海洋鏈霉菌OUCMDZ-2582產生的吲哚咔唑生物堿及其抗菌活性

中圖分類號：R978 文獻標志碼：A

Indolocarbazole alkaloids from marine-derived Streptomyces sp. OUCMDZ-2582 and their antibacterial activity

Xu Guangjin1， Wen Qingyun1，Bu Shutian1， Chen Linmeng1， and Zhu Weiming1.2 （1KeyLaboratoryofarinerugs，inistryEducationofhina，hoolofedicineandPamacyOceanUiversityofa

AbstractObjective To investigate the indolocarbazole alkaloids produced by marine-derived Streptomyces sp. OUCMDZ-2582 and their antibacterial activity. MethodsA1 liquid culture medium was used to ferment the Streptomyces strain.The fermentation broth was extracted by ethyl acetate （EtOAc）. Guided by the characteristic ultravioletabsorptionof indolecarbazole，the indolecarbazole alkaloids inthe fermentation products were isolated by column chromatographyover positive and reverse phase silica gel，Sephadex LH-2O，aswellassemi-preparative high-performance liquid chromatography （HPLC） to give pure compounds. The structures of the compounds were elucidated through theanalysisofLC-MS，NMR，andoptical rotation，etc.The antibacterial activity was assyed by microbroth dilutionmethod.ResultsNine indolocarbazole alkaloids were purified and identified as staurosporine （1），3'-N-acetsturooine （2），3--burospie（3），A （4），trtocboleC（5），b， 3'-N-acetylholyrineA（7），3'-N-acetyl-3-ydroxyholyrineA（8），andK25c（9），respectively.Teantibacterialaciviie for compounds 2and 3 against Vibrio parahaemolyticus and compound 3 against Vibrio alginolyticus were observed， each at a minimum inhibitory concentration（MIC） of 32μg/mL . Conclusion Streptomyces sp.OUCMDZ-2582， isolated from the Yellow River Delta，is a prolific producer of indolocarbazole alkaloids. Compounds 2 and 3 displayedantibacterial activities.

Key WordsMarine Streptomyces; Indolocarbazole alkaloids; Structural elucidation; Anti-bacterial activity

海洋幾乎占據了地球表面的3/4，海洋環境的特殊性造就了海洋生物特殊代謝途徑和適應機制，海洋天然產物獨特而多樣的化學結構使其具有顯著的生物活性1，其中海洋微生物更是海洋天然產物的主要生產者[2-3]。十字孢堿是首個從自然界中獲得的[2，3-a]吲哚咔唑生物堿[4]，對腫瘤細胞和蛋白激酶C有強抑制活性和抗真菌活性[5-]，是一重要的先導結構。為了挖掘結構新穎的吲哚咔唑類生物堿，探究此類化合物的抑菌作用，本課題組對采集自黃河三角洲的菌株進行了分離，并從中得到了多個具有抑菌活性的化合物[7-11]。本文聚焦一株富產吲哚咔唑生物堿的黃河三角洲鹽堿土壤來源的鏈霉菌OUCMDZ-2582，從其發酵物中分離并鑒定了9個吲哚咔唑生物堿（1～9，圖1），測試了部分化合物對9株人體致病菌和7株水產致病菌的抑制活性，化合物2和3對副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）、化合物3和6對溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）有抑菌活性，MIC值分別為32、32、32和 64μg/mL 。

圖1化合物1～9的化學結構 Fig.1 Chemical structures of compounds1～9

1材料與方法

1.1實驗儀器與試劑

實驗儀器：天平BP121S型（美國賽多利斯公司）；超聲儀VC750型（美國Sonics公司）；超凈工作臺AirTech型（蘇州安泰空氣技術有限公司）；恒溫搖床HTG-C型（江蘇太倉實驗設備廠）；高壓滅菌鍋LDZX-75KBS型（上海申安醫療器械廠）；旋轉蒸發儀OSB2100型（EYELA公司）；循環水式多用真空泵SHB-IⅢ型（鄭州長城科工貿有限公司）；冷凍干燥機EZ-DRY型（美國FTS公司）；分析用高效液相色譜儀：ShimadzuLC-6AD型號，Waters2998二極管陣列檢測器，YMC-packODS-A C₁₈ 柱： 4.6mm× 250mm ， 5μm ， 12nm ， 1mL/min （美國Waters公司）；液-質聯用儀Q-TOFUltimaGlobalGAA076LC型（美國Wasters公司）；三用紫外儀ZF-6型（上海嘉鵬科技有限公司）；柱色譜與薄層色譜硅膠100-200/200-300目（青島海洋化工集團）；SephadexLH-20（Pharmacia公司）；高效薄層色譜板GF254（青島海洋化工廠）。發酵所用的可溶性淀粉、酵母浸膏、蛋白脈和瓊脂粉（北京雙旋微生物培養基制品廠）；四水合硫酸鐵和溴化鉀（天津博迪化工股份有限公司）；液相色譜以及液質聯用所用甲醇和乙腈均為色譜純；常規提取分離用二氯甲烷、甲醇和乙酸乙酯均為工業用化學純產品。

