causedby the diference in expression of bla_?KPC-2 . Although the flanking sequence structure of bla_?KPC-2 in the six strains analyzed was basically the same， the presence of bla_CTX-M and the expression of AmpC enzyme may also be the reasons for the difference in sensitivity of CRSMto ceftazidime，which shouldbe furtheranalyzed.

Key wordsSerratia marcescens; Carbapenem resistance; REP-PCR; Fluorogenic quantitative PCR; bla_?KPC-2

黏質沙雷菌（Serratiamarcescens）屬于腸桿目細菌，是機會性感染致病菌，作為醫院內重要的致病菌，在免疫力低下的人群中常引起尿路感染、呼吸道感染、菌血癥、心內炎、結膜炎、腦膜炎和傷口感染等多種感染[1-3]。由于AmpC酶的高表達，導致該菌對第一、第二代及部分第三代頭孢等耐藥，碳青霉烯類藥物成為治療該菌所致感染的主要治療藥物[4-5]。然而，近年來隨著碳青霉烯類抗生素在臨床的廣泛使用，碳青霉烯耐藥黏質沙雷菌（carbapenemresistantS.marcescens，CRSM）的臨床分離率和耐藥率逐步上升[6-9]，給臨床治療帶來很大困難。目前，關于S.marcescens對耐碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機制中，碳青霉烯酶的產生是細菌對碳青霉烯類藥物耐藥的主要耐藥機制[10-12]。全球以KPC、NDM和OXA-48為最流行的碳青霉烯酶，幾乎可水解所有β-內酰胺類藥物，使臨床的治療面臨巨大挑戰[13-17]。

本研究中，前期結果發現53株CRSM中均攜帶KPC-2耐藥基因[18]，但這53株CRSM對頭孢他啶敏感性存在差異，針對此差異，我們展開研究，以期探索CRSM對頭孢他啶敏感性差異的分子機制。

1材料與方法

1.1 菌株來源

收集大學醫學院附屬鼓樓醫院2018年6月一2019年9月臨床分離的非重復CRSM菌株53株。所有菌株經Vitek2Compact鑒定。

1.2主要儀器及試劑

Vitek2Compact全自動微生物鑒定分析儀（法國BioMerieux生物公司）；2720型PCR擴增儀（美國AppliedBiosystems公司）；C1oooThermalCycler，電泳儀及GelDocXR型凝膠成像分析系統（美國Bio-Rad公司）；血平板、MH平板、藥敏紙片（美國ThermoFisher公司）；胰蛋白酶大豆肉湯（青島海博）； 2×Taq Mix（德國DBI公司）；EDTA、PCR引物合成及序列測定由上海生工生物工程公司合成；4SGelGreen核酸染料（英國BBI公司）；瓊脂糖干粉（法國Biowest公司）；5000bpDNAMarker（大連Takara公司）；DNA提取試劑盒，RNA提取試劑盒（湖南艾科瑞）。

1.3細菌藥敏試驗

采用K-B法進行頭孢他啶藥物敏感性試驗復核。藥物敏感性檢測判讀標準依據CLSIM1002018版[19]。大腸埃希菌（ATCC25922）和銅綠假單胞菌（ATCC27853）為藥敏試驗質控菌株。

1.4熒光定量PCR

使用RNA提取試劑盒提取53株CRSM的RNA，將提取后的RNA放入， .80^°C 中保存。使用PCR反應體系中 30μL） ： 5× EvoM-MLVRTMasterMix （6μL） ，RNA（18μL 和ddE I₂O（6μL） 。PCR反應條件： 37°C 15min 85^°C5s ， 4^°C 結束。將RNA逆轉錄成cDNA。參照文獻[20]合成S.marcescens熒光定量 bla_?KPC 基因引物，luxS-F： 5'-TGCCTGGAAAGCGGCGATGG- .3^′ ，luxS-R ： 5^′ -CGCCAGCTCGTCGTTGTGGT- 3^′ ，（20 bla_?KPC -F： 5^′ -TCTGGACCGCTGGGAGCTGG .3^′ ，bla_?KPC -R： 5'-TGCCCGTTGACGCCCAATCC-3'。引物由上海生工生物公司合成。每個樣本重復3孔進行熒光定量PCR。熒光定量PCR反應體系 （20μL） ：2× SYBRGreenProTaqHSPremix（ 10μL） ，上游引物（10μmol/L）（0.4μL） ，下游引物 （10μmol/L）（0.4μL） cDNA模板 （2μL） ，和 。熒光定量PCR反應條件： 95^°C30s . 95°C 5s ， 60°C 30s ，40個循環。

