寧夏某三甲醫院28例尿路感染耐碳青霉烯類腸桿菌目細菌分子流行特征及耐藥性分析

中圖分類號：R446.5 文獻標志碼：A

Molecular epidemiological characteristics and antimicrobial resistance of carbapenem-resistant Enterobacterales in 28 cases of urinary tract infection in a grade A tertiary hospital in Ningxia

Yan Lixin1.2， Zhu Chenyu，Tao Jia^2，4 ，HongWei1.2，Hu Xinxin1.2，andJia Wei4.4 （1TheFirstCliicalMedicalCollgeofNngxiaMedicalUniversityYnchuan75oo4;2ingxiaKeyLaboratoryofliicald Pathogenic Mcrobiologyichuan7o4;3ushanecondPeople'sHospitalzushan3o;4Laboratoryedicalte General Hospital ofNingxia Medical University， Yinchuan 750004）

AbstractObjectiveTo explore the molecular epidemiological characteristics，antimicrobial resistance，and homogeneityof carbapenem-resistant Enterobacteriaceae （CRE）in patients with urinary tractinfections at the General HospitalofNingxia Medical University，providing areference for their treatment.MethodsFrom December 2013 to November 2022，a total of28 strains ofCRE fromurinary tract infection inpatients were collected.WHONET5.6 software was used to analyze the distribution and antimicrobial susceptibilityof the strains.Polymerase chain reaction （PCR） was used to detect four carbapenemase genes （ [bla_KPC. bla_NDM，bla_OXA-48 and bla_IMP） ， and Sanger sequencing was used to analyze subtypes.Multilocus sequence typing （MLST） was employed to determine the clonal types of the strains.The transferabilityof resistance genes was verified through conjugation experiments. ResultsAmong the 28 CRE strains， 11 （39.30%） wereKlebsiellapneumoniae（ K. pneumoniae） and 9 （32.14%） wereEscherichiacoli， mainly isolated from emergency department inpatients.Drug susceptibility results showed that more than half of the bacteria testedwersstant torousommonatiboticdtedetedesistaegsere bla_?NDM and bla_KPC， with bla_NDM-5 （ 77.27% being predominant. Conclusionexperiments revealed that 7 strains of E . coli carrying the bla_NDM-5 gene and 3 strains of K. pneumoniae carrying the bla_NDM-5 gene could successfully transfer teir carbapenem resistance phenotype to the recipient strain E .coli EC600.MLST results indicated that 11K. pneumoniae strains and 9E . coli stains had 18 different sequence types （STs），suggesting a diverse range ofclone types. Cluster analysis demonstrated close genetic relationships among strains within the same ward. Conclusions The CRE strains causing urinary tract infections at the hospital are predominantly K. pneumoniae and E .coli， and their resistance mechanism to carbapenems is mainly associated with the production of NDM-5 carbapenemase.The bla_NDM-5 gene can horizontally spread through plasmids，emphasizing the need for close monitoring of CRE strains to prevent further disemination ofresistance genes and potential hospital outbreaks.

Key WordsCarbapenem-resistant Enterobacterales; Urinary tract infection; NDM-5;Multilocus sequence typing; Conjugation of plasmids

尿路感染（urinarytractinfections，UTIs）是醫院感染中僅次于呼吸道感染的第二大感染性疾病[1]，其中腸桿菌目細菌，特別是大腸埃希菌是最常見的致病菌[2]。隨著抗菌藥物的廣泛使用，病原菌的耐藥率不斷增加。碳青霉烯類抗生素因其廣泛的抗菌譜和強大的抗菌活性，曾是治療嚴重細菌感染的首選藥物。近年來碳青霉烯類耐藥腸桿菌目（carbapenem-resistantEnterobacterales，CRE）的細菌的檢出率不斷增加，給UTI的臨床治療帶來了極大的困難。本研究旨在調查寧夏醫科大學總醫院2013年12月—2022年11月臨床分離的來自尿路感染CRE的患者信息、耐藥種類、耐藥基因及傳播情況等，并對分離獲得的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌耐藥性及同源性進行分析，為臨床患者的診斷和治療提供參考依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株來源