1.2 實驗菌株

菌株Streptomycessp.OUCMDZ-2582，分離自黃河三角洲的鹽堿土壤，保藏于本實驗室 .80^°C 冰箱內。按下列程序提取樣品的16SrDNA，并擴增PCR[12]：用無菌牙簽挑取復蘇的菌株OUCMDZ-2582單菌落于 1.5mL EP管中，加入 100μL 的MightyPrepreagentforDNA（TaKaLa）裂解液，渦旋離心； 94^°C 金屬浴 5min ！ 、 55^°C45s ， 72°1 min為一個循環，30個循環，延伸 10min 。PCR引物為27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（GGCTACCTTGTTACGACTT），條帶大小約為1400bp ，PCR產物經純化后送至青島擎科生物科技有限公司測序。

1.3發酵條件的篩選

分別使用高氏一號、ISP2、A1和Kazuo的液體培養基對菌株Streptomyces sp.OUCMZ-2582進行培養基條件的篩選（表1），培養天數統一為11d，乙酸乙酯（EtOAc）萃取發酵液得到EtOAc提取物。再對EtOAc提取物進行HPLC-UV分析，以 λ_max 290nm 系列特征紫外吸收峰為吲哚咔唑母核的依據[13]，分析EtOAc提取物中吲哚咔唑生物堿的多樣性。結果表明，在A1液體培養基中，菌株OUCMZ-2582的吲哚咔唑產物最豐富，被選作規模化發酵條件（圖2）

1.4菌株發酵和提取

配制A1液體培養基，并將其分裝在 500mL 三角瓶中，每瓶的裝液量為 150mL ，置于高壓滅菌鍋進行滅菌（ 121^°C ， 21min^? 。將生長于A1瓊脂培養基上的單菌落接種到相同液體培養基中（不含瓊脂），置于 28°C 恒溫震蕩培養箱中 180r/min 培養7d作為發酵種子液。無菌吸管吸取種子液接入滅菌的A1液體培養基中（3mL/瓶）；置于 28°C 恒溫震蕩培養箱中、180r/min 發酵培養 14d ，共發酵660瓶。發酵完成后，每瓶培養基中加入 150mL EtOAc進行超聲破碎提取，重復提取3遍，合并EtOAc層并減壓濃縮至干，得到油狀提取物 127.4g 。

1.5代謝產物分離

EtOAc提取物首先經過硅膠柱色譜分離，采用體積比100：1-0：1的二氯甲烷甲醇溶液梯度洗脫，薄層層析（TLC）檢測合樣得到6個組分（Fr.1～Fr.6）。

表1培養基配方一覽表

Tab.1 The culture media used in the experimen

注：紅框標識的為吲哚咔唑生物堿 圖2菌株Streptomycessp.OUCMDZ-2582代謝產物在 290nm 波長下的HPLC-UV指紋圖譜 Fig.2HPLC-UV profiles of secondary metabolites of Streptomyces sp. OUCMDZ-2582 at λ_max290nm

