噬菌體作為載體傳遞CRISPR系統的應用研究進展

中圖分類號：R378 文獻標志碼：A

Advances in the application of phage as a carrier for the delivery of CRISPR system

Chen Xi¹ ，WenYuanxi2，KanBiao12，andFanFenxia1 （1NationalIstituteforCommuicableiseaseontrolandevetio，CineseCenterforseaseControlandPrevetioeiing 102206a;2DepartmentofidemiologydHealthatisticshoolofublicHalthadongUiversitJ）

AbstractBacteriophages，as viruses capable of cracking bacteria，are the most abundant and diverse biological entities on earth.Phage research hasadvanced many fields of biology and molecular biology.Based on the global health issue ofbacterialresistance and health threats caused by excessiveuse and abuseofantibiotics，bacteriophages as potential therapies have attracted atentionagain.Phage therapy has itsadvantages，but also has some limitations. Using genetic enginering and synthetic biology technology， the CRISPR system and phage genome are integrated together，andthephageisusedasadeliverycarrier.Finalyadual-targetedelminationstrategyisformed，inwhich phage accurately targets specific pathogens and CRISPR accurately targets specific genes.Thisarticle introduced the relevant modification strategies and application reports on the recombinant integration of phage and CRISPR sequences，discussed theadvantages and disadvantages of phage as a delivery vector，and proposed theuse of phageCRISPR.

Key wordsTemperate phage; Virulent phage; Lysis; Modification; CRISPR-Cas; Targeted therapy

自噬菌體被發現之初，其潛在治療與預防傳染病的應用價值便備受關注。盡管第一種抗生素的問世導致噬菌體療法一度被邊緣化，但在過去幾十年里，隨著抗生素耐藥性引起的公共衛生問題不斷加劇，噬菌體療法再次成為科學研究焦點。

細菌對抗生素的耐藥性以及耐藥性所帶來的危害日益加重[1-2]，因此，構建新的、更高效的治療策略對于遏制耐藥菌的擴散和延緩耐藥趨勢至關重要。

噬菌體以其獨特的生物學特性，如基因組較小、繁殖速度快等，在遺傳調控、生物學及基因工程研究等領域發揮不可或缺的作用，推動這些領域的發展。相較于抗生素，噬菌體在治療應用上展現出多個優勢：宿主范圍窄，有助于保護宿主的正常共生微生物群、能夠在感染部位進行繁殖、對人類安全無害和生產成本更為低廉[3-4]。實驗室條件、動物模型及臨床上均已證實噬菌體在治療中的有效性。然而，針對臨床上相關耐藥菌的靶向清除，需要大量遺傳背景和生物學特征明確的噬菌體，以盡可能擴大治療范圍，覆蓋多種特定菌株。當前，大多數應用的噬菌體是從環境中分離得到的天然噬菌體。由于噬菌體與細菌之間的復雜關系，以及噬菌體基因組表征信息的缺乏，盲目使用天然噬菌體可能存在潛在的安全風險。噬菌體數量龐大，種類繁多，對其進行全面的表征幾乎是不可能的，這也是噬菌體應用的一個限速步驟。此外，單一噬菌體往往難以具備理想治療所需的所有特性。僅有部分天然噬菌體具備潛在的治療價值。細菌在繁殖進化過程中可迅速獲得噬菌體耐藥性，導致已被批準用于治療的噬菌體失效，進而需要從環境中重新篩選具有更好療效和新特異性的噬菌體。細菌與噬菌體之間無休止地競賽進化，導致治療過程的不可預期和難以控制[3]。因此在天然噬菌體的基礎上，利用合成生物學方法和生物學技術對現有噬菌體進行改造或構建新的噬菌體，以賦予其新功能，成為一種解決策略。這種方法可以彌補天然噬菌體的不足，并有針對性地對噬菌體儲備庫進行擴充和儲備，從而解決目前噬菌體應用過程中存在的一些難題。