收集2013年12月—2022年11月寧夏醫科大學總醫院住院患者尿路感染的CRE非重復菌株28株。大腸埃希菌ATCC25922為藥物敏感性質控菌株；大腸埃希菌EC600作為接合實驗受體菌株。

1.1.2 儀器與試劑

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（法國BioMérieux公司），紫外凝膠成像及分析系統儀、麥氏比濁儀、高壓水平電泳儀和電泳槽（美國Bio-Rad公司），PCR儀（德國Eppendorf公司），藥敏紙片（英國Oxoid公司），Taq2PCRMasterMix、DNAMarkerDL2000（日本Takara公司），50xTAE和MH瓊脂平板（北京索萊寶）。

1.2方法

1.2.1 菌種鑒定及體外藥敏試驗

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（MALDI-TOFMS）進行細菌鑒定，VITEK2系統進行藥敏試驗，結果判定參照2021年美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）M100（第31版）標準[3]。

1.2.2 耐藥基因檢測

采用高溫水煮裂解法提取細菌DNA，通過PCR擴增碳青霉烯酶基因（ 、 bla_oxA-48 、 bla_?NDM 和bla_IMP） 。PCR反應條件為 94^°C 預變性 5min . 94^°C 變性 30s. 退火 30s ， 72°C 延伸 45s（30 個循環）； 72^°C 再延伸 5min 。擴增產物應用 1% 瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠電泳成像儀下觀察，并記錄結果。引物序列與退火溫度見表1。將 bla_NDM 和 bla_?KPC 陽性擴增產物送至上海生工生物工程公司測序，測序結果登錄NCBI 網站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi）進行Blast比對確定亞型。

1.2.3碳青霉烯酶表型檢測

根據喻華等[4]的《腸桿菌目細菌碳青霉烯酶的實驗室檢測和臨床報告規范專家共識》倡議，使用3-氨基苯硼酸（PBA）聯合乙二胺四乙酸（EDTA）碳青霉烯酶抑制劑增強試驗（PBA-EDTA法）用于檢測腸桿菌目細菌產碳青霉烯酶的結果[5]。

表1耐藥基因名稱、PCR引物序列及退火溫度

1.2.4 質粒接合試驗

分別將供體菌和受體菌EC600劃線接種于含100μg/mL 的利福平和 4μg/mL 美羅培南的MAC（麥康凱瓊脂培養基）上，以及含有2種藥的MAC上，放入培養箱24h觀察生長情況，確保供體菌只在 4μg/mL 美羅培南的MAC上生長，受體菌只在 100μg/mL 利福平的MAC上生長。分別挑供體菌和受體菌單菌落接種于2mL LB肉湯， 37°C 搖床培養 6h 。分別取供、受體菌 500μL 于 4mL LB肉湯 37^°C 溫箱過夜培養。將靜置培養好的菌液稀釋后取 100μL 用L型接種環涂布在含有 4μg/mL 美羅培南和 100μg/mL 利福平的雙藥MAC上培養 24h^[6] ，細菌生長且經質譜儀鑒定為大腸埃希菌即為接合試驗成功，應用PCR法檢測接合子的耐藥基因驗證供體菌的耐藥基因是否轉移至受體菌。

1.2.5 CRE的多位點序列分型

參照https：//bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/primers_used.htm1網站推薦序列合成肺炎克雷伯菌多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）7個管家基因PCR引物，參照https：//bigsdb.pasteur.fr/ecoli/primers-used/網站推薦序列合成大腸埃希菌多位點序列分型8個管家基因PCR引物。引物序列由上海生工生物工程公司合成（表1）。PCR產物送上海生工生物工程公司測序，登錄PUBMLST網站（https：//pubmlst.org/bigsdb？db pubmlst_mlst_seqdefamp;page=batchSequenceQuery）數據庫進行基因序列比對，得到單個基因序號，然后確定等位基因序列號，最終比對獲得待測菌株ST型。