組分Fr.3（ V/V=70：1 ，60：1，各 3L ， 2.4g） 通過反相硅膠柱色譜，以 H₂O -MeOH（90：10～0：100）作為流動相梯度洗脫后、TLC檢測合樣，得到4個亞組分Fr.3.1～Fr.3.4 。亞組分 Fr.3.1（20mg） 經色譜級甲醇離心洗滌后得到的沉淀部分為純度 gt;95% 的化合物91 （8mg） ，亞組分 Fr.3.2（31mg） 通過半制備HPLC（YMC-ODS-A，以下同）分離、 50%MeCN-H₂O| 如非指明，均含 0.05% 三氟乙酸（TFA），以下同）]洗脫得到化合物4（ 1.2mg ， t_e20.8min ，亞組分Fr.3.3L 50mg 通過半制備HPLC分離、 45%MeCN-H₂O 洗脫得到化合物2（ 2mg ， t_R24.5min， 。組分Fr.4（V/V，50：1、40：1，各 3L ， 3.0g） 通過反相硅膠柱色譜，以HO-MeOH（90：10～0：100）梯度洗脫、TLC檢測合樣，得到4個亞組分 Fr.4.1～Fr.4.4 。亞組分Fr.4.1（ 270mg） 進一步經過SephadexLH-20凝膠柱色譜分離、 CH₂Cl₂ ：MeOH（1：1，V/V洗脫、TLC檢測合樣，得到5個亞組分Fr.4.1.1～Fr.4.1.5。其中亞組分Fr.4.1.1（ 65mg 通過半制備HPLC分離、 33% MeCN-HO洗脫得到化合物5（3 mg， t_R31.6min 。

組分Fr.5（ V/V=30：1 、20：1、10：1，各 4.5L 010g） 通過減壓正相硅膠柱色譜分離、 CH₂Cl₂/MeOH （1：0-0：1，V/V梯度洗脫、TLC檢測合樣，得到7個亞組分Fr.5.1～Fr.5.7。亞組分Fr.5.1（3.4g）在丙酮中回流，不溶部分為純度 gt;95% staurosporine（化合物1，3g）；溶于丙酮的部分Fr.5.1.2 （0.4g） 通過半制備HPLC分離、50%MeCN-HO洗脫得到化合物6 2mg t_e10.6min） 。亞組分Fr.5.2（2.1g）通過SephadexLH-20凝膠柱色譜分離、 CH₂Cl₂ -MeOH（1：1，V/V）洗脫、TLC檢測合樣，得到6個亞組分Fr.5.2.1～Fr.5.2.6。其中亞組分Fr.5.2.4（ 32mg 和Fr.5.2.5（ 37mg 通過半制備HPLC分離、 35%MeCN-H₂O 洗脫，分別得到化合物7（ 1.3mg ， t_R49.4min 和化合物3（1.4mg， t_R55.5min ；亞組分Fr.5.2.6（ 21mg） 通過半制備HPLC分離、 38%MeCN-H₂O 洗脫得到化合物8C 1.2mg ， t_R 12.5min） 。

1.6化合物2的合成轉化與LC-MS分析

將化合物1（ 5.0mg ，0.011 mmol）和DMAP 0.3mg 0.002mmol ）溶于 100μL （204號 Ac₂0 中，于50℃反應30min 至TLC檢測反應完畢。向反應液中加入 5mL CH₂Cl₂ 萃取反應產物，有機相依次經飽和 NaHCO₃ 和NaC1洗滌后，加入無水 Na₂SO₄ 干燥，減壓濃縮得到粗提物；粗提物經硅膠柱色譜分離、二氯甲烷/甲醇（40：1，V/V洗脫得到白色固體化合物20 5.2mg ，收率 96% ）。將其與分離鑒定的天然產物2一起進行手性HPLC-MS混合針分析，結果表明，天然產物2和合成化合物2是同一個化合物，即3'-N-乙酰十字孢堿。LC-MS條件為：反相ChiralINA色譜柱、4.6mm×250mm ，洗脫溶劑MeCN- ?H₂O 0 0～15min 10%～100% ， 15～20min . 100% ， 20～25min ： 100%～ 10% ，流速 1mL/min ，質譜檢測：正離子ESI m/z 509 。

1.7抑菌活性測試

1.7.1 菌懸液制備

將白念珠菌和光滑念珠菌分別接種于YPD培養基中，銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、產氣莢膜梭菌、副傷寒桿菌、鮑曼不動桿菌、產氣腸桿菌和蘇云金芽孢桿菌分別接種于LB培養基中，遲緩愛德華菌、副溶血弧菌、創傷弧菌和溶藻弧菌（表2）接種于2216E培養基中，裝液量均為30/100mL ，置于 28°C 、 180r/min 搖床培養 12h 、以菌液渾濁作為培養終點，然后用對應的無菌培養基（即 0.22μm 無菌濾膜過濾后的空白培養基，培養基配方表1）稀釋1000倍備用。

