抗菌肽的活性優化及異源表達研究進展

中圖分類號：R945，Q78 文獻標志碼：A

Progress on the activity optimization and heterologous expression of antimicrobial peptides

ZhangMeilingl2，SongJia2， Sun Bo² ，Yan Xue， Zhao Chen2，and Zhang Wanzhong1 （1 College ofEnvironmentalandSafetyEnginering，Shenyang Universityof ChemicalTechnology，Shenyang10142; 2 AcademyofNationalFoodandStrategicReserves Administration，Beijing 10oo37;3NewHopeLiuheLimitedCompany/Key Laboratory ofQualityControl forFeedand Products ofLivestockand Poultry of Sichuan Province，Chengdu 610023）

AbstractAntimicrobial peptides （AMPs） are a class of polypeptides with antimicrobial activity. Compared with traditional antibiotics，AMPs have broad-spectrumantibacterialactivityand can overcome the drug resistance of pathogenic microorganisms，so they have become the hotspot of “antibiotic alternatives”research. Although antimicrobial peptidesare promising inthefelds of medicine，lifescience，and feed industry，many problems stil remain，suchas high acquisitioncost，short half-life，andthegapin minimum inhibitoryconcentrations compared to antibiotics，etc.，which limittheir furtherdevelopment andapplication.Therefore，the studyontheoptimizationof the AMPs acquisition method and the improvement of biological activities is necessry. In this review，the structure types and biologicalactivitiesof the AMPs were briefly introduced，the activity optimization and heterologous expression of antimicrobial peptides were extensivelysummarized，and the future of their industrialization was also prospected in order to provide references for the development and application of antimicrobial peptides.

Key wordsAntibacterial peptides; Biological activity; Structure optimization; Heterologous expression

抗生素耐藥性問題已成為全球主要的公共衛生威脅之一，因此迫切需要創新型抗生素替代產品。具有獨特抗菌機制的抗菌肽（antimicrobialpeptides，AMPs能有效預防和控制病原微生物的耐藥性，同時具有良好的生物活性和可降解性，開發前景廣闊。截至2024年1月，已發掘的抗菌肽接近4000種（數據來源Antimicrobial Peptide Database，https：//apsunmc.edu）。抗菌肽的作用機制主要是通過形成離散孔或破壞膜雙層結構使細胞內容物外泄，從而導致細胞死亡；還可以通過多模式結合胞內靶點，來抑制核酸、蛋白質或細胞壁等的合成以發揮生物活性[1；部分抗菌肽對機體免疫調節也至關重要。目前，在醫藥、飼料添加劑等領域已有許多抗菌肽產品進入市場（表1）。

表1部分抗菌肽產品Tab.1 Some antimicrobial peptide products

1抗菌肽的結構及生物活性

1.1抗菌肽的結構

抗菌肽分子量一般在 1～10kDa 范圍內，通常由20～60 個氨基酸殘基組成，具有陽離子性、疏水性和兩親性特征。根據它們的二級化學結構，可大致分為4類： a -螺旋（α-helical）、 β -折疊（β-sheet）、線性延伸（extended）和環狀（cyclic）（圖1）。

a -螺旋肽的主要特點是不含半胱氨酸，不形成分子內二硫鍵，在水溶液中無序，但在膜或膜模擬環境中形成兩親螺旋結構，易通過化學方法合成，是目前抗菌肽的主要研究重點，常見的α-螺旋抗菌肽有：天蠶素（cecropins）、乳鐵蛋白肽H（lactoferricinH）（圖1a）。 β -折疊肽分子中包含二硫鍵用以穩定肽結構并促進穿透細胞膜，相較于目前研究廣泛的α-螺旋肽，β-折疊肽擁有更強的抗酶解能力和更高的細胞選擇性。孫棟等[7在抗菌肽TPI結構基礎上，將形成TPI的4個半胱氨酸用酪氨酸進行替換，得到一種全新的β-折疊肽TPI-Y4，經生物信息學分析，TPI-Y4的熱穩定性更好，親水性更強，抑菌試驗表明，TPI-Y4對細菌和真菌的抗菌活性提高，經圓二色譜分析這可能與β-折疊結構增強有關。線性延伸肽缺乏典型的二級結構，但富含特定氨基酸，如富含脯氨酸的昆蟲瘤素（insectneoplastic）、富含色氨酸的乳鐵蛋白（lactoferricin）以及富含組氨酸的組胺素-3（histamine-3）等。大多數線性延伸肽是通過肽和膜脂質之間的氫鍵或分子間作用力來發揮抗微生物活性，而不依賴于殘基之間的氫鍵。環狀抗菌肽是由一個或多個二硫鍵形成的環狀結構的肽，肽環化會賦予高結構穩定性，進而賦予與靶分子更強的結合能力，所以環狀抗菌肽能提供較高的代謝穩定性、更好的膜滲透性和良好的口服生物利用度。與線性肽相比，環肽對內肽酶和外肽酶水解更具抗性，被認為是最具前景的生物藥物支架[8]。