噬菌體攜帶CRISPR-Cas系統靶向特定病原菌的特定基因，是基于噬菌體衍生的一種新型的抗微生物療法[5]。CRISPR-Cas系統是基因組上“聚集的規則間隔短回文重復序列”和“CRISPR相關蛋白”的簡稱，作為原核生物的一種適應性免疫系統[]，已被用作基因組編輯工具和耐藥菌清除[8]，以II類CRISPR-Cas系統為例對該系統基本組成進行圖解（圖1）。CRISPR-Cas系統具有高特異性靶向目標基因的優點，能夠特異性識別異己的DNA序列，通過相關的Cas蛋白酶破壞外來DNA序列，并從外來噬菌體和質粒序列中獲得DNA序列作為其新的間隔序列。CRISPR-Cas系統可靶向質粒的特異位點阻斷其橫向轉移[9]，從而防止耐藥性的擴散。亦可靶向誘導病原菌中的耐藥基因DNA雙鏈斷裂，以降低菌株對抗生素的抗性[10]，為耐藥菌的治療提供新的策略。然而，如何將CRISPR系統安全有效地、靶向性傳遞到目標菌中仍然是一個重要挑戰。噬菌體因其能夠感染并裂解特定病原菌的特性，成為傳遞CRISPR系統的理想載體，在病原菌清除方向已成為研究熱點。首先對現有的噬菌體進行基因工程改造，將CRISPR-Cas系統和噬菌體重組到一起。然后將攜帶CRISPR系統的噬菌體單獨或與其他噬菌體或抗生素聯合使用，達到最佳治療目的。基于噬菌體基因組的遺傳改造和修飾，不同噬菌體種類策略也存在差異。本文綜合當前科研文獻的前沿成果，介紹了噬菌體與CRISPR整合產生新型噬菌體-CRISPR重組噬菌體的方法、歸納了其用于治療的應用研究，討論噬菌體作為傳遞CRISPR載體的優勢和局限性，為未來研究和應用提供參考價值。

圖1II類CRISPR-Cas系統的組成示意圖 Fig.1 Schematic diagram of the composition of Class 2 CRISPR-Cassystems

1攜帶CRISPR系統的溫和性噬菌體改造

1.1溫和性噬菌體作為傳遞載體的優勢近年來逐漸興起的CRISPR技術，以其操作簡單、精準靶向等優勢在生物學領域展現出潛在的應用價值，CRISPR-Cas系統的應用更是在基因編輯領域引起了巨大的進步。溫和性噬菌體能夠與宿主染色體整合，并可能發生水平轉移，這一特性雖然在治療應用中引發一定的擔憂，但同時也為其在治療中提供了獨特的優勢。溫和性噬菌體可借助基因工程進行優化，并穩定存在于染色體上，讓治療過程更加持續，降低菌株對于噬菌體抗性的比率。

溫和性噬菌體作為遞送載體也有其獨特的有利特征，自然界中溫和性噬菌體非常豐富，已知的測序細菌中溶源菌占比近 50%^[11] ，這使獲取溫和性噬菌體變得相對簡單。此外，隨著測序技術的發展，海量的基因組測序數據為溫和性噬菌體的分析和識別具有整合酶標記的溫和性噬菌體提供有力支持。相較于從自然界中分離，從基因組上直接將溫和性噬菌體誘導下來而獲得噬菌體更為容易。合成生物學的發展進一步推動溫和噬菌體在治療領域的應用。通過工程化改造的溫和性噬菌體可作為載體傳遞干擾細菌生存的基因網絡，引起細菌的死亡或使耐藥菌恢復對抗生素的敏感性，此方法不會引起細菌裂解，降低了因細菌裂解引起的內毒素釋放[12]。

1.2溫和性噬菌體作為傳遞載體的局限性

過去，溫和性噬菌體往往因其獨特的生物學特性被認為不適合用于傳統的噬菌體治療策略，因為它們可整合于感染的宿主菌的基因組中，并作為可移動遺傳元件參與水平基因轉移事件[18]。傳統的噬菌體治療優選烈性噬菌體作為研究對象，溫和性噬菌體通常會選擇溶源性生命周期，整合到宿主的基因組中，并在特定的環境壓力或外界刺激下，從染色體上解離下來，進入裂解周期。然而，在噬菌體組裝釋放再感染過程中可能伴隨轉導時間的發生。轉導，即噬菌體將宿主的遺傳物質從一個細菌轉移到另一個細菌的過程。通過普遍轉導或定向轉導引起的細菌耐藥基因或毒力基因的潛在轉移普遍轉導發生時，細菌DNA隨機片段在噬菌體組裝過程中，連同噬菌體的DNA一起包裝到噬菌體顆粒中，之后轉移到新的宿主。普遍轉導的發生在溫和性噬菌體和烈性噬菌體治療中均難以避免。定向轉導一般與溫和性噬菌體有關，宿主細胞染色體中與噬菌體基因組相鄰的基因可能會錯誤地與噬菌體基因組被剪切下來，并整合到新感染的細菌宿主染色體中。