1.7.2 樣品測試液制備

用細胞級的二甲基亞砜（DMSO）將待測化合物1～3、5和6和陽性藥（細菌為環丙沙星、真菌為酮康唑）配成濃度為 1.28mg/mL 的原液，備用。

1.7.3 最小抑菌濃度（MIC）測定

采用微量稀釋法[14]，在96孔板中測定化合物1～3、5、6和陽性藥的MIC。實驗分為空白組（僅加入空白培養基）、陰性組（稀釋的菌懸液和細胞級DMSO）以及藥物組包括化合物組 （稀釋的致病菌液和不同濃度的化合物）和陽性藥組（稀釋的致病菌液和不同濃度的陽性藥），每組平行設置3個復孔。藥物組中每孔加入 10μL 化合物或陽性藥原液、 90μL 對應空白培養基和 100μL 稀釋菌液，即每孔藥物濃度為64μg/mL （初篩）；然后采用二倍梯度稀釋法測定MIC，用對應的空白培養基依次將藥物終濃度稀釋為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和 0.125μg/mL 。加藥結束后，將96孔板放入 37^°C 培養箱中培養12h觀察每孔中液體的濁度，菌液由渾濁變澄清的第一個梯度即為藥物的MIC值。

2 結果與討論

2.1 菌種鑒定

將菌株OUCMDZ-2582的16SrDNA序列上傳至NCBIGenBank（登錄號No.PP844661），BLAST比對GenBank中的菌株基因序列，利用軟件MEGA4構建系統發育樹（圖3），其親緣關系相近的均為鏈霉菌屬（Streptomyces），故鑒定菌株OUCMDZ-2582為鏈霉菌（Streptomyces sp.）。

2.2化合物結構鑒定

化合物1：淡黃色粉末， [a]_D¹⁸+40.1（c 0.1 MeOH），UV（MeOH）λmax244，292，333，355，434nm ；ESIMS在 m/z z467.5[M+H]⁺ 給出分子離子峰，提示分子量為466，結合"¹H 和"¹³C NMR推測其分子式為 ΛC₂₈H₂₆N₄O₃"。化合物1在 λ_max"291.8nm 處尖銳的紫外吸收峰，提示其為吲哚咔唑類化合物[13，15]。"¹H NMR給出26個氫信號，其中低場區顯示1個活潑氫信號 δ_H"8.52（1H，s，6-NH）、7.25～9.28處顯示出8個芳香氫信號；"¹³C NMR給出28個碳信號，其中低場區顯示出1個基碳信號（δ。172.3）、18個芳香碳信號 （δ_C"108.3～139.4）；這些典型的NMR信號尤其是低場特征的芳香氫信號 δ_H"9.28進一步表明其具有吲哚咔唑母核。此外，化合物1的NMR還給出3個次甲基信號 （δ_C/?H50.1/3.25、82.8/4.05和79.9/6.69）、2個亞甲基信號8_C/H45.4/4.95 和29.3/2.07amp;3.18）、3個甲基信號 （δ_C/H"33.3/1.44、57.2/3.32和29.7/2.30）以及1個季碳信號 （δ_C"91.1）。文獻查閱表明，這些NMR數據和比旋光與文獻報道的十字孢堿相符（表3）[16]，故鑒定化合物1為十字孢堿（staurosporine）。

表214株病原細菌和2株病原真菌信息

Tab.214 pathogenic bacterial strainsand2 fungal pathogensin the tes1

化合物2：淡黃色粉末， [a]_Δ¹⁸+91.1 I （c0.1 0MeOH），UV （MeOH） λ_max 218，292，335，367 nm;ESIMS在m/z 509.6 [M+H]⁺ 給出分子離子峰，提示其分子量為508，結合 ¹H 和 ¹³C NMR推測其分子式為C₃₀H₂₈N₄O₄ 。其紫外光譜和NMR譜與化合物1極為相似（表3），表明化合物2也是吲哚咔唑生物堿。仔細比對兩者的NMR譜發現：化合物2比化合物1多1個甲基信號 （δ_C/H28.5/2.06） 和1個羰基碳信號（δ170.7），即乙酰基信號，且糖環部分的NMR信號的化學位移有明顯變化。結合分子式，推測化合物2為化合物1的 |N₃^′ 1乙酰化衍生物。文獻調查表明，化合物2的NMR數據與文獻[17]報道的3'-N-乙酰十字孢堿（3'-N-acetylstaurosporine）相吻合。但由于文獻中無比旋光數據，為了進一步證明化合物1的結構，本文對化合物1進行乙酰化，通過手性柱的LC-MS檢測 （混合針分析）反應產物，結果發現化合物1幾乎被定量地轉化為化合物2（圖4），化合物2的結構因此得以鑒定。