圖1不同結構的代表性抗菌肽 Fig.1 Representative antimicrobial peptides of the different structures

注：（a） a -螺旋肽（LactoferricinH，PDB：1Z6V）；（b） β -折疊肽（Thanatin，PDB：8TFV）；（c）線性肽（Bovincindolicidin，PDB：5ZVF）；（d）環狀肽（AureocinA53，PDB：2N8O）。

大量抗菌肽的結構與活性分析研究表明，分子結構與抗菌肽的生物活性密切相關：如增加二硫鍵，抗菌功能可能會增強； D -型氨基酸殘基替換相應的L-型氨基酸殘基能有效增強抑菌活性；疏水性通常與抗菌活性呈正相關，但過高的疏水性、緊密的剛性結構也可能會對正常細胞產生毒性。所以對肽結構進行合理的設計和優化是抗菌肽研究中不可或缺的環節。

1.2抗菌肽的生物活性

1.2.1 抗細菌活性

抗菌肽可以殺死侵入宿主體內的細菌或抑制其生長，對于革蘭陰性菌和革蘭陽性菌均有抗菌效果。Campoccia等[9]檢測到多肽dadapin-1表現出顯著的抗細菌活性，對革蘭陽性菌的最小抑菌濃度（MIC）值為 3.1～6.2μmol/L ，對革蘭陰性菌的MIC值為 12.4～24.9μmol/L ，且無細胞毒性；Denardi等[10]利用微量稀釋法測定抗菌肽MSI-78對大腸埃希菌（Escherichiacoli）、銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）、鮑曼不動桿菌（Acinetobacterbaumannii）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的MIC，結果表明MSI-78對供試菌株均有殺菌活性，MIC范圍為 1.25～40mg/L 。此外，抗菌肽不僅自身具有良好的抗細菌活性，與傳統抗生素之間也存在良好的協同作用，兩者聯用可提高藥物療效，實現廣譜抗菌。如APSH-07是通過高效定向誘導植物乳桿菌表達的一種抗菌肽，與阿莫西林（amoxicillin）、土霉素（oxytetracycline）、硫酸慶大霉素（gentamycinsulfate）、硫酸新霉素（neomycinsulphate）、鹽酸多西環素（doxycyclinehyclate）聯用時，MIC值降為APSH-07單獨作用時的1/8～1/2，與阿莫西林聯用時聯合抗菌效果最好，FIC指數均小于或等于0.5，可見抗菌肽與抗生素的相互促進作用明顯。

1.2.2 抗真菌活性

在真菌中，一些抗菌肽會通過抑制真菌細胞壁組分如葡聚糖、幾丁質和糖蛋白的合成來發揮抗真菌作用。例如，nikkomycinZ[12]是由腱鏈霉菌（Streptomycestendae）產生的一種核苷肽，可以作為幾丁質合酶的競爭性抑制劑，從而引起細胞死亡和生物膜結構稀疏，特別是抑制白念珠菌（Candidaalbicans）或近平滑念珠菌（Candidaparapsilosis）生物膜；AMP-17[13]是一種新型家蠅抗菌肽，經AMP-17處理后白念珠菌細胞的生長受到顯著抑制、形狀變得不規則，與未處理的細胞相比，處理組細胞的細胞壁完整率僅為 21.7%^[14] 。目前，具有代表性的抗真菌肽還有卡泊芬凈（caspofungin）、米卡芬凈（micafungin）和阿尼芬凈（anidulafungin）。