1.5 細菌基因組重復序列PCR（REP-PCR）

使用DNA提取試劑盒提取53株CRSM的DNA。參照文獻合成S.marcescensREP擴增引物5'-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG- 3^′[21] 。引物由上海生工生物公司合成。REP-PCR反應體系 （50μL） 包括： 2×T5 SuperPCRmix（ 25μL） ，REP引物 2μL） ，DNA模板（20 （2μL） 和ddH，O（21μL）。REP-PCR反應條件： 95^°C ，7min ； 90^°C ， 30s ， 42^°C ， 1min ， 65^°C ， 8min 30個循環； 90^°C ， 30s ， 40°C ， 1min ， 65°C ，16min。凝膠電泳：取 ₆μL PCR產物在 0.8% 瓊脂糖凝膠（凝膠用GelGreen染色）、 0.5× TBE電泳緩沖液、 120V 條件下電泳 60min ，凝膠成像系統拍照并保存。

1.6全基因組測序

從53株CRSM中選取6株（其中3株REP-PCR譜相同，對頭孢他啶敏感、中介和耐藥各1株；3株REP-PCR譜完全不相同，對頭孢他啶敏感、中介和耐藥各1株），使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。提取的DNA樣本送北京天根生物科技有限公司測序。測序過程如下：經電泳檢測合格的DNA樣品用Covaris超聲波破碎儀隨機打斷成長度約為350bp的片段，再經末端修復、加A尾、加測序接頭、純化、PCR擴增等步驟完成文庫制備；先使用Qubit2.0進行初步定量，稀釋文庫至 2ng/μL ，隨后使用Agilent2100對文庫的插入片段進行檢測，片段符合預期后，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量，以保證文庫質量。測序平臺采用luminaHiseqPE150，建庫類型為 350bp 小片段文庫，細菌重測序策略為 350bp 文庫 ?10 。原始下機數據過濾測序質量值低的reads（ （Qs?20） ，保留高質量reads后，由CLCGe-nomicsWorkbenchv21.0.1進行配對末端讀取的從頭組裝，然后將基因組提交至NCBI進行注釋。

1.7 bla_?KPC-2 測序

序列分析對于 bla_?KPC-2 測序序列分析，首先采用prokka對6個黏沙基因組進行基因注釋，獲得GenBank文件，然后從NCBI耐藥基因數據庫獲取 bla_?KPC-2 基因核苷酸序列，采用Gluster軟件的interested_gene_generation.pl程序獲取6個基因組的bla_KPC-2. 基因編號，然后采用Gcluster.pl獲取6個基因組bla_?KPC-2 側翼基因組成，設置側翼基因數量為30個（左右兩側各15個）。

2結果

2.1頭孢他啶藥敏

結果53株CRSM菌株使用紙片擴散法對頭孢他啶敏感性進行復核，藥敏結果顯示，24株敏感，21株中介，8株耐藥，與Vitek2.0Compact儀器法所測定的MIC結果一致，見表1。

2.2 熒光定量PCR

結果53株CRSM經提取RNA、反轉錄為cDNA后，進行熒光定量PCR。依據對頭孢他啶敏感性不同分組，比較敏感組、中介組和耐藥組 bla_?KPC-2 基因的表達量差異。t檢驗結果顯示，敏感組與耐藥組bla_?KPC-2 表達差異存在統計學意義 （Plt;0.0001） ，中介組與耐藥組 bla_KPC-2 表達差異存在統計學意義 （Plt;0.0001） ，敏感組與中介組的 bla_?KPC-2 表達差異無統計學意義。熒光定量PCR結果見表2。敏感組、中介組和耐藥組3組之間的 bla_KPC-2 表達差異見圖1。