1.2.6 統計學處理

使用WHONET5.6軟件對菌株分布和耐藥性進行分析，采用BioNumerics8.0軟件對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌進行親緣關系分析。

2結果

2.1 病例特征

尿路感染的CRE患者中有 18% 菌株分離自急診科住院患者，ICU、心臟內科、腎臟內科、康復科、放療科各占 11% ，NCU占 7% ，其余各有 3% 分離自燒傷整形科、風濕科和腫瘤內科。分布情況見圖1。感染CRE的患者女性占 53.57% ，男性占 46.43% ，年齡最小不足1歲，最大至82歲，以50～80歲（19， 67.86% 患者為主。

2.2菌株類型檢出情況

尿路感染的CRE主要為肺炎克雷伯菌11株（39.30%） ，大腸埃希菌9株 （32.14%） ，其余為陰溝腸桿菌2株 （7.14%） ，弗氏檸檬酸桿菌、聚團腸桿菌、摩根摩根菌等各占1株 （3.57%） （表2）。

2.3CRE藥敏情況

28株CRE表現出多重耐藥性，對頭孢菌素類、碳青霉烯類和氨基糖苷類等抗生素均表現出不同程度的耐藥性，對15種抗生素的耐藥率 ?50% ，其中對亞胺培南耐藥率為 100% ，對阿米卡星耐藥率為18.52% ，敏感率最佳（表3）。

2.4CRE菌株的MLST結果

尿路感染的主要細菌為肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌，結果顯示11株肺炎克雷伯菌依據MLST分析共鑒定出9種ST分型，ST726和ST76各有兩株，其余分別為ST37、ST11、ST716、ST42、ST1603、ST48、ST15。9株大腸埃希菌全部為不同分型，ST88、ST479、ST945、ST471、ST19、ST730、ST58、ST650、ST692各1株。聚類分析見圖2。

圖1CRE尿路感染患者科室分布情況

Fig.1Departmental distributionof patientswith CREurine infection

Tab.2 DistributionofCRE strains inurinarytract infectior

表2尿路感染CRE菌株分布情況

表328株CRE對抗菌藥物的耐藥率

Tab.3 Antimicrobial resistance rates of28CRE isolates

2.5耐藥基因檢測

28株CRE中，共有20株擴增出 bla_NDM 目的基因片段、經測序分析菌株7、43、92、99、111、132、149、202、211、228、238、248、252、264、272、298、309共17株為 bla_NDM-5 型，菌株25、179和183為菌株25、179和183為 bla_?NDM-1 型。菌株21和27經PCR擴增出blakpc目的基因片段，經測序分析為blakpc-2型碳青霉烯類耐藥基因，見圖3。未篩選出 bla_IMP 和（20 bla_oxA-48 目的基因片段。

2.6PBA-EDTA法表型試驗結果

PBA+IPM抑菌圈直徑比單藥亞胺培南的抑菌圈直徑擴大 ?5mm ，即產A類絲氨酸酶的CRE共有2株，EDTA+IPM抑菌圈直徑比單藥亞胺培南的抑菌圈直徑擴大 ?5mm ，即產B類金屬酶的CRE共有20株。PBA-EDTA結果與基因檢測結果一致，如表4所示，靈敏度和特異性均為 100% 。

注：M為Marker；7～309為blaNDM基因；21和27為blakpc基因圖3碳青霉烯類耐藥基因瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3Agarose gel electrophoresisofcarbapenem resistance genes

2.7質粒接合試驗結果

質粒接合試驗顯示，20株產NDM金屬酶CRE中有10株菌質粒成功轉移，具體編號為7、43、92、99、149、211、228、264、272和309。接合經質譜鑒定為大腸埃希菌，采用PCR檢測到接合子 bla_?NDM"基因的存在，如圖4所示。說明該耐藥基因可能定位于質粒，并可以進行水平傳播。攜帶 bla_?KPC"基因菌株未成功接合。