1.2.3 抗病毒活性

抗菌肽中具有抗病毒能力的肽又被稱為抗病毒肽（antiviral peptides，AVPs），約占抗菌肽的 15% 。病毒與其他微生物的不同之處在于，它們具有超強的復制能力、高度的遺傳變異能力以及在宿主細胞中持久存在的能力，且抗生素藥物對其沒有作用，而抗病毒肽不僅可以直接抑制或殺死病毒，還可以在病毒復制周期的各個階段發揮抗病毒作用，也可以通過干擾細胞信號傳導途徑和調節宿主免疫系統來抑制病毒感染[15]。目前對于抗病毒肽的研究重點更傾向于尋找和開發能夠破壞病毒包膜并阻斷病毒進入細胞的AVPs，以減少進入宿主細胞的病毒載量。盡管具有抗病毒活性的抗菌肽數量仍然很低，但它們已經顯示出可臨床應用的潛力。

1.2.4 抗腫瘤活性

抗菌肽抗腫瘤的機制主要包括4個方面：招募免疫細胞（如樹突狀細胞）殺死腫瘤細胞；誘導癌癥細胞壞死或凋亡；抑制血管生成；激活某些調節功能蛋白以干擾腫瘤細胞的基因轉錄和翻譯。如B1-Leu肽[16是從抗菌肽cathelicidin-BF衍生的結構優化化合物，其中B1-Leu-3和B1-Leu-6不僅具有抗腫瘤活性，還具有破壞腫瘤細胞膜穩定性的活性，可作為開發新型抗癌藥物的先導化合物。

2抗菌肽的設計與優化

抗菌肽應用領域廣泛，食品領域可應用于食品原料的安全控制、食品防腐保鮮等；飼用領域可用作飼料添加劑，有效預防并治療畜禽疾病等；醫學領域，不僅有望替代抗生素，有些抗菌肽還能夠選擇性地抑制腫瘤細胞及癌細胞，是一種較為理想的藥物候選原料。即便如此，抗菌肽的穩定性、毒性，尤其是生物活性等還是會受到很多因素的影響，限制其實際生產應用，這也凸顯出抗菌肽優化的重要性。目前，設計與優化抗菌肽的方法主要包括傳統的化學改造與修飾、計算機輔助設計以及高通量篩選等。

2.1化學改造與修飾

化學改造與修飾包括點突變、構建雜交肽、環化等策略。

2.1.1 點突變

通過堿基替換引入天然氨基酸或非天然氨基酸殘基，是多肽優化設計中最常用的方法。Ramezanzadeh等[7]用帶正電荷的賴氨酸取代帶負電荷的氨基酸殘基，設計了天然肽aurein1.2的一系列衍生肽，與母肽相比，衍生肽aureinM3對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的MIC增強了8～64倍；stigmurin是一種蝎毒肽，Amorim等[18]用帶正電荷的賴氨酸殘基分別替換天然肽中極性且不帶電荷的絲氨酸和甘氨酸殘基，得到類似肽StigA25和StigA31，兩種肽對革蘭陽性菌的MIC均為親本肽的1/4，對革蘭陰性菌的MIC為親本肽的1/70～1/10。

2.1.2 雜交肽

雜交是通過將不同優勢的肽組合成新型抗菌肽，以達到增強抗菌活性、增強靶標選擇性或降低毒性的目的。Narh等[19]設計了一種新型雜交抗菌肽LL-37-renalexin，其對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcusaureus）和肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumoniae）臨床分離株的MIC為10～33μmol/L，與單肽LL-37和renalexin相比，降低到1/3～1/5；Kim等[20]將靶向肽PA2和高效抗菌肽GNU7組合，得到雜交肽PA2-GNU7，實現了特異性靶向銅綠假單胞菌。因此，構建雜交抗菌肽也是提高抗菌肽特性的重要策略。

2.1.3 環狀肽

環狀肽通常是通過頭尾、頭側鏈或側鏈到側鏈的環化反應產生的，環化促進了環結構內的分子內氫鍵形成，降低了分子極性，空間構象更穩定。Mwangi等[21]通過在靠近N-和C-末端的地方引入兩個半胱氨酸殘基，將線性抗菌肽cathelicidinBF15-a3轉化為環肽ZY4，該環肽對大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌、金黃色葡萄球菌均具有良好的抗菌活性，MIC范圍為 1.5～2.0μmol/L ，均高于線性肽cathelicidinBF15-a3，且血清穩定性高。