表3化合物1～3的 ¹H 0 400MHz 和13C [100MHz] 核磁數據（DMSO ）lab.3The ¹H（400MHz） and ¹³C （100 MHz） NMR data for compounds1-3 （DMSO- ??d?_?）

注： -乙酰基和氨甲酰基的NMR數據分別為 δ_HC 2.06（s， 3H）， 28.5（CH₃） ，170.7（C）， 6.05（br.s，2H）和158.8（C）。

圖4化合物2的合成與手型HPLC-MS鑒定（ESI正離子檢測m/z 509） Fig.4Synthesis of2 and its identification bya chiral HPLC-MS at m/z 509 （positive ion ESI）

化合物3：淺綠色油狀固體， [a]_D¹⁸+75.6 （c 0.1，MeOH），UV （MeOH） λ_max 244，293，322，355，372 nm；ESIMS在 m/z510.5[M+H]⁺ 給出分子離子峰，提示分子量為509，結合 ¹H 和 ¹³C NMR推測其分子式為C₂₉H₂₇N₅O₄ 。化合物3具有與化合物1或2相似的紫外光譜和核磁共振譜（表3），表明該化合物亦為十字孢堿的衍生物；但NMR比化合物1多1個季碳信號 （δ_c158.8） 、化合物2少1個甲基信號且季碳 （羰基碳）信號明顯移向高場 （-11.9ppm） 。結合其分子式比化合物2少1個CH、多1個N，推測是氨基甲酰基取代了乙酰基，即為3'-N-氨基甲酰十字孢堿（3'-N-carbamoylstaurosporine），其核磁數據與文獻值相符[18]，故鑒定化合物3為3'-N-氨基甲酰十字孢堿。

化合物4：淡黃色油狀固體， $[ ＼mathbf { ＼mathfrak { a } } ] _ { ＼mathrm { ^ D } } ^ { 1 8 } - 8 . 0 （ c 0 . 1 ＼$ MeOH），UV （MeOH） λ_max247，292，333，433nm; ESIMS在 m/z467.5[M+H]⁺ 給出分子離子峰，提示化合物的分子量為466，結合 ¹H 和 ¹³C NMR（表4）推測其分子式為 C₂₇H₂₂N₄O₄ 。化合物4的紫外與核磁共振光譜非常類似于化合物1，表明該化合物亦為十字孢堿類化合物；但NMR比化合物1多1個 ?sp². 季碳信號（δ_c145.2） 和1個可交換氫信號！ （δ_H10.44） 、少1個甲基和1個次甲基信號且糖環部分的化學位移發生明顯變化。結合其分子式，推測可能是3'-羥亞胺基取代了3'-甲氨基。文獻調查表明，化合物4的NMR數據與文獻[19]中的TAN-1030A相吻合，故鑒定化合物4為TAN-1030A。

化合物5：淡黃色油狀固體， [a]_D¹⁸+96.2（c0.1 MeOH），UV （MeOH） λ_max221 ，289，335和 366nm ESIMS 在 m/z440.5[M+H]⁺ 給出分子離子峰，提示其分子量為439，結合其氫譜和碳譜數據（表4），推測化合物5的分子式為 C₂₆H₂₁N₃O₄ 。化合物5的紫外與核磁共振光譜類似于化合物1，表明其亦吲哚咔唑生物堿；但糖環部分的NMR信號變化較大，左邊的吲哚母核的化學位移也有明顯變化，可能是糖環與吲哚咔唑的駢合由糖的1，5-橋連替換為1，3-橋連[20]。仔細查閱文獻，發現化合物5的NMR數據及比旋光與文獻[21]報道的streptocarbazoleC相符，故鑒定化合物5為streptocarbazole C。