此外，當溫和性噬菌體整合到細菌染色體后，存在超感染免疫排斥現象，導致原本噬菌體敏感的菌株在后續治療中失去對噬菌體的敏感性[12]。更重要的是，溫和性噬菌體主要以溶源周期存在，不會立即導致殺菌效果[13]。因此，在設計和實施噬菌體治療策略時，需審慎考慮溫和性噬菌體的這些特性，以確保治療的安全性和有效性。

1.3溫和性噬菌體作為傳遞載體的優化及其與CRISPR重組

帶有毒力或耐藥基因的噬菌體不能作為CRISPR-Cas系統遞送載體。一些噬菌體可引起宿主毒力或耐藥基因橫向移動，導致相關基因的水平傳播[14]，比如：金黃色葡萄球菌的噬菌體攜帶毒力因子、銅綠假單胞菌噬菌體攜帶的碳青霉烯酶基因、致病性大腸埃希菌入家族噬菌體中發現了含有編碼志賀毒素基因、霍亂弧菌絲狀噬菌體CTXphi攜帶霍亂毒素基因ctxAB。此類噬菌體若用作遞送載體需要將毒力或耐藥基因刪除。如，將葡萄球菌細胞毒素和腸毒素基因從其溫和性噬菌體基因組中刪除，再作為傳遞CRISPR-Cas系統的載體，通過海藻酸鹽水凝膠傳遞改造后的噬菌體，用于治療小鼠軟組織中金黃色葡萄球菌菌株的感染[15]。利用基因組測序和流行病學作為輔助分析工具，可能有助于提高噬菌體遞送的安全性，為限制其毒力或耐藥性的傳播提供更好的預防控制策略[16]。

刪除溫和性噬菌體攜帶的維持溶源性生命周期的關鍵基因，可將其轉變為烈性噬菌體，并利用合成生物學進一步改進，作為嚴格的烈性噬菌體使用。艱難梭菌的溫和性噬菌體可與其內源性的I-B型CRISPR-Cas系統重組，重組噬菌體比其野生型親本噬菌體更有效在殺死艱難梭菌，進一步將溫和性噬菌體改造為烈性噬菌體，更有助于艱難梭菌噬菌體在治療應用中的適應性[17]。

溫和性噬菌體作為CRISPR遞送載體可與烈性噬菌體聯合使用。工程化修飾的溫和性噬菌體聯合烈性噬菌體可逆轉質粒介導的耐藥性。將I-ECRISPR-Cas系統整合到大腸埃希菌溫和性入噬菌體基因組中，該系統由一系列重復的序列單元以及這些單元兩側的特定序列一一即所謂的“間隔序列”一一共同構成。這些間隔序列在轉錄過程中形成被稱為“間隔物”的RNA分子，能夠引導特定的Cas蛋白精確識別并定位到目標核酸序列上。這些目標核酸序列由于與間隔物具有高度的序列同源性，被稱為“原間隔物”。一旦識別到目標，該系統便能通過適當設計的間隔物特異性地降解或編輯任何特定的核酸片段。因此I-ECRISPR系統的間隔區序列可靶向耐藥質粒攜帶的β內酰胺酶基因，改造后的λcas-CRISPR噬菌體攜帶CRISPR系統可阻止質粒引起的耐藥基因的傳播。烈性噬菌體T7經改造攜帶一段DNA序列，這段DNA序列可被入cas-CRISPR噬菌體攜帶的CRISPR系統識別，如此，攜帶λcas-CRISPR噬菌體的細菌具有了可抵抗T7噬菌體侵染的選擇優勢。當入cas-CRISPR和烈性噬菌體T7同時感染病原菌時，細菌不僅可恢復對抗生素的敏感性，同時也避免了被T7裂解的命運，最終對于抗生素敏感的細菌就被富集，T7只能針對耐藥菌專向裂解。此方案被建議用于醫院地面和扶手的清潔，可將耐藥菌轉變為抗生素敏感菌，此方案也僅限于質粒傳播耐藥性的應用，不能用于細菌染色體上耐藥基因的清除[21]。