2.2計算機輔助設計

近年來，隨著生物信息學和人工智能的發展，計算機輔助設計抗菌肽成為研究熱點。在計算機輔助技術出現之前，大多數新型抗菌肽都是通過對數百或數千種分離株進行艱苦篩選并鑒定的，如細菌素[22]，但培養基的種類、指示劑的選擇和生長條件等都會降低抗菌肽檢測的可能性。利用計算機輔助設計，可以快速篩選出抗菌活性強、選擇性高和溶血性低等性能良好的抗菌肽，通過修飾改造抗菌肽結構或從頭設計，還能進一步提高抗菌肽的生物活性。例如，Das等[23]使用基于變分推斷的自編碼器（variationalautoencoder）學習通用蛋白質資源（universal protein resource）中的約170萬條多肽，并將它們按抗菌能力強弱分為兩類，通過建立多肽抗菌能力的“分類器”獲得高活性的新型抗菌肽YI12和FK13，經驗證，其半數溶血值 （HC₅₀） 和半數致死量 （LD₅₀） 都遠高于MIC值，其中LD₅₀ 值可以媲美抗生素藥品多黏菌素B；Waghu等[24]建立了抗菌肽家族cathelicidins的定量結構-活性關系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）模型，建立了藥物分子結合能力和活性之間的關系，準確預測了對大腸埃希菌ATCC25922菌株有活性的新肽CP和mapcon，經驗證對大腸埃希菌的MIC分別為 16.25～12.5μmol/L 和 25～50μmol/L ；王昱璇等[25]利用三維定量構效關系（3D-QSAR）中兩種經典的方法CoMFA和CoMSIA對29條肽進行建模研究得到了3條新型直鏈肽，又基于環肽的特點將這些直鏈肽合成環肽，最終得到的4條抗菌環肽對鮑曼不動桿菌多重耐藥菌（Acinetobacter baumannii multidrug-resistantbacteria）、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌均有一定的抑菌效果，其中環肽P4效果最好，MIC為 16μg/mL 。

計算機輔助設計具有高速的計算能力、巨大的存儲能力和邏輯判斷能力，這種設計方法大大提高了設計質量，縮短工作周期，為開發新的抗菌肽產品創造了有利條件。

2.3高通量篩選

高通量篩選（high throughput screening，HTS）的優勢是操作簡單、安全，結合儀器，可以通過一次實驗獲得大量信息，并快速實現抗菌肽活性的提高。ClassIIa類抗菌肽具有抑菌譜廣、穩定性高、安全高效等優點，易華西等[26經高通量篩選從275株乳酸菌中篩選得到ClassIIa抗菌肽產生菌株5株，其中菌株4121具有很大優勢，所產抗菌肽在 pH2.0～8.0 的寬范圍內均具有抑菌活性；張曉燕[27通過結合噬菌體展示技術、高通量測序和生物信息學方法，獲得4種能與膿毒癥致病菌特異性、強結合的7肽序列，利用這些序列的靶向性，與抗菌肽LL-37構建融合蛋白，體外抑菌實驗顯示，其中的VTK-LL37抑制致病菌生長作用有明顯提升，在 濃度下仍具有抑菌效果。

此外，還有自組裝、短片段重復設計肽等多種設計優化方法，這些方法各有優劣，在對抗菌肽進行優化時，還需依據客觀條件選擇合適的策略。

3抗菌肽的異源表達

相比于傳統的從生物體內直接分離純化抗菌肽或化學合成抗菌肽等方法，利用重組表達系統生物合成抗菌肽操作更簡便，且經濟環保，已逐漸成為獲取抗菌肽的主要途徑之一。常用的表達系統有原核生物、真核生物和桿狀病毒表達系統。這三種表達系統各具特點，在進行抗菌肽表達時，可以根據其特點選擇合適的表達系統（表2）。

3.1原核生物表達系統

3.1.1大腸埃希菌表達系統

大腸埃希菌表達系統是實驗室研究和商業開發的首選系統，是最基礎的細菌表達系統。Alem等[28]利用大腸埃希菌系統成功表達并純化了來自青藉（CelosiaargenteaL.）中的抗菌肽Aq，表達產量可高達 38mg/L 。抗菌肽分子量小、易被蛋白酶水解，因此，可將抗菌肽與一個蛋白質連接進行融合表達，然后通過試劑或酶處理除去連接蛋白，獲得純抗菌肽。如Cheng等[29]在大腸埃希菌BL21（DE3）中建立了SUMO融合表達系統，經TEV蛋白酶高效切割后，重組新型雜合肽CLP的產率為 27.56mg/L ，純度93.6% ，對銅綠假單胞菌337005的MIC為 2μg/mL 對金黃色葡萄球菌1882的MIC為 8μg/mL ，對產腸毒素大腸埃希菌K88的MIC為 2μg/mL 。雖然大腸埃希菌已被廣泛用作異源蛋白質表達的宿主，但仍存在某些限制，如容易產生內毒素，不能用于修飾蛋白表達等。