化合物6：黃色粉末， [a]_D¹⁸+72.2（c0.1 ，MeOH）;UV（MeOH） λ_max249 ，291，335，406和434nm ；ESIMS在m/2 ：454.5[M+H]⁺ 給出分子離子峰，提示其分子量為453，結合其氫譜和碳譜數據（表4），推測化合物6的分子式為 C₂₆H₁₉N₃O₅ 。紫外光譜和NMR譜與化合物1的相似性，表明化合物6為吲哚咔唑類化合物。與化合物1相比較，化合物6的 ¹H 和 ¹³C NMR顯著差異發生在糖環部分，包括化學位移的明顯變化、1個羧基碳 （δ_c174.1） 和1個連氧季碳 （δ_C 84.5信號取代了2個次甲基信號、并少了2個甲基信號，可能是化合物1中的3'，4'-C-Cσ鍵發生了氧化縮環反應[22]。進而通過文獻調查，發現化合物6的NMR數據和比旋光與文獻[23]報道的K252b基本一致，由此鑒定化合物6為K252b。

化合物7：淡黃色油狀固體，[α]-55.2 （c0.05 MeOH）;UV （MeOH） λ_max223 ，290，335和 364nm ESIMS在 m/z483.6[M+H]⁺ 給出分子離子峰，提示其分子量為482，結合其氫譜和碳譜數據（表5），推測化合物7的分子式為 C₂₈H₂₆N₄O₄ 。紫外光譜和NMR譜與化合物1的相似性，同樣表明化合物7為十字孢堿的衍生物。與化合物1的NMR（表3）相比，化合物7在低場區多了1個可交換質子信號 （δ_H12.12） 、多了1個乙酰基信號 （δ_C/H168.8，22.7/1.82） 、少了1個甲氧基信號，可能是橋連的糖環開環為簡單的糖苷類化合物。文獻檢索表明，化合物7的NMR數據及比旋光與文獻[24]報道的3'-N-acetylholyrineA相符，故鑒定化合物7為3'-N-acetylholyrine A。

表4化合物4～6的'H（400 MHz） [100MHz） 核磁數據（DMSO- ?d ） b.4The ¹H（400MHz） and NMRdataforcompounds4-6（DMS

注： ^aN_3^′ -NOH和4'-OCH的NMR數據分別為 δ_H 10.44（s， 1H）， δ_C/H58.4（CH₃） 和3.43（s，3H）。

化合物8：淡黃色油狀固體， [α]_D¹⁸-25.1 1 （c0.05 MeOH）;UV（MeOH） λ_max234，295，342，376，440nm ESIMS在 m/z499.6[M+H]⁺ 給出分子離子峰，提示其分子量為498，結合其氫譜和碳譜數據（表5），推測化合物8的分子式為 C₂₈H₂₆N₄O₅ 。其UV和NMR譜與化合物7相似，但比化合物7多一個氧原子、且UV吸收紅移，意味著可能在苯環上有羥基取代；兩者NMR的差別在于化合物8在芳香區少了1個次甲基信號、卻多了1個連氧季碳信號 （δ_C150.9） ，證實了這一推測。進一步通過文獻檢索，發現化合物8的NMR和比旋光數據與文獻[13]中報道的 3^′–N -acety1-3-hydroxyholyrineA相一致，故鑒定化合物8為3'-N-acetyl-3-hydroxyholyrine A。

化合物9：淡黃色粉末；UV（MeOH） λ_max232 290，333和 356nm ；ESIMS在 m/z312.4[M+H]⁺ 給出分子離子峰，提示其分子量為311，結合其氫譜和碳譜數據（表5），推測化合物9的分子式為 C₂₀H₁₃N₃O 。紫外光譜和NMR與化合物1的相似性表明化合物9為吲哚咔唑類化合物；但NMR中沒有糖環部分的信號，且多了2個可交換質子信號 （δ_H11.32 、11.49），這意味著化合物9可能是十字孢堿的母核。文獻調查表明，化合物9的NMR數據（表5）與文獻[25]報道的K252c相符，故鑒定化合物9的結構為K252c。

2.2抑菌活性測試結果

采用微量稀釋法測試了化合物1～3、5和6對16 種人體致病菌和水產致病菌（表1）抑菌活性，結果表 明：化合物3和6對溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）有抑 菌活性，MIC值分別為32和 64μg/mL ；化合物2和3 對副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）有抑菌活性，

表5化合物7～9的 ¹H Ψ₄₀₀MHz 0 100MHz， 核磁數據（DMSO ?d₆ ）b.5The H（400MHz） and ¹³C （100MHz） NMRdata forcompounds7-9（DMSO-