溫和性噬菌體可與抗生素聯合使用達到更佳的治療效果。與細菌基因組工程相比，噬菌體基因組的修飾更具挑戰性，這主要由于噬菌體缺乏選擇性標記，導致需要費力地篩選重組/突變的噬菌體變體。溫和性噬菌體遞送CRISPR的策略還在不斷改進和優化，以大腸埃希菌新分離的溫和性噬菌體為例，經過改造重組，可利用輔助質粒攜帶sacB基因（編碼一種來自枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）的果聚糖蔗糖酶，可作為負篩選標記）構建篩選系統以建立一步克隆方法，用于CRISPR-Cas9序列整合后陽性轉化菌株的簡便篩選，重組噬菌體靶向耐藥菌結合抗生素建立聯合治療策略（PRESA），并進一步追蹤發現溫和性噬菌體攜帶CRISPR系統聯合抗生素靶向耐藥菌的策略不易引發菌株對于噬菌體抗性的突變， 8h 內目標質粒清除率大于 99.99% ，達到徹底阻止耐藥性傳播的目的[19]。同時，通過金黃色葡萄球菌的溫和性噬菌體來遞送CRISPR-Cas9系統，靶向金黃色葡萄球菌中的特異性基因nuc，可實現對金黃色葡萄球菌高效殺滅?？偟膩碚f，通過調整溫和性噬菌體的特征以實現裂解活性或通過改造優化其綜合特性，基于溫和性噬菌體的工程化噬菌體可進一步擴充噬菌體庫，并有望用于治療。

2攜帶CRISPR系統的烈性噬菌體改造

盡管溫和性噬菌體經過改造修飾后展現出潛在的應用價值，但自前烈性噬菌體仍然是噬菌體治療領域的主要選擇。雖然有眾多研究聚焦于利用CRISPR系統對烈性噬菌體進行改造修飾，例如通過構建CRISPR-Cas編輯策略，在CRISPR-Cas9核酸酶的強大選擇壓力下，篩選編輯過的T4噬菌體突變體，進而評估其遺傳特性的變化[20]。同時，CRISPR-Cas系統也被證明能夠有效促進大腸埃希菌噬菌體T7突變體的篩選過程[21]。然而，關于烈性噬菌體整合CRISPR系統，即烈性噬菌體作為傳遞載體的報道相對較少。值得注意的是，一些最新的報道已經將相關應用推進至臨床試驗階段。例如：以臨床來源的耐藥性大腸埃希菌為宿主，分離到的162株烈性噬菌體，根據受體互作和宿主菌的高覆蓋率確定了8個用于大腸埃希菌治療的噬菌體組合，進一步優化其尾絲蛋白及重組CRISPR-Cas系統后，最終確定了四個用于動物模型的工程噬菌體組合（SNIPR001），該工程噬菌體組合可靶向生物膜中的耐藥菌株，并極大減少耐受噬菌體的大腸埃希菌的出現概率，目前該噬菌體試劑已進入臨床試驗階段以評估SNIPR001d的安全性的能力及其在不擾亂整體腸道微生物群的情況下減少腸道中大腸埃希菌的能力（NCT05277350），作為高風險患者群體中其他危及生命的抗菌素耐藥病原體窄譜治療的藍圖[22]。

烈性噬菌體可直接將病原菌殺死，得益于大部分烈性噬菌體基于其自身的裂解能力和穩定性，不需要再聯合CRISPR靶向特定基因，這可能是有關烈性噬菌體整合CRISPR系統的應用研究相對較少的重要原因之一。

3CRISPR-Cas系統與噬菌體整合重組常用的技術策略

將CRISPR整合到噬菌體基因組是一個關鍵問題，根據成熟的分子生物學技術及目前可利用的基因工程改造技術，歸納總結了以下5種可將CRISPR序列插入到噬菌體基因組的改造方法，模式圖詳見圖2。

注：（A）利用同源重組技術將CRISPR系統整合到噬菌體基因組；（B）利用BRED技術將CRISPR-Cas序列重組到噬菌體組；（C）基于酵母平臺的噬菌體改造技術；（D）利用Gibson組裝產生攜帶CRISPR序列的重組噬菌體；（E）利用CRISPR-Cas基因組編輯技術改造噬菌體。