3.1.2乳酸桿菌表達系統

目前市面上改造后的乳酸桿菌（Lactobacillus）工程菌幾乎不分泌本源蛋白，可降低抗菌肽被內部分解的風險，因此相較其他表達系統存在天然優勢，目前已有多種抗菌肽在乳酸桿菌中實現成功表達。例如，Zhang等[30]將PR39基因片段插入干酪乳酸桿菌（Lactobacilluscasei）分泌表達載體pPG：612，成功實現了豬抗菌肽PR39在重組干酪乳酸桿菌中的表達，體外抗菌試驗表明，PR39肽在重組菌中的表達對大腸埃希菌和沙門菌（Salmonella）均有抗菌作用；片球菌素（pediocin）PA-1是一種廣譜乳酸菌細菌素，Ma等[31]選擇植物乳桿菌（Plant lactobacillus）LB-B1作為宿主，表達片球菌素PA-1的先導肽小菌素（microcinV，經Tricine-SDS-PAGE凝膠實驗，microcinV在植物乳桿菌LB-B1中可以成功表達和分泌。

乳酸桿菌作為一種益生菌，菌體本身對機體有益生作用，其分泌的多種物質是機體必不可少的且不產生內毒素，有作為動物飼料添加劑的潛力。若導入外源基因，就可以集菌體、自泌物質和外源蛋白于一體，為抗菌肽開發提供新思路。

3.1.3枯草芽孢桿菌表達系統

枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）是動物飼料中常添加的益生菌種，同時作為基因工程菌也為抗菌肽的生產提供了一條良好的途徑。張立聰等[32]以枯草芽孢桿菌WB800N為宿主菌株， 6% 麥芽糖誘導重組融合肽cecropinAD（CAD）在培養基中成功表達并檢測到表達產物，重組CAD表現出與合成CAD相似的抗菌活性；PR-FO是抗菌肽PRW4與fowlicidin-2雜合得到的一種新型α螺旋抗菌肽，Zhang等[33]將其在枯草芽孢桿菌WB800N中表達，可獲得純度為 90% 的重組PR-FO，對革蘭陰性菌（MIC為1- -4.48μg/mL 和革蘭陽性菌（MIC為 4～12.56μg/mL ）均表現出高抑制活性，且重組PR-FO在最大濃度 下溶血率僅為 10% ；Wang等[34]構建了兩個攜帶成熟PapA肽密碼子序列的載體，一個有His標簽，另一個沒有His標簽，將兩個質粒轉入枯草芽孢桿菌 WB800N ，經誘導，菌株成功分泌融合蛋白PapA1和PapA2，且均具有活性，說明標簽不會影響枯草芽孢桿菌表達異源蛋白。

枯草芽孢桿菌表達系統已被廣泛應用于各種化學品、醫藥產品、食品和酶的生產。然而，由于缺乏對代謝途徑和表達元件的了解，在該表達系統中優化異源蛋白的產生還存在各種障礙。

除了以上宿主，乳球菌（Lactococcus）、鏈霉菌（Streptomyces）和嗜鹽細菌（Halobacteriumsalinarum）等，也為抗菌肽領域的應用提供了更多原核表達系統的選擇。原核表達系統能夠在短時間內獲得基因表達產物，投入的成本低，且表達方法簡單，能夠表達的蛋白種類也比較多。但因為缺乏蛋白質翻譯后加工機制，所以有時會得到不具有生物活性的蛋白質，表達出的蛋白質也可能以包涵體形式出現，使純化更加困難。同時，大部分抗菌肽具有抗細菌的效果，所以利用真核表達系統來表達抗菌肽越來越受到重視。

3.2真核生物表達系統

3.2.1 酵母表達系統

常用的酵母表達系統有釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）和畢赤酵母（Pichiapastoris）。