表428株CRE的產酶類型及耐藥基因結果

Tab.4The enzyme types and drug resistance genes of 28 CRE strains

注：“-”表示未檢出。

圖4接合子耐藥基因瓊脂糖凝膠電泳圖 Fig.4Agarose gel electrophoresis of transconjugant resistance genes

注：M為Marker；C7～C211為接合子 bla_NDM 基因；EC600受體菌作為對照

3討論

碳青霉烯類耐藥腸桿菌（CRE）是全球面臨的一個緊迫的公共衛生問題。這些多重耐藥微生物對當今大多數可用抗生素都表現出耐藥性，CRE的流行病學研究集中在最常見的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP）和耐碳青霉烯類大腸埃希菌（carbapenem-resistant Escherichiacoli，CREco），這兩種菌約占CRE菌株的 90% 以上，并通過多種途徑在世界范圍內廣泛傳播[10]。我國一項覆蓋14個省份25家三級醫院的多中心研究顯示，尿路感染高居第二位[11]。本研究共分離出尿路感染的CRE28株，以肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌為主，這與國內報道的尿路感染流行優勢菌株相一致[3]。急診科成為分離細菌最多的科室，其次為ICU、心臟內科、腎臟內科等，所分離的細菌中男性占 46.43% ，女性占53.57% ，女性多于男性，這與趙越等[]報道的結果相似。原因可能在于女性相較于男性尿道更短，更容易受到腸道菌群的感染。近年來研究顯示CRE導致尿路感染呈逐年增多趨勢，這可能與人口老齡化及泌尿道侵襲操作密切相關[11]。本研究的藥敏試驗結果顯示28株CRE菌株對臨床上的常用抗菌藥物明顯耐藥，對 β. -內酰胺類、喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率均 gt;70% ，對氨基糖苷類抗菌藥物也有一定的耐藥率，與相關文獻[12]報道結果一致。

碳青霉烯酶屬于 β 丙酰胺酶，主要存在于革蘭陰性菌中，可以抑制大多數β-內酰胺類抗生素，并且可以通過降解或水解抗生素使腸桿菌目細菌對碳青霉烯類抗生素產生耐藥性。Ambler將β-內酰胺酶分為A～D類[14-15]，由于C類β-內酰胺酶不能介導碳青霉烯類的水解，因此A、B和D類被定義為碳青霉烯類酶。A、B和D三類酶均可在可移動元件中出現，通過轉接、轉化、轉導和轉位等方式進行基因水平轉移，從而導致耐藥菌株的流行。腸桿菌目中最常見的碳青霉烯酶是A類酶變體，如KPC、D類OXA-48以及金屬-β-內酰胺酶NDM、VIM、IMP[16]。2009年在瑞典人的肺炎克雷伯菌株中檢測到源自印度的NDM-1[17]，如今已鑒定出該酶的35種變體[18]。KPC酶于1996年首次從肺炎克雷伯菌分離株中鑒定出來[19]，目前，攜帶blakPc-2和 bla_?KPC-3 的肺炎克雷伯菌株是導致世界各地醫院暴發的原因，并且這些類型的KPC酶是最常見的[20]。有研究表明，在中國，KPC和NDM是最常見的兩種碳青霉烯酶，一項對來自中國25個地理位置的1105個CRE菌株的調查顯示， 90% CRE菌株的耐藥表型與這兩個碳青霉烯酶有關。相對而言，IMP和OXA-48的檢出率較低[21]。本研究首次使用PBA-EDTA法檢測腸桿菌目細菌產碳青霉烯酶情況，結果顯示對28株CRE碳青霉烯酶的檢出率為 78.57%（22/28） ，其中產B類金屬酶的占 90.90%（20/22） ，產A類絲氨酸酶的占 9.10%（2/22） ，提示該院尿路感染CRE菌株大多產碳青霉烯酶且以金屬酶為主。這與同時進行的PCR試驗結果相一致，顯示尿路感染菌株有20株 （71.43%） 攜帶 bla_?NDM 基因，有2株 （7.14%） 攜帶 bla_?KPC 基因，未檢出 bla_IMP 和 bla_oxA-48 基因。測序比對結果顯示，該院尿路感染 bla_NDM 基因存在兩個亞型， bla_NDM-5 亞型為主 （60.71%） ， bla_?NDM-1 亞型次之 （10.71%） ： bla_?KPC 基因均為 bla_?KPC-2 型。即我院主要的碳青霉烯酶基因為bla_NDM-5 型，這與該院之前報道的以 bla_NDM-lFΠbla_KPC-2 型為主有所不同[9]。但與茆永娟等[19]報道的寧夏地區碳青霉烯類耐藥基因型以 bla_NDM-5 為主相符。即我院主要的碳青霉烯酶基因為NDM-5型，這與該院之前報道的以NDM-1和KPC-2型為主有所不同[9]。NDM-5是NDM-1的新興變異體，最近似乎有超過NDM-1的流行趨勢，它與NDM-1酶的區別在于88位（氨酸→亮氨酸）和154位（甲硫氨酸 $$ 亮氨酸）氨基酸有所不同，并對頭孢類和碳青霉烯類抗生素水解活性有所降低。提示該院碳青霉烯類基因存在進化，NDM酶亞型逐漸改變，因此需要持續監測其耐藥性改變，以防CRE新亞型的暴發和流行。