2.3細菌基因組重復序列PCR

結果REP-PCR分型結果顯示遺傳多樣性，以I型（27株）和II型（11株）最為常見。部分菌株REP-PCR遺傳相關性分析見圖2。

2.4細菌全基因組測序

6株CRSM中REP-PCR譜完全相同的3株（SM19、SM23和SM27）全基因組學測序結果顯示，共同攜帶5種相同耐藥基因，分別是aac（6'）-Ic、blasRr-1＼`bla_KPC-2 、 bla_cTX-M-14 和qnrS1，其中SM27額外攜帶2種耐藥基因，分別是aac（3）-IId和 bla_LAP-2 。6株CRSM中REP-PCR譜完全不相同的3株（SM6、SM45和SM47）全基因組學測序結果顯示，共同攜帶5種相同耐藥基因，分別是aac（6）-Ic、 bla_SRT-1 、 bla_KPC-2 、 bla_cTX-M-14 和qnrS1，SM45額外攜帶 bla_TEM-1B 基因，SM47菌株額外攜帶aac（3）-IId和 bla_LAP-2 基因。6株CRSM全基因組學測序耐藥基因分布見表3。

表153株CRSM對頭孢他啶的敏感性Tab.1 Sensitivity of 53 CRSM strains to ceftazidime

2.56株細菌 bla_KPC-2 的遺傳環境分析

6株細菌的 bla_?KPC.2 的遺傳結構從整體上來看是相同的，為npR、EBNILGDA-05011、KPC-2、EBNILGDA-05013、EBNILGDA-05014、KlcA-2、EBNILGDA-05016和EBNILGDA-05017，均攜帶一個Tn3轉座子。其中，SM45攜帶2個Tn3轉座子，但該菌對CAZ敏感，可能與 bla_KPC-2 的差異性表達有關，與其表達關系不大。 bla_KPC-2 側翼結構分析見圖3。

3討論

臨床微生物檢驗工作中發現，CRSM菌株對CAZ的敏感性雖然降低，但不是 100% 耐藥。本研究中，53株CESM菌株里面，24株 （45.3%） 為CAZ敏感菌株，21株 （39.6%） 為CAZ中介菌株，8株 （15.1%） 為CAZ耐藥菌株，由此可見，CRSM菌株對碳青霉烯類抗生素雖然耐藥，但對CAZ的敏感性卻有所不同，這與國內的文獻報道不一致[22-23]，其分離出CRSM對CAZ的耐藥率顯著高于得到的結果，這也表明了該菌對CAZ的敏感性差異。針對這種情況，開展了相關研究，旨在探索其潛在的機制，為新藥的研發提供理論依據。

首先，基于S.marcescens對CAZ耐藥機制的認識，考慮到ESBLs、AmpCs酶和碳青霉烯酶在介導CAZ耐藥性的作用[24]，本研究中應該對所有菌株進行這些酶的檢測，并探索其與CAZ之間的相關性。KPC-2耐藥基因廣泛存在，而ESBLs不一定每株細菌都有，雖然染色體上AmpC酶存在持續高表達的問題，而這種酶的差異表達可能與CAZ存在一定的關系，考慮到 bla_?KPC-2 基因的廣泛的水解特性，推測，這種敏感性差異可能由于 bla_KPC-2 基因表達的差異引起，并通過熒光定量PCR進行了驗證，發現 bla_KPC-2 的表達差異與細菌對CAZ的敏感性差異有關，而且這種差異具有統計學意義，由此推測，這種CAZ的敏感性差異可能由 bla_?KPC-2 的表達差異引起。