注： ^aN_3^? -乙酰基和12-NH的NMR數據分別為 S_C/H 168.8 （C）， 22.7 （CH） ），1.82 （s，3H）和12.12（s，1H）。b N₃， -乙酰基和12-NH的NMR數據分別為δc/168.8 （C）， 22.7 （CH₃） ，1.81 （s，3H）和12.02（s，1H）。‘12-NH和13-NH的NMR數據分別為 1δ_H 11.49 （s，1H） 和11.32 （s，1H）。

MIC值均為 32μg/mL 。化合物2、3和6對其他致病菌以及其他化合物沒有抑菌活性 （MICgt;64μg/mL） ，陽性藥環丙沙星對V.alginolyticus和 V. parahaemolyticus的MIC值均為 16μg/mL 。

3結論

吲哚咔唑生物堿是一類重要的生物活性天然產物，根據吲哚環與咔唑環之間的稠合方式，可以分為吲哚[2，3-a]咔唑、吲哚[2，3-b]咔唑、吲哚[2，3-c]咔唑、吲哚[3，2-a]咔唑和吲哚[3，2-b]咔唑5個亞型，本文從黃河三角洲來源的Streptomycessp.OUCMDZ-2582的液體發酵產物中獲得的化合物1～9屬于吲哚[2，3-a]咔唑生物堿。此類吲哚咔唑生物堿以十字孢堿為代表，主要應用其腫瘤細胞毒活性[15.20.26]，對這類化合物的結構修飾產生了治療腫瘤的上市藥物，比如米哚妥林（midostaurin）已被美國FDA和歐盟EMA批準用于新診斷的FLT3突變陽性的急性髓性白血病（AML）和全身性肥大細胞增多癥（SM）的治療[27]。但此類化合物的抗菌活性較少被報道[4-5]，本文發現3'-N-乙酰十字孢堿（2）、3'-N-氨基甲酰十字孢堿（3）和K252b（6對2種水產致病弧菌有抑菌作用，從而為水產養殖中溶藻弧菌（V.alginolyticus）和副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）的防治提供了有潛力的化合物。眾所周知，副溶血性弧菌是一種典型的海洋源性致病菌，人吃了副溶血弧菌污染的海洋食品，常常引起惡心、嘔吐、腹瀉等腸胃炎癥狀[28；而溶藻弧菌，尤其是在接觸海水后，會引起軟組織和血液感染，常見其感染傷口（皮膚）和耳部[29]；應引起足夠重視。因此，本文的研究結果對防治這兩種弧菌的感染也有積極的意義。

參考文獻

[1] DebbabA，AlyAH，LinWH，etal.Bioactivecompounds frommarinebacteriaand fungi[J].MicrobBiotechnol，2010， 3（5）：544-563.

[2] Poli A，FinoreI，Romano I，et al.Microbial diversity in extreme marine habitats and their biomolecules[J]. Microorganisms，2017，5（2）：25.

[3] 高諭康，劉培培，李燕楠，等.淺藍霉素H產生菌CRM05 的發酵條件優化及其抗菌活性研究[J].中國抗生素雜志， Antibiot，2017，70（5）：715-717.2023，48（11）： 1251-1260.

[4]Omura S，Iwai Y， Hirano A，et al.A new alkaloid AM-2282 of streptomyces origin. Taxonomy， fermentation， isolation and preliminary characterization[J].JAntibiot，1977，30（4）： 275-282.

[5].Funato N， Takayanagi H， Konda Y，et al.Absolute configuration of staurosporine by X-ray analysis[J]. TetrahedronLett，1994，35（8）： 1251-1254.

[6]Omura S，Sasaki Y，IwaiY，etal. Staurosporine，apotetially important gift from a microorganism[J]. JAntibiot，1994， 48（7）： 535-548.

[7]Xu Y， Wang C，Liu H， et al. Meroterpenoids and isocoumarinoids from a Myrothecium fungus associated with Apocynum venetum[J].Mar Drugs，2018，16（10）：363.

[8]Fu P，Liu P， Qu H，etal. α-Pyrones and diketopiperazine derivatives from the marine-derived actinomycete Nocardiopsisdassonvillei HR1o-5[J].JNatProd，2011， 74（10）： 2219-2223.

[9]曲鵬，劉培培，付鵬，等.黃河三角洲耐鹽真菌Penicillium chrysogenumHK14-01的次生代謝產物研究[J].微生物學 報，2012，52（9）： 1103-1112.