本研究對11株CRKP和9株CREco菌株進行了MLST檢測，結果顯示共有18種ST型別。其中ST76和ST726為優勢型別菌株，說明該院耐碳青霉烯類腸桿菌的克隆多樣性并呈現地區特異性。聚類分析結果顯示，共有四大不同的進化簇，相同科室之間存在一定的關聯性，提示耐藥基因可能在科室之間通過一定的方式進行傳播，并且可能暴發流行并且擴散到鄰近科室。醫院應該格外注意，做好科室內外的消毒工作，加強對耐藥菌的監測和檢測工作，及時建立一種醫院感染暴發預警系統，并有嚴格的手衛生和感染隔離措施，避免造成更嚴重的后果。除ST15、ST37和ST42外，其他ST型主要攜帶blaNDM-5基因，僅ST716型CRKP攜帶 bla_NDM-1 基因，另外還有ST11型CRKP攜帶 bla_KPC-2 基因。盡管有學者在染色體上發現 bla_NDM[22] ，但絕大多數 bla_NDM 仍位于質粒上，質粒在基因傳播中起著至關重要的作用。本研究質粒接合試驗結果顯示， bla_NDM 基因可通過質粒進行水平轉移與傳播。IncX型質粒是腸桿菌目細菌窄宿主范圍質粒，近年來帶有 bla_?NDM 基因的Incx3型質粒在大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、弗氏檸檬酸桿菌、陰溝腸桿菌中常報道檢出，已成為我國 bla_?NDM 基因傳播的重要媒介[23-25]。質粒的可轉移性可導致 bla_NDM 基因迅速播散，提示醫院應該尤其注意微生物的感染嚴重性。

綜上所述，該院臨床分離的尿路感染患者的CRE菌株對常見抗生素的耐藥率均較高，且多為多重耐藥菌，其對碳青霉烯類的主要耐藥機制是產NDM-5型金屬酶。目前臨床上CRE的主要治療方法主要基于耐藥檢測結果、感染部位和流行病學特征的分析，并正在開發和試驗新的抗生素和治療措施。需要持續開展CRE監測，揭示抗生素耐藥性的分子流行病學特征，為相關疾病的防控提供參考。對臨床分離的CRE菌株的機制研究將為耐藥菌株治療的新靶點提供見解。此外，臨床實踐中還應考慮CRE傳播預防措施，從多方面加強CRE的預防和控制，以減少CRE的發生和發展。

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