釀酒酵母不產生毒素，被廣泛應用于食品生產、藥物蛋白生產等。與原核生物表達系統相比，釀酒酵母具有較為完整的翻譯后修飾和分泌能力，在異源表達目的蛋白時表現出極大的優勢。宋南等[35]為了研究人α-防御素5（human a -defensin5，HD5）在釀酒酵母中分泌表達的可行性，將重組載體pVT102U/Δa -HD5轉入釀酒酵母S78中，結果顯示，重組菌發酵上清液中檢測出表達產物HD5，且HD5對金黃色葡萄球菌的MIC為 10mg/mL ，對大腸埃希菌和沙門桿菌的MIC為 40mg/mL ；Xia等[36]將抗菌肽cecropinXJ基因克隆到Pyes2/Ct/a表達載體，并在釀酒酵母INVSc1中誘導重組蛋白表達 120h 后，重組cecropinXJ最大分泌量為 1141mg/L ，且分泌產物活性高，對大腸埃希菌ATCC25922的MIC為 而夏麗潔等[37]將cecropinXJ在大腸埃希菌中表達，目的蛋白的表達量僅為 10mg/L 。

與釀酒酵母相比，畢赤酵母系統在分泌蛋白的糖基化方面具有優勢，同時有很多高水平的組成型啟動子，可使其表達水平比釀酒酵母高數倍。宋南等[35]將人 a. -防御素5在釀酒酵母中表達，總表達量為69.62mg/L ，而王艾平等[38]將其在畢赤酵母中表達，成功獲得表達量約 120mg/L 的發酵上清；Basanta等[39]利用釀酒酵母和畢赤酵母分別表達了抗菌肽enterocinL50A和L50B，畢赤酵母表達的兩種抗菌肽活力分別是釀酒酵母的6～60倍。有研究表明，與大腸埃希菌相比，畢赤酵母表達出的抗菌肽也往往顯示出更高的抗菌活性。Hispidalin[4o是從冬瓜種子中分離出的一種新型抗菌肽，其首次在大腸埃希菌和畢赤酵母中成功表達，結果發現大腸埃希菌來源的重組hispidalin對所有供試菌株均無抗菌活性，而畢赤酵母來源的重組hispidalin（rhispidalin）對5種革蘭陰性和陽性致病菌均表現出廣譜抗菌活性，可以有效透化細胞質膜并破壞靶向細菌細胞的形態。此外，rhispidalin顯示出廣泛的熱穩定性和pH穩定性，以及小于 2% 的溶血活性。

酵母系統有助于提高抗菌肽的表達水平，在低成本表達外源蛋白方面表現出了相當大的優勢。

3.2.2 微藻表達系統

微藻表達系統具有少污染、可再生、大生物量等特性，是繼大腸埃希菌和酵母表達系統之后較有發展前景的表達系統。潘玉芳等[41]為了解抗菌肽在微藻中的表達，將抗菌肽Cath-1a表達質粒轉化三角褐指藻（Phaeodactylumtricornutum）并成功表達外源抗菌肽，且轉化子對遲緩愛德華菌（Edwardsiellatarda）有明顯抑菌效果；王慧[42]以萊茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）作為細胞工廠，重組表達雜合抗菌肽mytichitin-CB-hispidalin，經MIC和抑菌圈實驗顯示其對大腸埃希菌ATCC10305和腸炎沙門菌（Salmonellaenteritidis）ATCC10467均具有抑菌效果，MIC均為 20μg/mL 。微藻生長速度快、蛋白質含量高、氨基酸組成合理，有望成為異源表達系統的有效替代品。然而，目前尚未出現一個穩定的微藻表達系統。

真核表達系統不僅可以高效表達抗菌肽，而且表達的蛋白更接近于天然蛋白質，想要獲得天然基因表達的穩定抗菌肽，利用真核表達系統進行生產是一條理想的途徑。

3.3桿狀病毒表達系統

桿狀病毒表達系統（baculovirusexpressionsystem，BEVS）是一種成熟的外源蛋白表達平臺，已經在疫苗生產、基因治療和組織工程等領域得到了應用。Ye等[43]使用AnpeNPV桿狀病毒表達系統異源表達抗菌肽Anpe-MLP1，并對其進行純化和鑒定，結果顯示抗菌肽成功表達，重組Anpe-MLP1對溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、河流弧菌（Vibrio fluvialis）和副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）的MIC均為