為進一步探索 bla_KPC-2 表達差異的機制，對CRSM菌株進行了遺傳相關性分析，在此基礎上，分別挑取遺傳背景相同的3株細菌和遺傳背景不同的3株細菌，提取基因組DNA進行全基因組測序后，進行耐藥基因分析和 bla_?KPC-2 周圍遺傳結構的解析，以期找到與 bla_?KPC-2 表達差異的相關調控元件。耐藥基因分析發現，這6株細菌均含有 bla_?KPC-2 和 bla_cTX-M-14 基因。CTX-M主要為CTX-M-14，該酶對頭孢他啶的水解能力低于CTX-M-15。CTX-M-15是CTX-M-14的一個變體，其氨基酸序列中的一個關鍵突變增強了其對頭孢他啶的水解活性[25]。所以重點分析了bla KPc-2的表達差異對頭孢他啶敏感性的影響，并且肯定了bla_?KPC-2 的表達差異與CAZ的耐藥差異相關。 bla_?KPC-2的遺傳環境分析表明，雖然這6株細菌的基本遺傳結構上沒有顯著的差異，但應當存在導致bla kPc-2表達差異的原因，這可能與轉座子的分型有關，Cheruvanky等[26]的藥物的最低抑菌濃度（minimuminhibitory concentration）結果顯示，攜帶含有 bla_?KPC-2"轉座子 Tn4401a 和 Tn4401h 質粒的大腸埃希菌菌株對美羅培南（分別為 ?16.0mg/L 和 ?16.0mg/L 、厄他培南（分別為 ?8.0mg/L 和 4.0mg/L 以及頭孢吡（分別為 ?64.0mg/L 和 4.0mg/L 的耐藥性高于攜帶 Tn44016 的大腸埃希菌菌株（分別為 0.5mg/L 、 ?0.5mg/L 和?1.0mg/L） 。定量實時PCR（real-timePCR）表明，與Tn4401e 相比， Tn4401 a的 bla_?KPC"mRNA水平增加了16倍， Tn4401h 的增加了4倍。KPC-2所在的轉座子是Tn7247 ，所在區域的結構、大小和基因組合基本上一致。此外，即使Tn7247的單側或一側攜帶轉座酶Tnp，其存在也與黏質沙雷菌與頭孢他啶的敏感性無關。但考慮到目前我們使用的是二代測序技術，導致該基因兩邊的側翼序列也有限，難以得到很全面的基因序列。另外，考慮到blacTx-M-14禾 和AmpC酶本身高表達對CAZ耐藥差異的影響，為明確該菌對CAZ耐藥差異的機制，可能需要我們結合細菌三代測序技術和細菌轉錄組學技術來進一步解析該問題。

表2頭孢他啶熒光定量PCR結果

Tab.2Fluorescence quantitative PCR results of ceftazidime

圖1頭孢他啶敏感組、中介組和耐藥組 bla_KPC-2 表達差異 Fig.1 Differences in bla_KPC-2 expression among ceftazidimesensitive group， intermediate group and resistant group

注：從左至右，泳道分別對應Maker、SM46至SM61菌株。 圖2部分菌株REP-PCR遺傳相關性結果 Fig.2Genetic correlation results of some strains using REP-PCR

表36株CRSM耐藥基因分布

Tab.3 Distribution of 6 CRSM resistance genes

注： ⁶+ ”表示攜帶此基因。

圖3 bla_KPC-2 側翼結構分析圖 Fig.3Analysis diagram of bla_KPC-2 flanking sequence

CRSM對CAZ的敏感性差異可能由bla KPc-2（204號 bla_cTX-M 和AmpC酶等差異性表達的結果共同引起，引起這種耐藥性差異的機制可能比想象的還要復雜，需要轉錄組學測序等技術聯合起來進行進一步的探索。

本研究有一定的局限性。首先，菌株主要從鼓樓醫院分離，為單中心分離樣本，很難代表江蘇甚至中國樣本的現狀。此外，只對6株具有遺傳相關背景的菌株進行了二代全基因組測序，而未對其他菌株進行廣泛的基因組或轉錄組測序分析，難以排除其他耐藥基因、質粒，整合子，以及轉座子在該菌耐藥中的作用等。

結論，本院CRSM菌對CAZ的敏感性差異可能由 的表達差異引起；雖然6株分析細菌中bla_?KPC-2 的側翼序列結構基本相同，但 bla_CTX-M 的存在及AmpC酶的表達等也可能是CRSM對頭孢他啶敏感性差異的原因，需進一步分析。

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