[10] 陳正乾，劉培培，王又，等.黃河三角洲土曲霉Aspergillus terreusOUCMDZ-1925的抗菌活性聚酮類天然產物的研 究[J].菌物學報，2013，32（2）： 277-285.

[11] 許言超，劉培培，王又，等.黃河三角洲植物真菌的分離、 活性菌株的篩選及活性產物的鑒定[J].中國海洋藥物， 2014，33（4）： 15-20.

[12] 王聰，王立平，范杰，等．深海鏈霉菌Streptomyces malaysiensis OUCMDZ-2167來源的細胞毒性產物[J].有 機化學，2017，37（3）： 658-666.

[13] Wang C， Monger A， Wang L，et al. Precursor-directed generation of indolocarbazoles with topoisomerase I α inhibitoryactivity[J].MarDrugs，2018，16（5）：168.

[14] Yin S，Liu Z， Shen J，et al. Chimeric natural products derived from medermycin and the nature-inspired construction of their polycyclic skeletons[J]. Nat Commun， 2022， 13（1）： 5169.

[15] Cui T，Lin S， Wang Z， et al. Cytotoxic indolocarbazoles from amarine-derived Streptomyces sp. OUCMDZ-5380[J]. FrontMicrobiol，022，13：957473.

[16] 林思敏，徐廣進，高海，等.十字孢堿產生菌篩選及其腫瘤細 胞毒活性產物研究[J].中國海洋藥物，2023，42（3）：36-42.

[17] Liu M， Huang P， Wang Q， et al. Synergistic antifungal indolecarbazoles from Streptomycessp.CNS-42 associated with traditional Chinese medicine Alisma orientale[J]. J

[18]WuSJ，Fotso S，LiF，et al.N-Carboxamido-staurosporine and selina-4（14），7（11）-diene-8，9-diol， new metabolites from a marine Streptomycessp.[J].JAntibiot，2006，59（6）：331-337.

[19]TanidaS，TakizawaM，TakahashiT，etal.TAN-999 andTAN-1o3oA，newindolocarbazolealkaloidswith macrophage-activatingproperties[J].JAntibiot，1989， 42（11）： 1619-1630.

[20] FuP，YangC，WangY，et al.Streptocarbazoles A and B，twonovel indolocarbazolesfromthemarine-derived actinomycete strainStreptomycessp.FMA[J].OrgLet， 2012，14（9）：2422-2425.

[21] ZhouB，QinLL，Ding WJ，et al. Cytotoxic indolocarbazoles alkaloids from the Streptomycessp.A65[J].Tetrahedron， 2017， 74（7）： 726-730.

[22] Wood JL，Stoltz B M，Goodman S N. Total synthesis of （+） -RK-286c， （+） -MLR-52， （+） -staurosporine，and （+） -K252a[J].JAmChemSoc，1996，118（43）：10656-10657.

[23]Nakanishi S，MatsudaY，IwahashiK，etal.K-252b，cand d，potentinhibitorsofprotein kinaseCfrom microbial origin[J].JAntibiot，1986，39（8）：1066-1071.

[24] Xiao F，Li H，Xu M，et al.Staurosporine derivatives generated by pathway engineering in a heterologous host and theircytotoxic selectivity[J].JNatProd，2018，81（8）： 1745-1751.

[25].LiuR，ZhuT，LiD，etal.Twoindolocarbazolealkaloids withapoptosisactivity fromamarine-derivedactinomycete Z2039-2[J]. Arch Pharm Res，2007，30（3）： 270-274.

[26]Fu P，ZhuangY，WangY，et al.New Indolocarbazoles froma mutant strainof the marine-derived actinomycete Streptomyces fradiae 007M135[J]. OrgLett，2012，14（24）： 6194-6197.

[27] StoneRM，ManleyPW，LarsonRA，et al.Midostaurin： Itsodyssey from discovery to approval for treating acute myeloid leukemia and advanced systemicmastocytosis[J]. BloodAdv，2018，2（4）：441-453.

[28] 穆麗麗，牛犇，趙勇.副溶血性弧菌分泌系統在致病力中 作用的研究進展[J].微生物學報，2019，59（4）：621-631.

[29]JacobsSlifkaKM，NewtonAE，MahonBE.Vibrio alginolyticusinfectionsin theUSA，1988-2012[J]. EpidemiolInfect，2017，145（7）：1491-1499.