5.4μg/mL ；具有強抗細菌活性的重組蛋白有時很難用細菌表達系統表達，Fukushima等[44]利用家蠶-桿狀病毒蛋白表達系統成功制備了人β-防御素（DEFB1、DEFB2和DEFB3）。結果表明，重組的DEFB2對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、硫桿菌（Thiobacillus）均有抗菌活性。但是，目前使用該系統表達的抗菌肽種類仍較少，這可能與桿狀病毒宿主范圍狹窄有關。不同抗菌肽表達系統的特點見表2。

在選擇用于生產抗菌肽的宿主系統時，應著重觀察幾個特征，如抗菌肽的分子量大小、細胞內定位和分泌情況。選擇大腸埃希菌作為宿主，生長速度快但翻譯能力弱，使得表達的抗菌肽穩定性較差，而酵母表達系統對蛋白質的正確加工和翻譯后修飾都要強于大腸埃希菌；當抗菌肽分子量小，選擇酵母表達系統則容易被內源性蛋白酶降解，而乳酸桿菌幾乎不分泌本源蛋白，能間接降低抗菌肽被內部分解的風險。所以選擇合適的表達宿主，對于高效表達抗菌肽至關重要。此外，有時直接表達抗菌肽，表達產物可能對宿主有害，進而影響蛋白質的高水平表達，此時可應用融合蛋白等策略對表達系統進行優化，適當克服此問題。

表2不同抗菌肽表達系統的特點

Tab.2Characteristics of different antimicrobial peptide expression systems

4產業化前景

抗菌肽是具有廣泛來源和廣譜抗微生物活性的獨特分子，耐藥微生物的出現和對抗生素使用的日益關注促進了抗菌肽的發展。抗菌肽可以相對獨立地發揮其抗菌作用，也可以與抗生素或其他因子協同作用，顯示出更高的活性。

如今抗菌肽在現代醫藥、畜牧業以及生物技術上均有廣闊的應用前景，在此基礎上，生物合成抗菌肽的意義更加重大，為抗菌肽的轉化和應用提供了新的發展平臺。抗菌肽的生物合成方法有酶解法、酶催化法、發酵法和基因工程法。酶解法主要是利用生物酶降解大分子蛋白來獲得小分子肽，但該方法產量低、污染大、產品質量不穩定，很難實現工業化；酶催化反應具有活性高、專一性強、綠色環保和產業化成本低廉等優勢，十分適合多肽序列的合成，但存在研發難度大、周期長等缺陷；發酵法是利用微生物代謝來獲得多肽，是生物合成方法的基礎，但目前為止，能夠通過特定微生物發酵獲得特定多肽的報道還很少；文章著重介紹的基因工程法是基于DNA重組技術，通過生物表達系統異源表達來控制多肽序列的生產，該方法具有操作程序簡單、表達定向強、生產成本低和安全環保等優勢，是目前獲取抗菌肽的最主要途徑之一，也為抗菌肽的開發應用提供了更有希望的契機。不過，雖然基因工程法是獲得大量抗菌肽最經濟的方法，但其同樣面臨無法表達非天然氨基酸等缺陷。

無論是在醫學、農業還是畜牧業，抗菌肽都有廣闊的發展前景，但要使這一愿景得以實現，仍有很多困難需要克服。第一，目前普遍認為，每克價格低于10美元的抗菌肽才可能商品化[45]，因此如何在不增加成本的基礎上提高抗菌肽的生產效率，是應用抗菌肽首要解決的問題；第二，目前應用的抗生素的MIC普遍在 0.03～8mg/mL 左右[46]，與之相比，大部分抗菌肽的MIC仍有很大提升空間；第三，在提高抗菌活性的同時，抗菌肽的毒副作用也需考慮，例如一種來自澳大利亞樹蛙的抗菌肽maculatin1.1，將其C端酰胺化后，表現出更高的抗革蘭陽性菌能力，但同時細胞毒性也增強[47]，限制其應用。最后，雖然抗菌肽的耐藥性發生率很低，但一些病原菌的防御機制仍會對抗菌肽產生殺傷作用，降低其活性。要想解決這些問題，抗菌肽活性與結構的關系研究就顯得尤為重要，從而有針對地對其進行優化和設計。目前，抗菌肽結構與活性之間的關系分析、抗菌肽的修飾、抗菌肽的人工合成、適合商業化生產體系的鑒定以及抗菌肽藥物的臨床研究等方面有大量的研究在進行著。相信在不久的將來，這些問題都將被克服，抗菌肽能更安全有效地被開發應用。

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