圖2噬菌體攜帶CRISPR的改造技術Fig.2Modification technology of CRISPR for phage delivery

3.1同源重組技術

明確CRISPR系統整合到噬菌體上的插入位點（基因編碼區或非編碼區均可），保證此位點插入CRISPR后不會影響噬菌體的感染和擴增。根據插入位點的上下游區域的DNA序列，通過重疊PCR得到“上游序列-CRISPR-Cas序列-下游序列”的PCR產物，將此產物連接到相關質粒上，質粒攜帶與噬菌體基因組同源的區域被引入宿主細胞中，在噬菌體感染時，在質粒和噬菌體基因組之間發生同源重組，導致產生重組噬菌體[23]。此方法重組效率偏低，建議重組噬菌體帶有篩選標記。

3.2電擊轉化噬菌體DNA重組技術（BRED）

先將編碼高水平重組酶RecE/RecT的質粒轉化到宿主細胞，然后將噬菌體DNA和需要重組的CRISPR-Cas序列電擊共轉化到宿主菌內，在重組酶作用下發生重組，篩選鑒定重組噬菌體，此方法重組效率高達 3.4%～22.2%l? 24-25]。

3.3基于酵母的平臺

該方法利用釀酒酵母作為中間宿主進行遺傳操作。酵母人工染色體容量大，對于噬菌體編碼的裂解酶和抑菌蛋白等有毒物質不敏感，噬菌體基因組或橫跨整個噬菌體基因組的多個重疊PCR片段被共轉化，用線性化的酵母人工染色體（YAC）轉化為酵母細胞。由于YAC基因組上含有與噬菌體基因組的末端同源序列，它們之間發生同源重組，噬菌體基因組被捕獲在YAC中。然后從酵母細胞中提取所得的YAC噬菌體DNA并進行轉化入大腸埃希菌中，從而獲得改造后的重組噬菌體[26]。

3.4Gibson組裝

即一種能夠在單個反應管內通過等溫反應將多個DNA片段組裝起來的一種分子克隆技術。通過PCR擴增技術獲得噬菌體的多個基因組片段，同時將需要插入的CRISPR序列與噬菌體插入位點兩側的DNA序列重疊擴增，由Gibson組裝并轉化到細菌宿主中以釋放重組突變的噬菌體[27]。

3.5 CRISPR-Cas基因組編輯

將行使基因編輯功能的CRISPR系統1的質粒1轉化到宿主菌中，攜帶包含噬菌體同源區域及需要插入的CRISPR序列2（上游序列-CRISPR序列2-下游序列）的供體質粒2，此處建議質粒1上行使編輯功能（將CRISPR序列2插入到噬菌體基因組上）的CRISPR序列1與CRISPR序列2序列不同。噬菌體感染時，行使剪切功能的CRISPR質粒1將插入位點切割開，導致基因組失活。由于供體質粒2存在，和噬菌體基因組發生重組，這樣需要插入的CRISPR序列2就整合在噬菌體的特定位點，即得到改造后的重組噬菌體[22]。

4噬菌體遞送CRISPR-Cas系統的局限性及應對策略

因溫和性噬菌體和烈性噬菌體均可作為載體遞送CRISPR-Cas系統，本部分討論的內容對于兩種噬菌體類型均適用。我們還總結歸納了兩種類型的噬菌體作為傳遞CRISPR載體的基本特性（表1）。

噬菌體作為遞送載體雖然具有潛在的應用價值，但在實際應用過程中仍面臨諸多挑戰，例如：宿主范圍較窄、細菌的噬菌體抗性及安全性等問題[28]。通過連續多宿主分離噬菌體的方法，可挑選出裂解能力增強，同時裂解大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的多宿主或廣宿主的噬菌體[29]；烈性噬菌體作為遞送載體時，宿主菌容易產生對噬菌體的抗性，通過噬菌體雞尾酒療法對多例鏈球菌感染受試者的治療，以提高治療效果并降低宿主菌產生抗性的風險[30]。溫和性噬菌體和烈性噬菌體均可作為CRISPR系統遞送的載體。CRISPR系統可被重組到噬菌體基因組[31]，形成CRISPR-噬菌體系統，重組后的噬菌體和野生型噬菌體無異，能夠利用LPS、外膜蛋白、鞭毛蛋白、菌毛（革蘭陰性）、肽聚糖、磷壁酸/磷壁酸-肽聚糖聚合物（革蘭陽性）等受體，黏附于目標病原體上，將CRISPR通過噬菌體基因組傳遞到病原體中[32]，通過序列識別，Cas酶在目標菌內表達，導致基因結構缺陷，降低細菌耐藥性[33]。然而，在細菌和噬菌體共培養過程中，位于細菌表面的噬菌體受體會產生突變，降低噬菌體的黏附能力，引發菌株的噬菌體抗性。為解決此問題，可針對噬菌體的受體結合蛋白進行改造和篩選，利用多種受體類型的噬菌體組合，或者針對抗性菌株進一步篩選能夠裂解抗性菌株的噬菌體突變體來彌補這一局限性[34-35]。

將噬菌體包埋在海藻酸鹽中、借助脂質體或聚乙二醇基均可增加噬菌體的吸附、分散和持久性，也能延緩其從體內的清除時間[36]。納米材料也可用于優化CRISPR系統的遞送，解決噬菌體宿主范圍窄的問題[37]。納米載體能夠包封CRISPR材料，保護其在生物體中免受核酸酶和蛋白酶的降解[38]，并通過修改其物理化學性質來優化噬菌體對病原菌的靶向和釋放能力。以特定的方式修改納米制劑的物理化學性質對其靶向病原菌進行優化，可以更有效地增強噬菌體藥物的分布。DNA具有負電荷，Cas9納米載體具有凈正電荷，納米顆粒表面的正電荷通過與帶負電荷的細胞膜表面相互作用，能夠增加細菌表面噬菌體負載能力。

表1不同噬菌體類型作為遞送CRISPR載體的特征分析

'ab.1Characterizations of different phage types as CRISPR delivery carrier

監測病灶部位CRISPR遞送后的激活狀況的是個難題，而高劑量CRISPR藥物的使用，亦會增加健康組織或非靶向基因攜帶和被編輯的風險[39-42]。此外，由于大多數噬菌體的基因功能尚未完全了解，烈性或溫和性噬菌體是否可能參與未被識別的不良事件還有待研究。

5展望

在噬菌體改造過程中，深入了解刪除或者替換的噬菌體基因功能至關重要，也有利于噬菌體改造過程中技術方案的選定和策略優化。隨著基因組測序技術的飛速發展，已獲得海量的噬菌體預測信息或分離株。然而，由于噬菌體的高度個性化特征和變異度，關于噬菌體的基因組注釋信息相對匱乏，大部分噬菌體（包括溫和性噬菌體和烈性噬菌體）攜帶許多功能未知的基因，這些基因的編碼產物在感染宿主時可能引起的不良事件，需要在噬菌體治療過程中進行動物或者人體實驗評估。

“致殘而不致死”的策略，作為溫和性噬菌體用于治療的一個新的探索方向。烈性噬菌體用于治療，因細菌破碎引起的內毒素釋放是烈性噬菌體應用的一個限速步驟。溫和性噬菌體和CRISPR重組后，能夠直接靶向病原菌毒力基因或者通過影響毒力的相關調控通路間接影響致病性，從而在不裂解細菌的情況下，顯著降低其毒力、代謝或生存能力，達到抑菌治療效果[43]。例如，破壞銅綠假單胞菌群體游動性相關基因可大大降低細菌毒力及生物膜形成能力[44]。

噬菌體雞尾酒的治療策略對于烈性噬菌體或溫和性噬菌體均適用，也是目前通過噬菌體優勢互補來提高噬菌體治療的最佳策略之一。多種噬菌體組合使用可顯著減少噬菌體抗性菌株的出現。特別是對于難以分離烈性噬菌體的菌株，如艱難梭菌[45]的溫和噬菌體組合雞尾酒的報道陸續出現，由四種特性良好、宿主范圍廣泛的肌病毒組成的艱難梭菌噬菌體雞尾酒，使用批量發酵模型的體外噬菌體治療試驗發現這種療法能夠完全根除發酵容器中艱難梭菌的細菌負荷，促進共生菌生長，有效防止艱難梭菌再定植[46]。當然，不同的噬菌體個性化組合仍需通過實驗驗證其效果。此外，溫和性噬菌體的突變體與烈性噬菌體的聯合治療也取得不錯的效果，例如銅綠假單胞菌的噬菌體phi297的vir突變體與烈性噬菌體混合，可顯著降低抗性菌株的總體突變頻率，可能是溫和性噬菌體的vir突變體靶向了額外的宿主受體，減少了抗性菌株[47]。所以溫和性噬菌體的突變體可能是防止抗性菌株出現的一種可能的治療方法。總之，噬菌體作為CRISPR系統傳遞的載體在原核病原菌清除方向的應用，已取得不錯的研究進展，但也存在不足，需要進一步探索。

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